We acknowledge Stephanie Gorgeard, Thierry Scheerlink (Toshiba France), and Christophe Lazare (Bracco France).

NOTA: Os métodos descritos neste manuscrito foram aprovados pelo comitê de bioética da Faculdade de Medicina Lariboisière, Paris, França (CEEALV / 2011-08-01). 1. Instrumento Preparação <ol><li> Prepare e limpe os seguintes instrumentos para a inserção do cateter: micro-fórceps, tesouras, micro-micro-vascular braçadeira, grandes tesouras, linha cirúrgica (Black trançado de seda 4-0) e um cateter 14 G. Heparinizar o cateter com uma solução de heparina (5000 U / mL). </li><li> Prepare e limpe os seguintes instrumentos para a laminectomia: grandes tesoura, bisturi e um cortador de osso. Realizar laminectomia com um cortador de osso feito por encomenda concebida para reduzir o risco de prejudicar a medula espinhal durante a laminectomia (Figura 1). </li><li> Definir-se-a-quadro 3D utilizado para o posicionamento e estabilização do animal. A custom-made quadro é construído com os elementos de um fixador externo Hoffman 3 em associação com fórceps, which ter sido curvada, a fim de se ajustar à coluna lombar do animal. </li><li> Prepare o dispositivo de peso-drop (pêndulo) utilizado para lesão medular biomecânico. NOTA: O dispositivo impactação feito sob medida foi projetado com um software 3D e impresso em 3D. </li><li> Ligue a máquina de ultra-som. </li><li> Prepara-se o conjunto para a reconstituição de agente de contraste. NOTA: O kit inclui um frasco contendo 25 mg de pó liofilizado, uma seringa pré-cheia que contém 5 ml de cloreto de sódio e um sistema de transferência de mini-pico (Figura 2). Os passos para a reconstituição do agente de contraste estão detalhadas abaixo (na seção 5). </li></ol> 2. Jugular Vein cateterismo (Figura 3) <ol><li> Anestesiar os animais com 4% de isoflurano. Colocar o animal em decúbito dorsal. Confirme anestesia adequada, garantindo que o animal não responder quando as patas são comprimidos com uma pinça. Aplicar veterinário pomada nos olhos para evitar o ressecamento enquanto undanestesia er. </li><li> Raspar a garganta e limpar a pele. Realizar uma incisão na linha média do pescoço. Retrair o músculo sternocleidomastoidian a fim de encontrar a veia jugular interna. Aperte uma ligadura na parte rostral da veia. </li><li> Aplicar um grampo microvascular na veia, 1 cm abaixo da ligadura. Passe outra linha em torno da veia, logo abaixo da braçadeira com o nó pronto para ser apertar quando a braçadeira é libertado. </li><li> Abra a parede da veia (venotomia) entre o grampo ea ligadura rostral. Introduzir um cateter de 14 G no lúmen da veia e empurrá-lo para o coração. </li><li> Quando se trata-se contra o grampo, solte o último e empurrar o cateter ainda mais. Fixar o cateter na veia, por firmemente apertar o nó na veia com o cateter para dentro. </li><li> Avaliar a permeabilidade do cateter através da retirada de uma pequena quantidade de sangue venoso no cateter e, subsequentemente, em seguida, lavando-o com solução salina heparinizada. Isto impede a obstrução do catheter por um coágulo de sangue potencial. </li><li> Conecte tubagem flexível ao cateter para posterior injeção de agente de contraste (microbolhas). Mantenha-o fechado (selado) até que esteja pronto para uso. </li></ol> 3. Acesso a Espinha, laminectomia e Rat Posicionamento (no-frame 3D) <ol><li> Colocar o animal numa posição horizontal plana propenso. Raspar e limpar a parte de trás (região torácica) do animal. </li><li> Identificar a última costela (o XIII no rato) por palpação (Figura 4). Isto permite estimar a localização da vértebra torácica XIII (ThXIII). </li><li> Faça uma incisão na pele 4 centímetros na linha média, centrado em ThXIII. Abra a incisão na pele, bem como a bursa subjacente. Observe a aponeurose dos músculos das costas, bem como as pontas dos processos da coluna vertebral. </li><li> Localizar cuidadosamente o processo de espinha de ThXIII pela palpação as costelas XIII. NOTA: A costela XIII está ligado a ThXIII e, portanto, representa um fácil de locate marco anatômico para a identificação de ThXIII. Este passo permite que a localização da ThXII para ThIX processo espinal, bem como L1 e L2 (primeira e segunda vértebras lombares). </li><li> Corte a aponeurose muscular e separar os músculos de cada lado para expor os processos espinhosos, as lâminas e as articulações de ThIX para L2. Expor os aspectos laterais dos L1 e L2, desprendendo músculos dos processos