Gostaríamos de agradecer tanto Missão Connect e da Fundação Gillson-Longenbaugh para fornecer os fundos para este projeto. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Catherine Ambrose pelos seus conselhos, críticas e uso de seu equipamento DXA. Finalmente, gostaríamos de agradecer ao Dr. Kaori Ono, Departamento de Biologia Integrativa e Farmacologia, pelas sugestões na análise DXA osso fêmur.

1. Rato modelo transecção da coluna vertebral <ol><li> Adultos, machos, C57BL6 ratos (aproximadamente 20-25 g) são anestesiados com uma combinação de quetamina (200 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados em um Institucionais, suite IACUC-aprovado cirúrgica em condições estéreis. </li><li> Uma vez anestesiados profundamente, a pele das costas é cortado usando cortadores elétricos. A parte de trás raspada é primeiro limpo com uma solução de iodo seguida de etanol 70%. </li><li> Antes da incisão inicial, a área das costas a ser incisada é o primeiro infiltrado com um anestésico local (Marcaine) a uma concentração de (0,25%, &lt;1ml/kg) para minimizar a dor pós-operatória. </li><li> Com uma tesoura pequena, uma pequena abertura é feita na pele em torno da área de L2. Esta abertura é ampliada com o mesmo conjunto de tesouras, estendendo-se longitudinalmente para a área de T2. As bordas da pele são, então, realizada à parte através do uso de grampos bulldog. </li><li> Micro-tesoura são então usadospara limpar o tecido muscular a partir da lâmina dorsal espinhal a nível torácico 8 (T8). T8 pode ser identificado como descrito no Kuh e Wrathall (1998) 10. Resumidamente, T13 pode ser identificado pelo seu processo espinhoso dorsal. Usando um par de fórceps # 5 Dumont, a última costela pode ser palpada / identificadas e contadas de volta para T8. Uma vez liberado, Rongeurs ossos são usados ​​para executar uma laminectomia dorsal em T8. </li><li> Lesão Transecção completa da Coluna Vertebral: Uma vez que a medula espinhal é exposta em T8, um conjunto adicional de micro-tesoura esterilizada são usados ​​para cortar a medula espinhal no plano perpendicular ao eixo longitudinal do cabo sob um microscópio cirúrgico. Nós usamos uma pinça # 5 Dumont para levantar delicadamente um pólo da medula espinhal para confirmar a integridade da lesão. </li><li> Após transecção da coluna vertebral, um pequeno pedaço de gelfoam estéril, embebida em solução salina estéril (0,9%) é cuidadosamente colocado na cavidade lesão para promover a hemostasia. </li><li> Uma peça adicional de gelfoam é então colocado sobre o spin expostoscabo de al. A pele é então fechada com estéril, em aço inoxidável grampos cirúrgicos. Temas são, então, voltou para suas gaiolas de casa, colocado em uma toalha de papel para evitar a aspiração do material de cama e aquecido com uma almofada de aquecimento por um período de aproximadamente 12 horas. Assuntos também são fornecidos com pacotes de hidrogel (ClearH2O) e grãos de ração no chão de suas jaulas durante a recuperação precoce. Assuntos feridos são capazes de acesso a alimentos / água em suas gaiolas de casa uma vez recuperado da anestesia. </li><li> Todos os indivíduos feridos recebem duas vezes por dia evacuações bexiga manual (em aproximadamente 12 horas), utilizando uma modificação do método manual de Crede para a duração do estudo (40 dias). </li><li> Camundongos feridos também são fornecidos com duas vezes por dia injeções intraperitoneal de 0,9% por três dias (0,5 cc) para ajudar a manter a hidratação, e duas vezes injeções diárias da buprenorfina opiáceos (0,05 mg / kg) para controlar a dor pós-operatória por um período de 5 dias. Se os animais apresentam sinais of dor após o período inicial de cinco dias, eles receberiam adicional buprenorfina (0,05 mg / kg) por dia até que os sinais de dor (mobilidade reduzida, estatura arqueada, a incapacidade de vocalização noivo, quando manuseados) ter resolvido. </li></ol> 2. Avaliação longitudinal da densidade óssea utilizando o IVIS Lumina XR sobre o mesmo grupo de subaracnóidea-transeccionados ratos <ol><li> Início no dia 10 pós-SCI e continuando em intervalos de 10 dias até o dia 40, foram avaliados fêmures direito e esquerdo e tíbias na vida, os indivíduos anestesiados (transecção SCI e ileso controles pareados por idade). </li><li> No dia da varredura, os indivíduos foram transferidos em suas gaiolas de casa da área da Instituição Biotério para a sala em que a Caliper IVIS Lumina XR está alojado. Todos os indivíduos são, então, anestesiados com o coquetel de cetamina / xilazina mesmo utilizado anteriormente na entrega de SCI. Este cocktail garante um estado de anestesia por um período de 1 a 1,5 horas; suficiente para a duração do espiaprocedimento ing. </li><li> O investigador inicializa o dispositivo Lumina XR e permite que a câmera interna para atingir a temperatura de funcionamento (-90 ° C) (~ 10 minutos). </li><li> Uma vez anestesiados, o sujeito (transecção ou controle) é suavemente colocado na plataforma dos animais na XR Lumina. Uma lente de alta ampliação é inserido no dispositivo para