Os autores gostariam de agradecer ao Centro Laboratório Nacional Calicivirus for Disease Control and Prevention (CDC) para a dom espécie de alguns aspectos positivos padrão e controle de Nov, e Laboratórios da Escola de Saúde Pública da Universidade Johns Hopkins para a prestação dos reagentes.

1. As amostras de fezes <ol><li> As amostras de fezes devem ser armazenadas congeladas a preservar o RNA. Para fazer uma suspensão a 10% fecal, tomar aproximadamente 0,1 g de amostra de fezes descongeladas e completar a 1 ml com PBS. </li><li> Alíquota em 200 ul para evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Armazenar as alíquotas a -70 ° C. </li><li> Descongelar e centrifugar alíquotas a 4.000 g durante 10 min antes da utilização na extracção. </li></ol> 2. Preparação de partículas de sílica para extracção com guanidina e Sílica <ol><li> À temperatura ambiente, suspender 30 g de dióxido de silício e completar com dH2O até 250 mL. </li><li> Após 24 horas de sedimentação, remover 215 ml do sobrenadante por sucção. Adicionar de dH2O até 250 mL, e suspender o sedimento de sílica por agitação. </li><li> Após mais 24 horas, remover o sobrenadante por sucção, e ajustar o pH da suspensão de sílica para pH 2,0, utilizando ácido clorídrico (HCl). Alíquota da suspensão de sílica em bot vidroTLEs e autoclave. </li></ol> 3. Preparação de L6 tampão para extração com Guanidina e Sílica <ol><li> À temperatura ambiente, preparar L6 tampão por dissolução de 60 g de tiocianato de guanidínio (GuSCN) e 1,3 g de Triton X-100 em 50 mL de 0,1 M cloridrato de Tris, pH 6,4, e 11 mL de uma 0,2 M EDTA, a solução de pH 8,0. </li></ol> 4. Preparação do Tampão de L2 para extração com Guanidina e Sílica <ol><li> À temperatura ambiente, preparar tampão L2 por dissolução de 180 g de tiocianato de guanidínio (GuSCN) em 150 mL de 0,1 M cloridrato de Tris, pH 6,4. </li></ol> 5. Processo de Extracção <ol><li> Em cada uma extracção NoV amostra de fezes positiva, como controlo positivo, e água tratada com DEPC, como controle negativo, deve ser incluída. </li><li> Num tubo de centrífuga de micro-misturar o seguinte; 1 mL de tampão de L6, 20 uL de partículas de sílica, e adicionar 200 uL da suspensão de extracto de 10% fecal. Vortex brevemente e deixe à temperatura ambiente por 15 min. </li><li> Centrifugar a suspensão a 6000 g durante 10 s e lavar o sedimento com 1 ml de tampão de L2 duas vezes, seguido por duas lavagens com etanol a 70% e uma vez com acetona. Seca-se o sedimento em um bloco de aquecimento a 56 ° C durante 5 min. </li><li> Hidrato o RNA no pelete de sílica através da adição de 50 uL de RNase dH 2 0. Adicionar 1 mL de RNasin, mistura invertendo o tubo e incubar a 56 ° C durante 15 min. </li><li> Centrifugar durante 3 min a toda a velocidade, numa centrífuga de mesa, e recolher 40 uL do sobrenadante contendo o RNA. </li><li> Quantificar as amostras extraídas de RNA usando Nanodrop 2000 espectrofotômetro (Thermo científico). Em seguida, armazenar a -70 ° C até à sua utilização, até 6 meses. (Nota: A melhor maneira de preservar intacto o RNA total é convertê-la em cDNA). </li></ol> 6. Extração alternativa Usando o Comercial RNA Viral RNA QIAamp Kit As instruções completas são encontradas na prov livretoided com o kit QIAGEN. Resumidamente, o procedimento é como se segue: <ol><li> Pipete 560 de Tampão AVL contendo o RNA transportador para um tubo de 1,5 mL, e adicionar 140 uL da suspensão de fezes de 10%. Mix por pulso vórtex para 15 seg. Incubar a RT durante 10 min. </li><li> Adicionar 560 uL de etanol (96-100%) para a amostra e misturar por pulso vórtex durante 15 segundos, depois brevemente centrifugar. </li><li> Aplicar 630 uL desta solução a uma coluna de spin colocado num tubo de recolha de 2 mL. Centrifugar durante 1 min a 6.000 g; então colocar a coluna de spin em um tubo limpo mL 2. </li><li> Lavar a coluna contendo RNA ligados com 500 uL de tampão de AW1 e centrifugar a 6000 g durante 1 min. Coloque em uma coluna de tubo de coleta limpo 2 mL. </li><li> Lavar a coluna com 500 uL de tampão e centrifuga-se AW2 a toda a velocidade (20.000 g ou 14.000 rpm) durante 3 min. </li><li> Coluna de spin em lugar de 1,5 mL tubo limpo micro centrífuga, adicionar 40 água tratada com DEPC-tratada uL e eluir o RNA à velocidade máxima. Repita emce para um uL 80 final de ARN eluídas. </li><li> Quantificar as amostras extraídas de RNA usando Nanodrop 2000 espectrofotômetro (Thermo científico). Em seguida, armazenar a -70 ° C até à sua utilização, até 6 meses. (Nota: A melhor maneira de preservar intacto o RNA total é convertê-la em cDNA). </li></ol> 7. Detecção de norovírus no RNA extraídos por um passo de tempo real de RT-PCR com sondas específicas TaqMan Instrumento StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems). Metodologia <ol><li> Limpe e Limpe todas as superfícies de trabalho, pipetas, centrífugas e com RNase AFASTADO para eliminar qualquer contaminação RNase potencial. </li><li> Pipetar o GI e GII NoV triagem mestre mistura de acordo com a Tabela 1. Sondas Primers e Taqman estão listados na Tabela 2. </li><li> Alíquota de 10 uL de master mix adequado a cada tubo de reação. </li><li> Adicionar 5 uL de amostra desconhecida não diluídoRNA, água tratada com DEPC-tratada como controle negativo, ou GI respectivamente GII controlo positivo de RNA, aos poços de reacção correspondentes. Todas as amostras devem ser executados em duplicata. Os controlos positivos e padrões com concentração de 300 ug / uL e 500 ug / uL, respectivamente, foram fornecidas pelo Laboratório Nacional Calicivirus Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC). </li><li> Centrifugar a placa de reacção em 6000 g durante 10 seg. </li><li> Na tela de propriedades do experimento; definir e selecionar um tipo de experimento para a execução. Assegure-se os reagentes TaqMan são apresentados como o tipo de reagentes, e que leitura pré-PCR e amplificação são seleccionados. </li><li> Executar 15 uL reacções usando o perfil térmico na Tabela 3. </li><li> Analisar os resultados. </li></ol> 8. Genotipagem de NoV GI e GII Usando RT-PCR convencional e Sequenciamento (Não é mencionado no vídeo, já que é um método comum e amplamente utilizado.) Instrumento. Applied Biosystems StepOne e Sistemas de Tempo StepOnePlus reais PCR com o modelo Quantitec. Metodologia <ol><li> Antes de genotipagem, o genogrupo (GI ou GII) das amostras são determinados pelo rastreio de RT-PCR acima descrito. GI