transversais. </li><li> Gancho dentes incisivos do animal sobre a armação-3D para fixar a posição (Figura 5). Aperte as vértebras L1 e L2 com a pinça modificados. Ligue o fórceps modificados para o quadro-3D, a fim de estabilizar o animal. </li><li> Puxe delicadamente caudal a pinça segurando a coluna lombar, a fim de apertar toda a coluna vertebral e para elevar o tórax do banco. NOTA: Com a disposição descrita o animal deve ser capaz de respirar. Além disso, apesar dos movimentos respiratórios da caixa torácica, a coluna vertebral e da medulacabo também deve permanecer imóvel. </li><li> Remover o processess espinhoso de ThIX para ThXII. Insira cuidadosamente a lâmina inferior do cortador de osso abaixo da lâmina esquerda de ThXII e feche o cortador de osso, a fim de cortar a lâmina (Figura 6). </li><li> Repita a mesma manobra para a lâmina direita e remova sucessivamente o arco posterior. Repetir os passos anteriores para o ThXI vértebra a ThIX, a fim de alcançar uma laminectomia de quatro níveis. Retire as duas articulações para cada vértebra. NOTA: Durante o procedimento, limpe o campo operatório de sangramento local. Para isso, use cotonetes e irrigação com soro fisiológico morno. Hemostasia ocorre sistematicamente em poucos minutos. </li></ol> 4. Posicionamento CEU Probe <ol><li> Cubra a dura-máter com gel de ultra-som. Isto permite que a transmissão efectiva das ondas de ultra-som entre a sonda e a medula espinal (Figura 7). </li><li> Estabilizar a sonda de ultra-som sagacidadebraçadeira ha que podem ser posteriormente conectado à-frame 3D por um braço articulado. Posicionar manualmente a sonda. Certifique-se de que a sonda está orientada para obter uma fatia sagital longitudinal oblíqua. Numa posição correcta, a espinal medula é estritamente horizontal sobre a imagem e o canal central da medula espinal é visível ao longo do segmento completo da medula espinal. NOTA: Posicionamento deve ser guiado pela imagem em modo B em tempo real exibida na tela da máquina de ultra-sons. A distância focal da sonda de ultra-som deve ser alinhado com o canal central da medula espinhal. Neste momento, o aspecto posterior da medula espinal é acessível que acabará por permitir o posicionamento do pêndulo. </li><li> Quando ideal, bloquear o braço articulado para estabilizar a posição. </li></ol> 5. Preparação de Agente de Contraste - Reconstituição de microbolhas <ol><li> Usando o conteúdo de um kit comercial e reconstituição ligar a haste do êmbolo, apertando-o tightly para a seringa (no sentido horário). Abra a ampola do sistema de transferência e retire a tampa da seringa. Abra a tampa do sistema de transferência e introduza a seringa no sistema de transferência (apertar com força). </li><li> Remover o disco de protecção do frasco. Deslize o frasco na folha transparente do </li><li> sistema de transferência e pressione firmemente para assentar o frasco no lugar. </li><li> Esvaziar o conteúdo da seringa no frasco, empurrando a haste do êmbolo. Agita-se vigorosamente durante 20 segundos para misturar todos os conteúdos do frasco para se obter um líquido homogéneo branco leitoso. </li><li> Inverter o sistema e retirar cuidadosamente o agente de contraste para dentro da seringa. Retire a seringa do sistema de transferência. Após reconstituição (conforme indicado), 1 ml da dispersão resultante contém 8 ul hexafluoreto de enxofre nas microbolhas. Desenhar a suspensão de micro-vesículas com uma seringa de 100 ml. Inserir a seringa de 100 ml para a bomba elétrica. Fechar a tampa. </li><li> Iniciar agitação constante da remicrobolhas constituído. Obteve-se a agitação constante por rotação lenta da seringa, o que mantém a suspensão de microbolhas. Ligar a bomba para o cateter jugular através da tubagem flexível. Configure o aparelho de ultra-som para o &quot;Modo Harmonic&quot;. NOTA: esta última corresponde ao modo no qual as microbolhas pode ser especificamente detectada e visualizado. Este modo tem um baixo índice mecânico, que não destrói as microbolhas, em oposição ao modo-B. </li><li> Purga-se o cateter através da infusão de uma primeira dose (400 ul) de agente de contraste. Durante esta primeira infusão, verifique se as microbolhas que aparecem na tela do ultra-som. Isto confirma que todo o circuito (a partir da seringa para a corrente sanguínea da ratazana) está intacto e aberta. </li><li> Configure o aparelho de ultra-som para &quot;B-mode&quot; para visualizar o parênquima da medula espinhal ea destruição dos