permitir que o foco de ambos fêmur e da tíbia regiões (Campo de visão 2.4X2.4cm com ampliação alta lente). Se o assunto for indevidamente posicionado fora do campo de visão, a porta é aberta eo tema re-posicionado até a perna esquerda ou traseira direita está centrado (Veja Figura 2a para a colocação adequada do membro posterior). </li><li> Uma vez posicionada corretamente, a função de raios-X pode ser executado. Fazer uma seleção a partir da Energia lista drop-down adequado para Animal (sujeito vivo, 35 Kv 100uA, filtrado X-Rays) </li><li> Uma vez que o animal está na posição correta, ativar o recurso de raios-X por X-Ray check-marcação napainel de controle. Adquirir a imagem de raios-X. Certifique-se que o fêmur ea tíbia inteira são visíveis (ver Figura 2b). Dados de imagem raw é salvo automaticamente para o disco rígido. Representante. TIFF arquivos também são salvos. O mouse é, então, retornou à sua gaiola e permitiu recuperar sob observação investigador. O processo é então repetido com o mouse em seguida. Nota: O software exibe imagem viva transformou radiografias por padrão. Para mostrar-prima radiografias, remover a marca de seleção ao lado de X-Ray Absorção na Correcções / As ferramentas de filtragem. Quando os dados de raios-X foi corrigido para a absorção, você pode avaliar a densidade óssea relativa, comparando a intensidade de sinal de ROIs de medição. A intensidade aumenta com o ROI densidade do tecido aumentando. </li></ol> 3. Análise de imagem de raios-X IVIS scans <ol><li> Abra o software, clicando duas vezes no ícone da imagem Living. </li><li> Carregar uma imagem de raios-X, clicando no <strong&gt; botão Browse. Na caixa de diálogo que aparece, selecione a pasta de interesse e clique em OK. O navegador exibe a imagem viva de dados selecionado, juntamente com o ID do usuário, informações do rótulo e informações de configuração da câmera. Para abrir os dados, faça o seguinte: Dê um duplo clique na linha de dados, direito do mouse no nome de dados e selecione Carregar no menu de atalho, selecione a linha de dados e clique em Load, ou duplo clique na miniatura. Paleta de imagem e ferramentas são exibidos. Dados abertos é destaque em verde no navegador. </li><li> Clique em Ferramentas ROI na Paleta Tool. Nas ferramentas ROI, selecione ROI Medição do tipo drop-down list. Para carregar o ROI 3 é usado neste experimento, clique no ícone quadrado e carregar 3 quadrados. </li><li> Usando uma régua, medir o comprimento do fêmur. Ajustar o comprimento de dois dos quadrados a serem º 08/01 do comprimento fêmur total. Ajustar a largura dessas duas praças de ser 1/24th o comprimento do fêmur total. Com a sua régua, meça º 08/01 da distância entre a extremidade proximal do fêmur, e situar a praça para que seja centrado no fêmur. Situar o segundo quadrado de modo que ela se encontra 1/4th do comprimento fêmur total da extremidade distal do fêmur (Fig. 3). Estes ROI pode ser usado para medir as regiões do fêmur proximal e distal. </li><li> Usando a régua, medir o comprimento da tíbia. Ajustar o comprimento do terceiro quadrado a serem º 08/01 do comprimento total da tíbia. Ajustar a largura de 1 / 30 º do comprimento total da tíbia. Situar o quadrado de modo que é centrado e 08/01 º o comprimento total da distância a partir do final da tíbia proximal da tíbia (ver Figura 3). </li><li> Clique no ícone Medida (um lápis e régua). As medições de intensidade ROI aparecem na imagem de raios-X eo ROI tabela medições aparece. Export esta tabela to seu local desejado como um arquivo csv.. Isto permitirá que você para abrir a tabela usando o Excel. </li><li> Repita este procedimento com todas as suas imagens salvas. </li><li> Consolidar todos os seus dados para uma folha excel. Significância estatística foi determinada através de teste t de Student, utilizando o Microsoft Excel ou 11,0 SigmaPlot software (Software Systat). </li></ol> 4. Post-mortem análise da densidade óssea: <ol><li> Após a aquisição da final longitudinal X-ray scan dentro do Lumina IVIS XR, os ratos são posteriormente profundamente anestesiados com Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). Uma vez que a anestesia profunda foi alcançado, os ratos são transcardially perfundidos com gelado-frio tampão fosfato com heparain (40 mg / litro) para desangrar. </li><li> Uma vez que sangrar, impostos ambos fêmures. Preste atenção especial para remover o máximo possível de tecido mole, por isso tem sido demonstrado que afetam medições de densidade 11. Enrole os fêmures com gaze embebida de água e armazenar em-20C até que esteja pronto para analisá-los. </li></ol> 5. DXA Análise usando um densitômetro Hologic QDR 4000 óssea <ol><li> Gaze encharcada de descongelar o fémur ea transferência para conjunto densitômetro ósseo. </li><li> Calibrar o aparelho de acordo com o protocolo do fabricante; garantir que os valores BMC e BMD estar dentro dos limites aceitáveis. </li><li> Coloque um colimador de bronze na máquina. Isso permite ao usuário limitar o tamanho eo ângulo do feixe de raios X para se concentrar em um