NoV RNA tem de ser amplificada com a mistura mestre genotipagem GI e GII NoV o RNA com a mistura GII mestre genotipagem. </li><li> Pipetar o GI e GII NoV genotipagem mestre mistura conforme a Tabela 4. Primers GI SKF / SKR e G2 SKF / SKR estão listados na Tabela 5. </li><li> UL alíquota 45 da mistura principal apropriado para tubos de reacção de 0,2 mL. </li><li> Adicionar 5 uL de DEPC tratada com água a cada tubo de controlo negativo, e 5 uL de um pré-filtrada, Nov (GI e / ou GII) RNA positivas para o tubo de reacção correspondente. </li><li> Correr 50 uL reacções usando o perfil térmico na Tabela 6. </li><li> Enviar produtos de PCR containing, pelo menos, 100 ng / uL da região da cápside amplificado para Macrogen Companhia para a purificação e sequenciação. (9700 Grande Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 e US $ 10 por amostra por seqüenciamento). </li></ol> 9. Os resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> A Figura 1 mostra resultados representativos do Taqman Um passo-RT-PCR, quando usada para RNA de ensaio extraídos a partir de amostras de fezes de crianças diarréicas. O ciclo threshold (Ct) para uma amostra positiva foi fixado em menor ou igual a 37 Ct para GI e GII 39 para Ct. O CT-valores para os controles positivos foram encontrados para ser inferior a 27 e 18 da junção ORF1-ORF2 para GI e GII, respectivamente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> A Figura 2 </strong&gt; mostra uma comparação head-to-head de valores de Ct no método de sílica de guanidina e kit QiAmp RNA viral. Dados de ambos os testes cair muito perto da linha de igualdade (declive = 1 e intercepta = 0). Isto é confirmado pela análise de regressão eo coeficiente de correlação. Todos os controles negativos foram avaliados e considerados 0 por ambos os métodos. <table border="1"><tbody><tr><td> Mix Master </td><td> Concentração final </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 2,875 </td></tr><tr><td> Quantitect RT-PCR Master Mix </td><td> 1x </td><td> 6,250 </td></tr><tr><td> RT Mix </td><td> 1x </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 mM Cog cartilha R </td><td> 1 uM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> 50 primers F mM Cog </td><td> 1mM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> 10 sonda Anel mM </td><td> 1 uM </td><td> 0.125/0.250 * </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10,00 </td></tr></tbody></table> * UL 0,250 de cada sonda foi utilizada para o teste GI, enquanto 0,125 L de cada sonda foi utilizada para o teste GII. Tabela 1. Qiagen Quantitect master mix para triagem GI e GII (Trujillo et al., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Geno-grupo </td><td> Usar </td><td> Sequência (5 &#39;para 3&#39;) </td></tr><tr><td> Cog 1R </td><td> GI </td><td> Cartilha </td><td> CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C </td></tr><tr><td> Cog 1F </td><td> GI </td><td> Cartilha </td><td> CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA </td></tr><tr><td> Cog 2R </td><td> GII </td><td> Cartilha </td><td> TCG ACG TCT CCA TCA TTC ACA </td></tr><tr><td> Cog 2F </td><td> GII </td><td> Cartilha </td><td> CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td></tr><tr><td> Anel 1A </td><td> GI </td><td> Probe </td><td> FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> 1B Anel </td><td> GI </td><td> Probe </td><td> FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring2-TP </td><td> GII </td><td> Probe </td><td> FAM-TGG GGC GAG GAT CGC AAT CT-BHQ-1 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Primer e oligonucleótidos sonda utilizada em tempo real RT-PCR quantitativo para genogrupos I, II (Kageyama et al.,2003) 8. <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp (° C) </td><td> Tempo (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 50 </td><td> 30:00 </td><td> síntese de cDNA </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart activação polimerase Taq </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95 </td><td> 00:15 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 01:00 </td><td> Ciclos 45x </td></tr></tbody></table> Tabela3. Perfil térmico para uma etapa Taqman em tempo real RT-PCR (Trujillo et al., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Mix Master </td><td> Concentração final </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 29,50 </td></tr><tr><td> 5X Qiagen RT-PCR Tampão </td><td> 1x </td><td> 10,00 </td></tr><tr><td> 10 mM mistura de dNTP </td><td> 0,4 mM </td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> Mix enzima </td><td></td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> 40 RNasin U / uL </td><td> 20 U / uL </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 uM SKF </td><td> 0,1 mM </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 SKR mM </td><td> 0,1 mM </td><td> 0,50 </td></tr></tbody><tbody><tr><td></td><td></td><td> 45,00 </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Qiagen One-Step RT-PCR master mix para genotipagem GI e GII. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Geno-grupo </td><td> Usar </td><td> Sequência (5 &#39;para 3&#39;) </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> GI </td><td> Cartilha </td><td> 5&#39;-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> GI </td><td> Cartilha </td><td> 5&#39;-CCA CAR ACC CCA TTR TAC A - &#39;3 </td></tr><tr><td> G2SKF </td><td> GII </td><td> Cartilha </td><td> 5&#39;-GGG CNT AGG GCG ATC GCA A - 3 </td></tr><tr><td> G2SKR</td><td> GII </td><td> Cartilha </td><td> 5&#39;-GCA CCR CCN TRH CCR TTR TA CAT-3 </td></tr></tbody></table> Primers Tabela 5. Utilizados para a amplificação da região C da Região da Cápside (Kojima et ai., 2002). 5 <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp (° C) </td><td> Tempo (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 30:00 </td><td> síntese de cDNA </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 96 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart activação polimerase Taq </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 94 </td><td> 00:030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 52 </td><td> 01:00 </td><td> Ciclos 40X </td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td> 00:30 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 10:00 </td><td> Recozimento </td></tr></tbody></table> Tabela 6. Perfil térmico para Taqman One-Step RT-PCR.