poucos remanescentes microbolhas na corrente sanguínea. A alta freqüência da &quot;B-Mode&quot; tranalta energia smits às microbolhas, o que lhes permite avaria. </li><li> Deixe o animal ficou imóvel por aproximadamente 30 min. Este período permite a estabilização dos parâmetros hemodinâmicos. </li></ol> 6. Avaliação de SCBF na Medula Espinhal Intact <ol><li> Configure o aparelho de ultra-som para o &quot;Modo Harmonic&quot;. Iniciar em simultâneo (1) a infusão de agente de contraste (400 ul) e (2) o cronometro. Nota: Durante a infusão, a concentração de microbolhas na corrente sanguínea deve aumentar, permitindo que a imaginação contraste da medula espinhal (Figura 8). Uma vez que as microbolhas são rapidamente destruídas, a concentração sanguínea de microbolhas começa a diminuir uma vez que a injecção está terminada, que gera uma diminuição progressiva na visualização contraste da medula espinal. </li><li> Após 1 min, selecione (imprensa) o botão &quot;Clip Store&quot; na máquina de ultra-som. Isto irá permitir um para salvar 1 min de raw dados ultra-som eo vídeo de imagem de gravação (que foi anteriormente exibida na tela do ultra-som). </li><li> Configure o aparelho de ultra-som para &quot;B-Mode&quot;. Isto irá eliminar as microbolhas restantes. </li></ol> 7. Experimental SCI <ol><li> Usando o micromanipulador ligado ao quadro-3D, posicionar o dispositivo de compactação de peso-gota, de modo que a ponta do pêndulo entra em contacto com a dura-máter (na linha mediana da medula espinal), na junção entre ThX e ThXI (Figura 9) . NOTA: Este nível deve corresponder ao meio do segmento de medula espinal observada com o dispositivo de ultra-som. O atacante eo corpo do pêndulo são de 8 mm de diâmetro. A ponta do pêndulo, o que irá gerar o prejuízo, é de 3 mm de diâmetro. </li><li> Inserir o percutor do dispositivo de compactação em uma posição de 10 cm de altura. Induzir a SCI experimental, liberando o atacante do dispositivo impactação. O atacante cai e libera the pêndulo, ferindo a medula espinhal. A impacção feito à medida proporciona um impacto equivalente a um peso de 10 g deixado cair de uma altura de 10 cm. </li></ol> 8. Avaliação dos SCBF 5 min pós-SCI <ol><li> Repita os passos descritos no capítulo 6 (Avaliação da SCBF). As microbolhas não será capaz de passar através da microvasculatura danificado e o epicentro lesão permanecerá escuro (Figura 10). </li></ol> 9. Sacrifício de Animais <ol><li> Eutanásia dos animais com a injecção letal intra-peritoneal de pentobarbital (100 mg). </li></ol> 10. Quantificação de SCBF pela análise off-line <ol><li> Comece o Software Ultra-Estender utilizado para a quantificação (na máquina de ultra-som). Selecione &quot;Arquivo&quot; e selecione os dados brutos salvas anteriormente e abrir os arquivos associados. Ativar o &quot;modo de quantificação&quot;, premindo o botão &quot;Chi Q&quot; (selecção). Select &quot;Set ROI&quot; (botão) e escolher a forma circular. </li><li> Selecione &quot;Desenhar ROI&quot; (botão) e desenhe sete regiões circulares adjacentes de interesse (ROI) sobre a medula espinhal (Figura 11). Abra o menu &quot;Ajuste&quot; e escolha a função &quot;valor da curva&quot;. Observar o software visualizadas várias curvas, cada um correspondendo a mudanças de concentração de microbolhas dentro de uma ROI. NOTA: Cada curva tem um perfil &quot;perfusão-deperfusion&quot;. A primeira fase da curva é plana e corresponda ao período anterior à chegada de microbolhas. Na segunda fase, a concentração de microbolhas aumenta rapidamente, como resultado da infusão. Na terceira fase, a qual começa quando a infusão está completa, a concentração de microbolhas diminui progressivamente à medida que disintegratse na corrente sanguínea. </li><li> Coloque a primeira linha vertical no início da segunda fase da curve e selecione &quot;SET&quot;. Isso informa ao software onde começar a análise. </li><li> Coloque a segunda linha vertical no final da gravação e mais uma vez seleccionar &quot;set&quot;. Isso informa ao software onde parar análise. </li><li> Olhe para o menu &quot;Cv&quot; e gravar o valor &quot;AUC&quot;, que corresponde à &quot;Área Sob a Curva&quot;, analisou. Este valor é proporcional à FSME dentro da ROI correspondente. </li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial conflict of interest. The ultrasound machine was graciously lent by the Toshiba France company. The Vueject pump was graciously lent by the Bracco France company.