alvo específico. </li><li> Submergir o fêmur descongelado em uma placa de Petri com água (côndilos para a esquerda, com o fêmur paralelamente à cama), e posicioná-lo logo à direita do laser. </li><li> Digite uma Biografia (um título descritivo que inclui informações de identificação dos animais, tratamento, etc) para o fêmur você está prestes a digitalização. </li><li> Digite Digitalização a partir do Menu de Seleções, em seguida, selecione regionalização oi-res. Indicam os parâmetros de digitalização: A varredura da região de 2 x 0,7489 polegadas, com espaçamento de linha 0,01 polegadas e resolução de 0,00499 ponto polegadas. Nota: Monitorar o scan enquanto ele está em andamento. À medida que o feixe de raios X raster scans da amostra, monitor para garantir que não há água suficiente na câmara para cobrir completamente a amostra de osso. </li><li> Analisar entrar no menu de seleção de análise. Siga as instruções para destacar o fêmur inteiro como um ROI. A página do relatório virá com o BMC calculado (gramas) e DMO (gms / cm 2). </li><li> Repita essas etapas para analisar os fêmures restantes. </li><li> Consolidar todos os seus dados para uma folha excel e análise estatística (t-test). </li></ol> 6. Resultados representativos: A perda de densidade relativa de um osso da tíbia e do fêmur do rato após a lesão medular quando comparado com camundongos ingênuos é detectável usando o método acima. Há uma diminuição significativa detectáveis ​​na densidade óssea apósapenas 10 dias (12%, p &lt;0,0005), com até 15% perda de densidade óssea em 40 dias (p &lt;0,0005, Figura 4). Perda de densidade óssea no fêmur foi observada em 40 dias após a lesão (diminuição de 7%, p &lt;0,05, Figura 5). Estes resultados fornecem evidências para o uso de recursos não-invasivos de imagem de raios-x para a observação longitudinal de mudança de densidade óssea após lesão medular. A fim de comparar a eficácia deste método para o que está atualmente disponível; analisamos os fêmures excisadas desses ratos 40 dias após a lesão usando DXA imagem. Uma representação da saída de dados pode ser visto na Figura 6. Descobrimos que houve uma significativa perda de conteúdo mineral ósseo nos ratos SCI quando comparado com naïve (12% de redução, p &lt;0,05, Figura 7). Densidade mineral óssea não se alterou significativamente, mas seguiu uma tendência semelhante (Figura 8). Estes resultados são semelhantes aos encontrados na literatura; Picard et al observaram uma diminuição de 13,5% (p &lt;0,001) no BMC, mas não decr significativafacilidade em BMD (Picard 2008). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig1.jpg" /> Figura 1. Timeline Experimental. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig2.jpg" /> Figura 2 orientação Representante do membro posterior esquerdo:. Uma fotografia) e b) x-ray. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig3.jpg" /> Figura 3. ROI dimensões e orientação nas regiões do fêmur proximal e tíbia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig4.jpg" /> Figura 4. Perda de densidade óssea após a LM na tíbia proximal 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão (n = 5) em comparação com pareados por idade naives (n = 5). Barras de erro representam SEM; ** p &lt;0,005, *** p &lt;0,0005. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig5.jpg" /> <strong&gt; Figura 5. óssea perda de densidade após a LM no fêmur proximal 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão (n = 5) em comparação com pareados por idade naives (n = 5). Barras de erro representam SEM; * p &lt;0,05. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig6.jpg" /> Figura 6. Perda de densidade óssea após a LM no fêmur distal dias 10, 20, 30 e 40 após a lesão (n = 5) em comparação com controles pareados por idade naïve (n = 5). Barras de erro representam SEM; * p &lt;0,01-0,05; ** p &lt;0,001-0,01; *** p &lt;0,0001-,001; **** p &lt;0,0001. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig7.jpg" /> Figura 7. Imagem representativa de dados DXA mostrando BMC e saída de BMD. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig8.jpg" /> Figura 8. DXA análise do conteúdo mineral ósseo (gramas) nos fêmures de camundongos SCI 40 dias pós-lesão (n = 5) versus pareados por idade naives (n = 5).Barras de erro representam SEM; * p &lt;0,05. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3246/3246fig9.jpg" /> Figura 9. DXA análise da densidade mineral óssea (mg / cm 2) nos fêmures de camundongos SCI 40 dias após a lesão (n = 5) versus pareados por idade naives (n = 5). Barras de erro representam SEM, sem diferença significativa.