Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde - National Heart Lung, and Blood Institute (Award # R00HL093358 a LDB).

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Não há conflitos de interesse declarados.

O encapsulamento dos cardiomiócitos de rato neonatal no resultado de fibrina géis de forma consistente e viável tridimensional in vitro modelo do sistema do miocárdio. Fibrina é um biomaterial preferido porque quando as células são aprisionadas, elas são metabolicamente ativa e capaz de compactação, remodelação e recriando uma matriz extracelular que é consistente com o tecido do coração nativo 12. Porque nós permitimos que os cardiomiócitos a alinhar-se neste ambiente, sua funcionalidade é mais característico do músculo cardíaco, resultando em maior força de contração em comparação com tecidos isotrópico 6. Para potenciais aplicações terapêuticas, é necessário encapsular células dentro de um material que promove tanto a viabilidade e funcionalidade. Os protocolos aqui apresentados demonstram uma forma eficiente e precisa para a criação de uma rede de fibrina para controlar o comportamento de células cardíacas em um microambiente tridimensional. Alguns problemas potenciais podem surgir durante a criação ea cultura dessas construções. Um potencial problema é a manutenção da viabilidade celular antes de encapsulamento, o que irá afectar significativamente a funcionalidade da construção. Esforço deve ser feito para limitar a morte celular após o isolamento, reduzindo o tempo entre o isolamento eo encapsulamento das células dentro do gel de fibrina. Construções deve ser fornecida mídia todos os dias em um horário rigoroso. Além disso, é importante para assegurar a homogeneidade em todas as soluções utilizadas. Se a mistura de fibrinogênio, trombina e células produz um ambiente heterogêneo, a capacidade das células para remodelar o ECM, mecanicamente casal e contrato é potencialmente obstruído. Também é importante para prevenir a formação de bolhas de ar durante a injeção das construções, a fim de evitar perturbações na continuidade da engenharia de tecidos. Uma maneira de aliviar esta questão é chamar mais gel do que é necessário para fazer a construção com a seringa e injetar lentamente. Por último, uma vez que a matriz de fibrina definiu e foi em meio de cultura por 24 horas, é essencial destacar a construir a partir dos lados do molde do anel para promover a compactação baseada em células do gel de fibrina. Mantendo a construir no meio do molde facilita a troca de gases e nutrientes. Aderência para os lados do molde do anel podem também romper o alinhamento desejado celular. É importante notar que a decapitação consciente é usado como método de eutanásia neste protocolo, que é um método aceitável no âmbito das orientações de ambos os Institutos Nacionais de Saúde ea Associação Médica Americana Veterinária. No entanto, algumas instituições recomendam usar anestésico seguido por decapitação em ratos neonatal. Nós escolhemos a decapitação consciente porque garante a quantidade mínima de tempo sob condições de hipóxia para o tecido do coração extirpado / células. Quantidades relativamente pequenas de hipóxia pode levar à isquemia e morte dos miócitos potencialmente miócito, que poderiam afetar significativamente os resultados deste protocolo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico </td><td> Sigma </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma </td><td> G5400 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> hemostat </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 91308-12 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> pinça fina </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11251-20 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> tesouras grandes </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 91401-14 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> micro-tesoura </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 91501-09 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> lidar com bisturi </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 10008-13 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> lâmina de bisturi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-918-5A </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> Underpad banco absorvente </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> drape estéril </td><td> Fisher Scientific </td><td> GM42526 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> saco de autoclave </td><td> Pescador </td><td> 01-812-54 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> compressa de gaze </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-761-52 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> betadine </td><td> Purdue Produtos </td><td> 67618-150-01 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> luvas estéreis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-020 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> pipeta de transferência estéril </td><td> Fisher Scientific </td><td> 9962 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> colagenase </td><td> Worthington </td><td> CLS2 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> Teflon haste 1 / 4 polegada de diâmetro </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8546K11 </td><td> Parte do molde </td></tr><tr><td> Teflon ID tubo 1 / 4 de polegada, OD 1 / 2 polegada </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8547K31 </td><td> Parte do molde </td></tr><tr><td> Silicone O-Ring ID 1 / 4 de polegada, OD 1 / 2 polegada </td><td> McMaster-Carr </td><td> 9396K204 </td><td> Parte do molde </td></tr><tr><td> Teflon tubo de 1 / 4 ID polegadas, 5 / 16 polegadas OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 52355K14 </td><td> Parte do molde </td></tr><tr><td> Seringas Kendall monoject 6cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-561-41 </td><td> Parte do molde </td></tr><tr><td> BD seringa 3cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td> Parte do molde </td></tr><tr><td> Fibrinogênio bovino </td><td> Sigma </td><td> F8630 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> A trombina bovina </td><td> Sigma </td><td> T7513 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> PLURONIC F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma </td><td> 383147 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 0,2 micron filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> SCGVT05RE </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 40 micron filtros celular </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-363-547 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 0,45 micron filtro de tampa de garrafa </td><td> Corning </td><td> 430627 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> de vidro pré-filtro </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 polegada de comprimento agulha </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826-5D </td><td> Construir </td></tr><tr><td> 21G agulha de 1 polegada </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826C </td><td> Construir </td></tr><tr><td> construção de frascos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2116 </td><td> Construir </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Mídia </td></tr><tr><td> soro de cavalo </td><td> Sigma </td><td> H1138 </td><td> Mídia </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> Mídia </td></tr><tr><td> ácido aminocapróico </td><td> Acros Organics </td><td> 103305000 </td><td> Mídia </td></tr><tr><td> ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A5960 </td><td> Mídia </td></tr><tr><td> insulina </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td><td> Mídia </td></tr><tr><td> Paraformaldeído, 16% </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 15710 </td><td> Histologia </td></tr><tr><td> Temperatura de corte ideal (OCT) </td><td> Ted Pella </td><td> 27050 </td><td> Histologia </td></tr><tr><td> 2-metilbutano </td><td> Pescador </td><td> 03551-4 </td><td> Histologia </td></tr><tr><td> Anticorpo primário do mouse MYH1/2/4/6 </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-32732 </td><td> Histologia </td></tr><tr><td> Coelho Conexina 43 anticorpo primário </td><td> Tecnologia de sinalização celular </td><td> 3512 </td><td> Histologia </td></tr><tr><td> Dylight 549-burro conjugado anticorpo anti-rato-secundário </td><td> Jackson Laboratories ImmunoResearch </td><td> 715-505-151 </td><td> Histologia </td></tr><tr><td> Dylight 488-conjugados de anticorpos anti-coelho Donke secundário </td><td> Jackson Laboratories ImmunoResearch </td><td> 711-485-152 </td><td> Histologia </td></tr><tr><td> Vivo / morto ensaio </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> Análise </td></tr></tbody></table>

encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering

A cultura de células em um ambiente de hidrogel tridimensional é uma técnica importante para o desenvolvimento de construções para a engenharia de tecidos, bem como estudar as respostas celulares em condições diversas da cultura in vitro. O ambiente tridimensional reproduz com mais exatidão o que as células observar in vivo devido à aplicação de estímulos mecânicos e químicos em todas as dimensões 1. Tridimensional hidrogéis podem ser feitas a partir de polímeros sintéticos como PEG-DA 2 e PLGA 3 ou um número de proteínas que ocorrem naturalmente, como o colágeno 4, 5 ou ácido hialurônico fibrina 6,7. Hidrogéis criado a partir de fibrina, uma proteína do sangue que ocorre naturalmente coagulação, pode polimerizar para formar uma malha que é parte da cura do corpo ferida processos naturais 8. Fibrina é célula-degradáveis ​​e potencialmente autólogo 9, tornando-se um andaime ideal temporário para engenharia de tecidos. Aqui nós descrevemos em detalhe o isolamento dos cardiomiócitos neonatal a partir de três dias os filhotes de rato velho e preparação das células para encapsulamento em construções de hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos. Miócitos neonatal são uma fonte de células comuns utilizados para estudos in vitro na formação de tecido cardíaco e engenharia 4. Fibrina gel é criado pela mistura do fibrinogênio com a trombina enzima. A trombina cliva fibrinopeptídeos FPA e FPB de fibrinogênio, revelando os sítios de ligação que interagem com outros monómeros 10. Essas interações causam os monômeros para auto-montar em fibras que formam a malha de hidrogel. Porque o timing dessa reação enzimática pode ser ajustado alterando a relação de trombina ao fibrinogênio, ou a razão de cálcio para a trombina, pode-se molde de injeção constrói com um número de diferentes geometrias 11,12. Além disso podemos gerar o alinhamento do tecido resultante da forma como restringir o gel durante a cultura 13. Após o cultivo da engenharia construções de tecido cardíaco durante duas semanas sob condições estáticas, as células cardíacas começaram a remodelar a construir e pode gerar uma força de contração em condições de estimulação elétrica 6. Como parte deste protocolo, também descrevem métodos para analisar a engenharia de tecidos do miocárdio após o período de cultura, incluindo a análise funcional da força ativa gerada pelo músculo cardíaco construir sobre a estimulação elétrica, bem como métodos para determinar a viabilidade celular final (Live-Morto ensaio) e coloração imuno para examinar a expressão de proteínas e morfologia típica importante para a contração (Miosina Cadeia Pesada ou MHC) e acoplamento celular (Conexina 43 ou Cx43) entre os miócitos.

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Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Descrevemos o isolamento de cardiomiócitos neonatal e na preparação das células para encapsulamento em construções de hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos. Descrevemos métodos para analisar a engenharia de tecidos do miocárdio após o período de cultura, incluindo a força ativa gerada com a estimulação elétrica e viabilidade celular e coloração imuno.

Encapsulamento de Cardiomyocytes em um hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos cardíacos

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

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Bioengineering

24.0K visualizações.  Tufts University. Descrevemos o isolamento de cardiomiócitos neonatal e na preparação das células para encapsulamento em construções de hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos. Descrevemos métodos para analisar a engenharia de tecidos do miocárdio após o período de cultura, incluindo a força ativa gerada com a estimulação elétrica e viabilidade celular e coloração imuno.