Embora tenhamos descrito como usar CEU em um modelo de contusão SCI rato, este protocolo pode ser modificado para atender outros objetivos experimentais ou modelos SCI. Optamos por medir SCBF em apenas dois momentos (antes da lesão e 15 min pós-SCI), no entanto o número de pontos de tempo eo atraso entre as medidas SCBF pode ser adaptado para atender as necessidades de outros estudos. Por exemplo, no nosso trabalho anterior 17, que mediram FSME em cinco pontos de tempo sucessivos durante a primeira hora d...

Lesão medular traumática (SCI) é uma condição devastadora levando a prejuízo significativo no motor, sensorial e funções autônomas. Até à data, nenhum tratamento tem demonstrado a sua eficácia em pacientes. Por tal razão, é importante para identificar novas técnicas que irão melhorar a avaliação dos tratamentos potenciais e pode elucidar melhor lesão pathiophysiology 1. SCI é dividido em duas fases sequenciais, como a que se refere a lesões primárias e secundárias. A lesão primária corresponde ao insulto mecânica inicial. Considerando que os grupos de lesões secundárias uma cascata de vários eventos biológicos (como a inflamação, o estresse oxidativo e hipóxia), que contribuem ainda mais para a expansão progressiva da lesão inicial, dano tecidual e, portanto, neurológica 2,3 déficit. Na fase aguda da SCI, terapias neuroprotetoras visam reduzir a patologia lesão secundária e should melhorar a conformidade resultados neurológicos. Entre os muitos eventos de lesões secundárias, isquemia desempenha um papel 4,5 crucial. Ao nível do epicentro SCI, os microvasos parênquima danificadas impedir o fluxo de sangue da medula espinhal eficaz (SCBF). Além disso, FSME também é significativamente reduzida na região em torno do epicentro lesão, uma área especificamente conhecido como a &quot;zona de penumbra de isquemia&quot;. Se FSME não pode ser rapidamente restabelecida dentro destas regiões, a isquemia pode levar a necrose do parênquima complementar e danos no tecido nervoso adicional. Como até mesmo a preservação de tecido mais leve pode ter efeitos substanciais de função, é de grande interesse para desenvolver medicamentos e terapias que podem reduzir isquemia pós-SCI. Para realçar este fenómeno, o trabalho anterior mostrou que a preservação de apenas 10% dos axônios mielinizados foi suficiente para permitir a pé em gatos pós-SCI 6. Embora vários técnicas tenham sido descritas para avaliar FSME, oy todos têm limitações significativas. Por exemplo, o uso de microesferas radioactivas 7,8 e C14-iodopyrine autorradiografia 9 requer subsequente sacrifício dos animais e não pode ser repetido em pontos temporais posteriores. A técnica de depuração de hidrogénio 10 depende da inserção de eléctrodos intraspinal, que pode danificar ainda mais a medula espinhal. Enquanto Doppler a laser, fotopletismografia 14,15 e in vivo microscopia de luz 16 tem uma profundidade muito limitada / área de medição 11-13. A nossa equipa foi anteriormente mostrado que o contraste de ultra-sons melhorada (CEU) de imagem pode ser usada para avaliar o tempo real e in vivo as alterações FSME no parênquima medula espinal de rato 17. É importante notar que uma técnica semelhante foi aplicada por Huang et al., Em um modelo suíno de SCI 18. CEU aplica um modo específico de imagens ultra-sónicas que permite associar tons de cinza im morfológicaidade (obtidos pelo modo B convencional) com a distribuição espacial do fluxo sanguíneo 19. A imagem SCBF e quantificação baseia-se na injecção intravascular de agentes de eco-contraste. O agente de contraste é composta por microbolhas de hexafluoreto de enxofre (diâmetro de cerca de 2,5 significa um e 90% têm um diâmetro inferior a 6 mm) estabilizada por fosfolípidos. As microbolhas de reflectir o feixe de ultra-som emitido pela sonda aumentando assim a ecogenicidade sangue e aumentar o contraste dos tecidos de acordo com o seu fluxo sanguíneo. Por conseguinte, é possível avaliar a fluxo de sangue de uma dada região de interesse de acordo com a intensidade do sinal reflectido. As microbolhas são também seguras e que têm sido clinicamente aplicada em seres humanos. O hexafluoreto de enxofre é rapidamente apagada (tempo de semi-vida terminal é de 12 min) e mais do que 80% do hexafluoreto de enxofre administrada é recuperada no ar exalado dentro de 2 minutos após a injecção. Este protocolo fornece uma maneira simples de usar CEU imenvelhecimento para avaliar as mudanças SCBF em ratos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1154">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:299px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">External Fixator Hoffman 3</td>
			<td style="width:229px;">Stryker, Kalamazoo, USA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Toshiba Applio</td>
			<td style="width:229px;">Toshiba, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Ultrasound machine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Sonovue</td>
			<td style="width:229px;">Bracco, Milan, Italy</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Contrast agent : microbubbles</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Vueject pump</td>
			<td style="width:229px;">Bracco, Milan, Italy</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Electric pump for infusion of microbubbles bolus</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:397px;">Aquasonic Ultrasound Gel</td>
			<td style="width:229px;">Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:397px;">Isovet</td>
			<td style="width:229px;">Piramal Healthcare, Mumbai, India</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Isoflurane used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Ultra Extend</td>
			<td style="width:229px;">Toshiba, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Software used for quantification of spinal cord blood flow</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6</td>
			<td style="width:229px;">Canadian Tire, Toronto, Canada</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Set of pliers for Do-it-yourself job</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast enhanced ultrasound imaging for assessment of spinal cord blood flow in experimental spinal cord injury