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este estudo apresenta um romance, método não-invasivo para avaliar as alterações densidade dentro dos ossos individual (tíbias e fêmures) longitudinalmente, dentro de uma única coorte de ratos, usando a Caliper IVIS Lumina XR sistema de imagem. SCI produziu uma diminuição na densidade óssea em ambos os fêmures e tíbias quando estudados dentro de uma única coorte de subaracnóidea-transeccionados ratos durante um período de ensaio de 40 dias em comparação com pareados por idade, sem ferimentos ratos, controle. Nossos resultados no fêmur foram confirmados, post-mortem, através do uso de DXA, sugerindo que a aplicação dos instrumentos Caliper IVIS Lumina XR pode servir como uma ferramenta de medição sensíveis para avaliar os efeitos a longo prazo e progressiva da SCI sobre a perda óssea . Um benefício potencial para os investigadores usando este sistema é a capacidade de acompanhar o desenvolvimento longitudinal de alterações patológicas nos ossos dos membros posteriores dos animais após uma lesão medular. A capacidade de avaliar uma única coorte mais longos períodos de tempo fornece strong vantagens para o pesquisador em termos de: 1) os custos associados com a compra de animais e cuidados de longa duração. Em vez de um estudo que requerem um grande número de animais que precisam ser sacrificados em momentos específicos, a fim de avaliar o tempo-dependente mudanças, esses resultados patológicos podem ser seguidas dentro do mesmo grupo ao longo desse mesmo período de tempo, 2) variabilidade: além de comparação com grupos de controle, os resultados gerados dentro da única coorte de indivíduos feridos podem ser avaliados e comparados entre os pontos de tempo para os mesmos animais ao longo da extensão do estudo, uma vez mais, reduzindo tanto a variabilidade intra-animal, bem como a necessidade de maiores coortes de sujeitos experimentais. Enquanto a Caliper IVIS Lumina XR nos forneceu informações importantes longitudinal sobre o desenvolvimento de osteoporose induzida por SCI, há limitações que devem ser considerados: 1) enquanto esta plataforma nos permitiu gerar alta resolução de raios-X datum dos ossos dos membros posteriores de ratos após uma lesão medular, a sua utilidade pode ser limitada a pequenos roedores, como ratos. A altura máxima permitida assunto dentro da XR Lumina é de 2,8 cm. Qualquer coisa acima desse nível não pode com sucesso ser fotografada usando o componente de raios-X da XR Lumina. Em nossas mãos, isso tem impedido a nossa capacidade de estudar ratos na grama de peso 200-250. Embora possa ser possível a ratos imagem sob essa faixa de peso ou outros roedores, como hamsters ou gerbos, isso vai exigir testes adicionais pelo PI. 2) a orientação conjunta. É fundamental que o investigador cuidadosamente organizar os membros em uma orientação facilmente reproduzível que irá permitir a comparação de sucesso entre as sessões de imagem. Padronização da colocação dos membros permitirá que o investigador para gerar e aplicar padronizados ROI é que podem ser salvas e aplicadas em ambos os assuntos e tempo. No geral, acreditamos que o IVIS Lumina XR fornece uma excelente plataforma com a qual a modeloo desenvolvimento da SCI-dependente osteoporose em ratos. A possibilidade de estudar a perda óssea longitudinal dentro da coorte do mouse mesmo nos permitirá: 1) compreender melhor a natureza temporal da perda óssea e após a desmineralização SCI, 2) determinar se essas mudanças estabilizar ao longo do tempo, 3) explorar, com a disponibilidade de ambos os transgênicos e as linhas de mouse null, a possibilidade de estudar os mecanismos moleculares subjacentes a estas alterações patológicas de forma reducionista, e 4), possivelmente a vantagem mais importante, começar a testar novas intervenções destinadas a prevenir tanto o desenvolvimento da osteoporose nos estágios iniciais de lesão, ou, para inverter tais alterações uma vez que a osteoporose já desenvolveu. Finalmente, a XR Lumina, além de proporcionar excelente potencial de imagem de raios-X, também pode ser usado para estudar ambos os sinais bioluminescente e fluorescente em animais vivos. Pode-se facilmente imaginar incorporando as outras modalidades oferecidas dentro deste sistema de olhar para uma multitude de fatores que determinam a dinâmica do osso mecanicamente após uma lesão medular ou outra doença qualquer processo que resulta em osteoporose.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Butler Schein animal Saúde </td><td> 001848 </td><td></td></tr><tr><td> Ketathesia (Ketamina Cloridrato) </td><td> Butler Schein animal Saúde </td><td> 023061 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Butler Schein animal Saúde </td><td> 037849 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivicaine </td><td> Butler Schein animal Saúde </td><td> 021801 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam; 7MM </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0085178 </td><td> Para promover hemostasia durante cirurgia </td></tr><tr><td> IVIS Lumina XR </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 135400 </td><td></td></tr><tr><td> ZFOV, 2,5 cm de campo vista da lente </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 127285 </td><td> Absolutamente necessário paragerar alta ampliação de raios-X imagens dos ossos estrutura </td></tr><tr><td> QDR óssea Densitômetro </td><td> Hologic </td><td></td><td> Modelo utilizado já não na produção </td></tr></tbody></table>