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	<li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy.">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li><li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago,+Chile.">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li><li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador,+an+urban+center+in+Northeast+Brazil.">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li><li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses.">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li><li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols.">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li><li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection,+quantification,+and+typing+of+norovirus.">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li><li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR.">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando o económico in-house método para isolar o ácido nucleico a partir de amostras de fezes, obtém-se resultados iguais como com o comercial QIAmp de RNA viral kit de Qiagen, e em conjunto com o TaqMan RT-PCR desenvolvido no nosso laboratório que pode detectar uma ampla gama de NoV genótipos pertencentes ao GI e GII genogrupo. Uma publicação recente da região C protocolo relataram taxas de genotipagem de 78% 6. Uma vez que a diversidade das cepas contemporâneas Nov tem vindo a aumentar nos anos an...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Isotiocianato de guanidina </td><td> Sigma-Adrich </td><td> G9277 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5941 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Sílica </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5631 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> BDH Chemicals </td><td> 14530 </td><td></td></tr><tr><td> Dietilpirocarbonato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5758 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp viral RNA Mini Kit (250) </td><td> QIAGEN </td><td> 52906 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 204443 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Um passo de RT-PCR Kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> Rnase Inibidor 2000 unidades </td><td> A.Biosystems </td><td> N808-0119 </td><td> 2000 unids / frasco </td></tr><tr><td> Antiaderentes Rnae-free tubos de microcentrífuga </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose 1000 </td><td> Invitrogen </td><td> 16550-100 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by taqman one-step rt-pcr