Redução do fluxo de sangue da medula espinal (FSME) (isto é, isquemia) desempenha um papel-chave na lesão traumática da medula espinal (SCI) patofisiologia e é, portanto, um importante alvo para terapias neuroprotectores. Embora vários técnicas tenham sido descritas para avaliar FSME, todos eles têm limitações significativas. Para superar este último, propomos o uso de tempo real de imagens de contraste melhorado ultra-som (CEU). Aqui nós descrevemos a aplicação desta técnica em um modelo de rato de contusão SCI. Um cateter jugular é implantada em primeiro lugar para a injecção repetida do agente de contraste, uma solução de cloreto de sódio de hexafluoreto de enxofre microbolhas encapsuladas. A coluna é então estabilizada com um 3D-frame feito por encomenda e da medula espinhal dura mater é exposto por uma laminectomia em ThIX-ThXII. A sonda de ultra-sons é, então, posicionado no aspecto posterior da dura-máter (revestidas com gel de ultra-som). Para avaliar FSME linha de base, uma única injecção intravenosa (400 ul) de contrapartidaagente é aplicado r para gravar a sua passagem intacta através da microvasculatura da medula espinal. Um dispositivo de peso-gota é subsequentemente utilizado para gerar um modelo experimental reproduzível contusão da SCI. Agente de contraste é reinjetado 15 min após a lesão para avaliar as mudanças pós-SCI SCBF. CEU permite em tempo real e in vivo avaliação de alterações SCBF após uma lesão medular. No animal ileso, ultra-sonografia mostrou fluxo sanguíneo irregular ao longo da medula espinhal intacta. Além disso, 15 minutos após a SCI, houve isquemia crítica no nível do epicentro enquanto FSME ficaram preservados nas áreas mais remotas intacta. Nas regiões adjacentes do epicentro (ambos rostral e caudal), FSME foi significativamente reduzida. Isto corresponde à &quot;zona de penumbra de isquemia&quot; anteriormente descrito. Esta ferramenta é de grande interesse para a avaliação dos efeitos das terapias destinadas a limitar a isquemia e necrose do tecido resultante após a SCI.