longitudinal evaluation of mouse hind limb bone loss after spinal cord injury using novel, in vivo, methodology

Lesão da medula espinal (SCI) é muitas vezes acompanhada de osteoporose nas regiões sublesional da pelve e membros inferiores, levando a uma maior freqüência de fraturas 1. À medida que essas fraturas ocorrem frequentemente em regiões que perderam função sensorial normal, o paciente está em um risco maior de patologias fratura-dependente, incluindo a morte. SCI-dependente perda na densidade mineral óssea (DMO, gramas / cm 2) e conteúdo mineral ósseo (BMC, gramas) tem sido atribuída ao desuso mecânicos 2, 3 neuronal aberrante sinalização e alterações hormonais 4. O uso de modelos de roedores da SCI osteoporose induzida pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de osteoporose após uma lesão medular, bem como um ambiente de teste para a geração de novas terapias 5-7 (e revisto em 8). Modelos de mouse da SCI são de grande interesse uma vez que permitem uma abordagem reducionista ao mecanismo de ba-avaliação sed através do uso de camundongos nulos e transgênicos. Embora tais modelos têm fornecido dados importantes, ainda há uma necessidade de minimamente invasiva, métodos fiáveis, reprodutíveis e quantificáveis ​​na determinação da extensão da perda óssea após uma lesão medular, particularmente ao longo do tempo e dentro do mesmo grupo de animais de experimentação, para melhorar o diagnóstico , métodos de tratamento e / ou prevenção de osteoporose induzida por SCI. Um método ideal para medir a densidade óssea em roedores permitiria várias exposições, seqüencial (ao longo do tempo) para baixo os níveis de radiação de raios X. Este estudo descreve o uso de um scanner de todo o novo animal, o IVIS Lumina XR (Caliper Instruments) que podem ser usados ​​para fornecer baixa energia (miligray 1-3 (mGy)) de alta resolução e de alta ampliação radiografias dos ossos do mouse hind membro ao longo do tempo após uma lesão medular. Perda de densidade óssea significativa foi vista no tíbias de ratos por 10 dias pós-espinhal transecção quando comparado ao não lesionado, controle pareados por idade (naïve) ratos (13% de redução, p &lt;0,0005). Perda de densidade óssea no fêmur distal também foi detectável por 10 dias pós-SCI, enquanto que uma perda de densidade no fêmur proximal não foi detectado até 40 dias após a lesão (diminuição de 7%, p &lt;0,05). SCI-dependente perda de densidade do fêmur do rato foi confirmado post-mortem através do uso de Dual-energy X-ray Absorciometria (DXA), &quot;padrão ouro&quot; a corrente para medições de densidade óssea. Nós detectamos uma perda de 12% do BMC nos fêmures de ratos aos 40 dias pós-SCI usando o IVIS Lumina XR. Isso se compara favoravelmente com uma perda BMC anteriormente relatados de 13,5% por Picard e colegas que usaram a análise DXA no mouse fêmures post-mortem 30 dias pós-SCI 9. Nossos resultados sugerem que o IVIS Lumina XR fornece um romance, o método high-resolution/high-magnification para a realização de longo prazo, medidas longitudinal da densidade óssea em membros posteriores do rato após uma lesão medular.