Os norovírus (NoVs) são a principal causa de surtos de gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo em seres humanos de todas as idades. Eles são importante causa de hospitalizações em crianças com impacto na saúde pública semelhante à de Rotavirus. NoVs são vírus de RNA de grande diversidade genética e há uma aparência contínua de novas estirpes. Cinco genogrupos são reconhecidos; GI e GII com seus genótipos e subtipos muitos sendo o mais importante para a infecção humana. No entanto, o diagnóstico de dois genótipos continua a ser problemática, retardando o diagnóstico e tratamento. 1, 2, 3 Para extração de RNA a partir de amostras de fezes, o método mais comumente usado é o QIAmp kit RNA Viral comercial da Qiagen. Este método combina as propriedades de ligação de uma membrana de gel de sílica, buffers que as RNases de controlo e proporcionam ligação óptimas de ARN para a coluna, juntamente com a velocidade de MicroSpin. Este método é simples, rápido e confiável e é carrIED em alguns passos que são detalhados na descrição fornecida pelo fabricante. O norovírus é apenas a segunda rotavírus como a causa mais comum de diarréia. Diagnóstico norovírus devem estar disponíveis em todos os estudos sobre a patogênese da diarréia, bem como em surtos ou casos de diarréia individuais. Actualmente no entanto diagnóstico norovírus é restrita a poucos centros devido à falta de métodos simples de diagnóstico. Este diagnóstico e tratamento atrasos 1, 2, 3. Além disso, devido aos custos de transporte e regulamentado de buffers corrosivos dentro e entre países o uso desses kits manufaturados coloca problemas logísticos. Como resultado, neste protocolo descrevemos uma alternativa, económica, método in-house que se baseia na lança inicial et al. Método 4 que utiliza as propriedades de ligação de ácidos nucleicos de partículas de sílica, juntamente com as propriedades anti-nuclease de tiocianato de guanidínio . <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Para a detecção e genogrouping (GI e GII) de isolados NoVs de amostras de fezes, vários protocolos de RT-PCR utilizando diferentes alvos têm sido desenvolvidos. O consenso é que uma RT-PCR utilizando TaqMan química seria a melhor técnica molecular para o diagnóstico, porque combina alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade com alto rendimento e facilidade de utilização. Descrevemos aqui um ensaio de segmentação da estrutura de leitura aberta 1 (ORF1) região de junção-ORF2; a região mais conservada do genoma NoV e, portanto, mais adequado para o diagnóstico. Para a análise genética mais uma RT-PCR convencional que tem como alvo o altamente variável N-terminal a partir de casca-a principal proteína da cápside (Região C) utilizando iniciadores originalmente descritos por Kojima et ai. 5 é detalhado. A sequenciação do produto de PCR a partir do PCR convencional permite a diferenciação de genótipos pertencentes ao GI e genogrupos GII.

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Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children&#039;s Stools By Taqman One-step RT-PCR

Um Um passo-ensaio de RT-PCR para a detecção e identificação genogrupo de isolados Norovirus a partir de fezes de crianças, que utiliza iniciadores e sondas de TaqMan específicos para o quadro de leitura aberta 1 (ORF1)-ORF2 região de junção, a região mais conservada do genoma norovírus é descrito. A não-comercial, custo-efetivo método de extração de RNA é detalhado.

Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

17.1K visualizações.  Universidad Peruana Cayetano Heredia. Um Um passo-ensaio de RT-PCR para a detecção e identificação genogrupo de isolados Norovirus a partir de fezes de crianças, que utiliza iniciadores e sondas de TaqMan específicos para o quadro de leitura aberta 1 (ORF1)-ORF2 região de junção, a região mais conservada do genoma norovírus é descrito. A não-comercial, custo-efetivo método de extração de RNA é detalhado.