Com o protocolo descrito acima, é possível mapear o FSME ao longo de um segmento de coluna vertebral sagital longitudinal. Na medula espinal intacta, parece haver irregularidades FSME dentro do parênquima (Figura 12). Isto pode ser explicado pela distribuição variável de artérias radiculo-medular (RMA) a partir de um animal para outro. RMA refere-se a segmentar artérias que atingem a artéria espinal anterior (ASA) e, portanto, fornecer o fornecimento de sangue para ...

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Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Contraste melhorado Ecografia de Avaliação da Medula Espinhal fluxo de sangue em Experimental lesão medular

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

contrast-enhanced-ultrasound-imaging-for-assessment-spinal-cord-blood

Research

JoVE Journal

Medicine

13.9K visualizações.  Faculté de Médecine Paris Diderot Paris VII, U942. Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

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Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory testing in rat SCI models is needed. However, until recently, no single testing approach had been validated for SCI so that standardized methods have not been implemented across labs. Additionally, available testing methods could not be implemented acutely or when severe motor impairments existed, preventing studies of the development of SCI-induced allodynia3. Here we present two validated sensory testing methods using von Frey Hair (VFH) monofilaments which quantify changes in tactile sensory thresholds after SCI4-5. One test is the well-established Up-Down test which demonstrates high sensitivity and specificity across different SCI severities when tested chronically5. The other test is a newly-developed dorsal VFH test that can be applied acutely after SCI when allodynia develops, prior to motor recovery4-5. Each VFH monofilament applies a calibrated force when touched to the skin of the hind paw until it bends. In the up-down method, alternating VFHs of higher or lower forces are used on the plantar L5 dermatome to delineate flexor withdrawal thresholds. Successively higher forces are applied until withdrawal occurs then lower force VFHs are used until withdrawal ceases. The tactile threshold reflects the force required to elicit withdrawal in 50% of the stimuli. For the new test, each VFH is applied to the dorsal L5 dermatome of the paw while the rat is supported by the examiner. The VFH stimulation occurs in ascending order of force until at least 2 of 3 applications at a given force produces paw withdrawal. Tactile sensory threshold is the lowest force to elicit withdrawal 66% of the time. Acclimation, testing and scoring procedures are described. Aberrant trials that require a retest and typical trials are defined. Animal use was approved by Ohio State University Animal Care and Use Committee.

We describe two tactile sensory testing methods for acute or chronic periods of spinal cord injury in rats. These validated procedures can detect the development and maintenance of allodynia-like sensations.

Aguda e crônica teste sensorial tátil após a lesão medular em ratos

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Medicina

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is described to obtain a consistent model of severe SCI. Use of a stereotactic frame and computer controlled impactor allows for creation of reproducible injury. Hypothermia and urinary tract infection pose significant challenges in the post-operative period. Careful monitoring of animals with daily weight recording and bladder expression allows for early detection of post-operative complications. The functional results of this contusion model are equivalent to transection models. The contusion model can be utilized to evaluate the efficacy of both neuroprotective and neuroregenerative approaches.

A contusion model of severe spinal cord injury is described. Detailed pre-operative, operative and post-operative steps are described to obtain a consistent model.