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Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Um exame longitudinal de perda óssea nos fêmures e tíbias de ratos adultos foi realizada após uma lesão da medula espinhal usando seqüencial de baixa dose de raios-X scans. Tibia perda óssea foi detectada ao longo do estudo, enquanto a perda óssea no fêmur não foi detectado até 40 dias após a lesão.

Avaliação longitudinal do rato Perda Hind Limb óssea após lesão medular usando Novel, In vivo Metodologia,

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

longitudinal-evaluation-mouse-hind-limb-bone-loss-after-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

15.0K visualizações.  University of Texas Health Science Center at Houston. Um exame longitudinal de perda óssea nos fêmures e tíbias de ratos adultos foi realizada após uma lesão da medula espinhal usando seqüencial de baixa dose de raios-X scans. Tibia perda óssea foi detectada ao longo do estudo, enquanto a perda óssea no fêmur não foi detectado até 40 dias após a lesão.

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Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory testing in rat SCI models is needed. However, until recently, no single testing approach had been validated for SCI so that standardized methods have not been implemented across labs. Additionally, available testing methods could not be implemented acutely or when severe motor impairments existed, preventing studies of the development of SCI-induced allodynia3. Here we present two validated sensory testing methods using von Frey Hair (VFH) monofilaments which quantify changes in tactile sensory thresholds after SCI4-5. One test is the well-established Up-Down test which demonstrates high sensitivity and specificity across different SCI severities when tested chronically5. The other test is a newly-developed dorsal VFH test that can be applied acutely after SCI when allodynia develops, prior to motor recovery4-5. Each VFH monofilament applies a calibrated force when touched to the skin of the hind paw until it bends. In the up-down method, alternating VFHs of higher or lower forces are used on the plantar L5 dermatome to delineate flexor withdrawal thresholds. Successively higher forces are applied until withdrawal occurs then lower force VFHs are used until withdrawal ceases. The tactile threshold reflects the force required to elicit withdrawal in 50% of the stimuli. For the new test, each VFH is applied to the dorsal L5 dermatome of the paw while the rat is supported by the examiner. The VFH stimulation occurs in ascending order of force until at least 2 of 3 applications at a given force produces paw withdrawal. Tactile sensory threshold is the lowest force to elicit withdrawal 66% of the time. Acclimation, testing and scoring procedures are described. Aberrant trials that require a retest and typical trials are defined. Animal use was approved by Ohio State University Animal Care and Use Committee.

We describe two tactile sensory testing methods for acute or chronic periods of spinal cord injury in rats. These validated procedures can detect the development and maintenance of allodynia-like sensations.

Aguda e crônica teste sensorial tátil após a lesão medular em ratos

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Medicina

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Use of genetically modified mice enhances our understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders such as a spinal cord injury (SCI). Freehand manual control used to produce a laceration model of SCI creates inconsistent injuries often associated with a crush or contusion component and, therefore, a novel technique was developed. Our model of cervical laceration SCI has resolved inherent difficulties with the freehand method by incorporating 1) cervical vertebral stabilization by vertebral facet fixation, 2) enhanced spinal cord exposure, and 3) creation of a reproducible laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm in depth without associated contusion. Compared to the standard methods of creating a SCI laceration such as freehand use of a scalpel or scissors, our method has produced a consistent lesion. This method is useful for studies on axonal regeneration of corticospinal, rubrospinal, and dorsal ascending tracts.

A novel technique to create a reproducible in vivo model of cervical spinal cord laceration injury in the mouse is described. This technique is based on spine stabilization by fixation of the cervical facets and laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm.

Controlada por laceração do colo do útero em camundongos

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is described to obtain a consistent model of severe SCI. Use of a stereotactic frame and computer controlled impactor allows for creation of reproducible injury. Hypothermia and urinary tract infection pose significant challenges in the post-operative period. Careful monitoring of animals with daily weight recording and bladder expression allows for early detection of post-operative complications. The functional results of this contusion model are equivalent to transection models. The contusion model can be utilized to evaluate the efficacy of both neuroprotective and neuroregenerative approaches.

A contusion model of severe spinal cord injury is described. Detailed pre-operative, operative and post-operative steps are described to obtain a consistent model.

Um modelo de contusão grave de lesão medular em ratos

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing reliable cervical SCI is difficult due to lack of satisfactory methods of vertebral stabilization. The conventional method to stabilize the spine is to suspend the rostral and caudal cervical spine via clamps attached to cervical spinous processes. &#160;However, this method of stabilization fails to prevent tissue yielding during the contusion as the cervical spinal processes are too short to be effectively secured by the clamps (Figure 1). &#160;Here we introduce a new method to completely stabilize the cervical vertebra at the same level of the impact injury. &#160;This method effectively minimizes movement of the spinal column at the site of impact, which greatly improves the production of consistent SCIs. &#160;We provide visual description of the equipment (Figure 2-4), methods, and a step-by-step protocol for the stabilization of the cervical 5 vertebra (C5) of adult rats, to perform laminectomy (Figure 5) and produce a contusive SCI thereafter. &#160;Although we only demonstrate a cervical hemi-contusion using the NYU/MASCIS impactor device, this vertebral stabilization technique can be applied to other regions of the spinal cord, or be adapted to other SCI devices. &#160;Improving spinal cord exposure and fixation through vertebral stabilization may be valuable for producing consistent and reliable injuries to the spinal cord. &#160;This vertebral stabilization method can also be used for stereotactic injections of cells and tracers, and for imaging using two-photon microscopy in various neurobiological studies.

Vertebral stabilization is necessary for minimizing variability, and for producing consistent experimental spinal cord injuries.&#160; Using a customized stabilizing apparatus in conjunction with the NYU/MASCIS impactor device, we have demonstrated here the proper equipment and procedure for generating reproducible hemi-contusive cervical (C5) spinal cord injuries in adult rats.

Um método de estabilização Novel Vertebral para a Produção de contusão Lesão Medular

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment (RMCA) in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination is disrupted by spinal cord injury (SCI), control of respiratory muscles innervated below the injury level is compromised1,2 leading to respiratory muscle dysfunction and pulmonary complications. These conditions are among the leading causes of death in patients with SCI3. Standard pulmonary function tests that assess respiratory motor function include spirometrical and maximum airway pressure outcomes: Forced Vital Capacity (FVC), Forced Expiratory Volume in one second (FEV1), Maximal Inspiratory Pressure (PImax) and Maximal Expiratory Pressure (PEmax)4,5. These values provide indirect measurements of respiratory muscle performance6. In clinical practice and research, a surface electromyography (sEMG) recorded from respiratory muscles can be used to assess respiratory motor function and help to diagnose neuromuscular pathology. However, variability in the sEMG amplitude inhibits efforts to develop objective and direct measures of respiratory motor function6. Based on a multi-muscle sEMG approach to characterize motor control of limb muscles7, known as the voluntary response index (VRI)8, we developed an analytical tool to characterize respiratory motor control directly from sEMG data recorded from multiple respiratory muscles during the voluntary respiratory tasks. We have termed this the Respiratory Motor Control Assessment (RMCA)9. This vector analysis method quantifies the amount and distribution of activity across muscles and presents it in the form of an index that relates the degree to which sEMG output within a test-subject resembles that from a group of healthy (non-injured) controls. The resulting index value has been shown to have high face validity, sensitivity and specificity9-11. We showed previously9 that the RMCA outcomes significantly correlate with levels of SCI and pulmonary function measures. We are presenting here the method to quantitatively compare post-spinal cord injury respiratory multi-muscle activation patterns to those of healthy individuals.

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment RMCA in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

The purpose of this publication is to present our original work on a multi-muscle surface electromyographic approach to quantitatively characterize respiratory muscle activation patterns in individuals with chronic spinal cord injury using vector-based analysis.

Avaliação da ativação muscular respiratória Usando respiratória Motor Control Assessment (ACMD) em indivíduos com lesão medular crônica

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination ...

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are intensively and increasingly recruited in septic joints from the early phases of infection and the infiltration is supposed to regress once efficient removal of the pathogens is obtained. The ability to identify in vivo macrophage activity in an infected joint can therefore provide two main applications: early detection of acute synovitis and monitoring of therapy.
In vivo noninvasive detection of macrophages can be performed with magnetic resonance imaging using iron nanoparticles such as ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO). After intravascular or intraarticular administration, USPIO are specifically phagocytized by activated macrophages, and, due to their magnetic properties, induce signal changes in tissues presenting macrophage infiltration. A quantitative evaluation of the infiltrate is feasible, as the area with signal loss (number of dark pixels) observed on gradient echo MR images after particles injection is correlated with the amount of iron within the tissue and therefore reflects the number of USPIO-loaded cells.
We present here a protocol to perform macrophage imaging using USPIO-enhanced MR imaging in an animal model of septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo noninvasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy action.