Um modelo de contusão grave de lesão medular em ratos

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment (RMCA) in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination is disrupted by spinal cord injury (SCI), control of respiratory muscles innervated below the injury level is compromised1,2 leading to respiratory muscle dysfunction and pulmonary complications. These conditions are among the leading causes of death in patients with SCI3. Standard pulmonary function tests that assess respiratory motor function include spirometrical and maximum airway pressure outcomes: Forced Vital Capacity (FVC), Forced Expiratory Volume in one second (FEV1), Maximal Inspiratory Pressure (PImax) and Maximal Expiratory Pressure (PEmax)4,5. These values provide indirect measurements of respiratory muscle performance6. In clinical practice and research, a surface electromyography (sEMG) recorded from respiratory muscles can be used to assess respiratory motor function and help to diagnose neuromuscular pathology. However, variability in the sEMG amplitude inhibits efforts to develop objective and direct measures of respiratory motor function6. Based on a multi-muscle sEMG approach to characterize motor control of limb muscles7, known as the voluntary response index (VRI)8, we developed an analytical tool to characterize respiratory motor control directly from sEMG data recorded from multiple respiratory muscles during the voluntary respiratory tasks. We have termed this the Respiratory Motor Control Assessment (RMCA)9. This vector analysis method quantifies the amount and distribution of activity across muscles and presents it in the form of an index that relates the degree to which sEMG output within a test-subject resembles that from a group of healthy (non-injured) controls. The resulting index value has been shown to have high face validity, sensitivity and specificity9-11. We showed previously9 that the RMCA outcomes significantly correlate with levels of SCI and pulmonary function measures. We are presenting here the method to quantitatively compare post-spinal cord injury respiratory multi-muscle activation patterns to those of healthy individuals.

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment RMCA in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

The purpose of this publication is to present our original work on a multi-muscle surface electromyographic approach to quantitatively characterize respiratory muscle activation patterns in individuals with chronic spinal cord injury using vector-based analysis.

Avaliação da ativação muscular respiratória Usando respiratória Motor Control Assessment (ACMD) em indivíduos com lesão medular crônica

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controlado Modelo Impact Cortical para lesão cerebral traumática

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter connected to a radio transmitter into the femoral artery of rats that underwent a T4 spinal cord transection with or without grafting of embryonic brainstem-derived neural stem cells expressing green fluorescent protein. Compared to other methods such as cannula insertion or tail-cuff, telemetry is advantageous to continuously monitor blood pressure and heart rate in freely moving animals. It is also capable of long term multiple data acquisitions. In spinal cord injured rats, basal cardiovascular data under unrestrained condition and autonomic dysreflexia in response to colorectal distension were successfully recorded. In addition, cardiovascular parameters before and after SCI can be compared in the same rat if a transmitter is implanted before a spinal cord transection. One limitation of the described telemetry procedure is that implantation in the femoral artery may influence the blood supply to the ipsilateral hindlimb.

We present a protocol for using a radio-telemetric system to record cardiovascular parameters in T4 spinal cord transected rats eight weeks after embryonic brainstem neural stem cell grafting into the lesion site. Telemetry is an advanced technique to accurately evaluate cardiovascular function in conscious freely moving spinal cord injured rats.

Um sistema de rádio-telemetria para monitorar a função cardiovascular em ratos com Medula Espinhal transecção e Embryonic Stem Neural enxertos de células-

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Use Synergetic de células neuronais precursoras e Peptídeos de auto-montagem em Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

Neural Stem Cell Transplantation em Experimental contusão Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The calibrated forceps model of compression injury is a convenient, low cost, and very reproducible animal model for SCI. We used a pair of modified forceps in accordance with the method published by Plemel et al. (2008) to laterally compress the spinal cord to a distance of 0.35 mm. In this video, we will demonstrate a dorsal laminectomy to expose the spinal cord, followed by compression of the spinal cord with the modified forceps. In the video, we will also address issues related to the care of paraplegic laboratory animals. This injury model produces mice that exhibit impairment in sensation, as well as impaired hindlimb locomotor function. Furthermore, this method of injury produces consistent aberrations in the pathology of the SCI, as determined by immunohistochemical methods. After watching this video, viewers should be able to determine the necessary supplies and methods for producing SCI of various severities in the mouse for studies on SCI and/or treatments designed to mitigate impairment after injury.

Spinal cord injury models should be highly reproducible. We demonstrate that the calibrated forceps compression model of spinal cord injury is an easy to use surgical method for generating reproducible injuries to the murine spinal cord.

Calibrado Fórceps Modelo de Lesão Medular Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...