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

We demonstrate how to perform macrophage MR imaging using ultrasmall superparamagnetic contrast agent (USPIO) in septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo non-invasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy efficacy.

In vivo macrófagos Imagem Usando MR alvejado agente de contraste para avaliação longitudinal de artrite séptica

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controlado Modelo Impact Cortical para lesão cerebral traumática

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter connected to a radio transmitter into the femoral artery of rats that underwent a T4 spinal cord transection with or without grafting of embryonic brainstem-derived neural stem cells expressing green fluorescent protein. Compared to other methods such as cannula insertion or tail-cuff, telemetry is advantageous to continuously monitor blood pressure and heart rate in freely moving animals. It is also capable of long term multiple data acquisitions. In spinal cord injured rats, basal cardiovascular data under unrestrained condition and autonomic dysreflexia in response to colorectal distension were successfully recorded. In addition, cardiovascular parameters before and after SCI can be compared in the same rat if a transmitter is implanted before a spinal cord transection. One limitation of the described telemetry procedure is that implantation in the femoral artery may influence the blood supply to the ipsilateral hindlimb.

We present a protocol for using a radio-telemetric system to record cardiovascular parameters in T4 spinal cord transected rats eight weeks after embryonic brainstem neural stem cell grafting into the lesion site. Telemetry is an advanced technique to accurately evaluate cardiovascular function in conscious freely moving spinal cord injured rats.

Um sistema de rádio-telemetria para monitorar a função cardiovascular em ratos com Medula Espinhal transecção e Embryonic Stem Neural enxertos de células-

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The calibrated forceps model of compression injury is a convenient, low cost, and very reproducible animal model for SCI. We used a pair of modified forceps in accordance with the method published by Plemel et al. (2008) to laterally compress the spinal cord to a distance of 0.35 mm. In this video, we will demonstrate a dorsal laminectomy to expose the spinal cord, followed by compression of the spinal cord with the modified forceps. In the video, we will also address issues related to the care of paraplegic laboratory animals. This injury model produces mice that exhibit impairment in sensation, as well as impaired hindlimb locomotor function. Furthermore, this method of injury produces consistent aberrations in the pathology of the SCI, as determined by immunohistochemical methods. After watching this video, viewers should be able to determine the necessary supplies and methods for producing SCI of various severities in the mouse for studies on SCI and/or treatments designed to mitigate impairment after injury.

Spinal cord injury models should be highly reproducible. We demonstrate that the calibrated forceps compression model of spinal cord injury is an easy to use surgical method for generating reproducible injuries to the murine spinal cord.

Calibrado Fórceps Modelo de Lesão Medular Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an important target for neuroprotective therapies. Although several techniques have been described to assess SCBF, they all have significant limitations. To overcome the latter, we propose the use of real-time contrast enhanced ultrasound imaging (CEU). Here we describe the application of this technique in a rat contusion model of SCI. A jugular catheter is first implanted for the repeated injection of contrast agent, a sodium chloride solution of sulphur hexafluoride encapsulated microbubbles. The spine is then stabilized with a custom-made 3D-frame and the spinal cord dura mater is exposed by a laminectomy at ThIX-ThXII. The ultrasound probe is then positioned at the posterior aspect of the dura mater (coated with ultrasound gel). To assess baseline SCBF, a single intravenous injection (400 &#181;l) of contrast agent is applied to record its passage through the intact spinal cord microvasculature. A weight-drop device is subsequently used to generate a reproducible experimental contusion model of SCI. Contrast agent is re-injected 15 min following the injury to assess post-SCI SCBF changes. CEU allows for real time and in-vivo assessment of SCBF changes following SCI. In the uninjured animal, ultrasound imaging showed uneven blood flow along the intact spinal cord. Furthermore, 15 min post-SCI, there was critical ischemia at the level of the epicenter while SCBF remained preserved in the more remote intact areas. In the regions adjacent to the epicenter (both rostral and caudal), SCBF was significantly reduced. This corresponds to the previously described &#8220;ischemic penumbra zone&#8221;. This tool is of major interest for assessing the effects of therapies aimed at limiting ischemia and the resulting tissue necrosis subsequent to SCI.

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Contraste melhorado Ecografia de Avaliação da Medula Espinhal fluxo de sangue em Experimental lesão medular

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...