Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health - National Heart, Lung and Blood Institute (Premio # R00HL093358 a LDB).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;incapsulamento dei cardiomiociti neonatali di ratto in fibrina risultati gel in un coerente e praticabile tridimensionale modello in vitro del sistema del miocardio. Fibrina è un biomateriale preferito perché quando le cellule sono intrappolati, sono metabolicamente attive e in grado di compattazione, rimodellamento e ricreare una matrice extracellulare che è coerente con il tessuto cardiaco nativo 12. Perché lasciamo che il cardiomiociti ad allinearsi in questo ambiente, la loro funzionalità è più caratteristica del muscolo cardiaco con conseguente forza di contrazione maggiore rispetto ai tessuti isotropo 6. Per potenziali applicazioni terapeutiche, è necessario incapsulare le cellule all&#39;interno di un materiale che promuove sia la vitalità e la funzionalità. I protocolli qui presentati dimostrano un mezzo efficace e preciso per la creazione di una rete di fibrina per controllare il comportamento delle cellule cardiache in un microambiente tridimensionale. Alcune questioni potenziali possono sorgere durante la creazione e la cultura di questi costrutti. Un problema potenziale è il mantenimento della vitalità cellulare prima di incapsulamento, che influenzano in modo significativo la funzionalità del costrutto. Sforzo dovrebbe essere fatto per limitare la morte cellulare dopo l&#39;isolamento, riducendo il tempo che intercorre tra l&#39;isolamento e l&#39;incapsulamento delle celle all&#39;interno del gel di fibrina. Costruisce dovrebbero essere forniti supporti ogni altro giorno su un programma rigoroso. Inoltre, è importante per garantire omogeneità in tutte le soluzioni utilizzate. Se la miscela di fibrinogeno, trombina e le cellule produce un ambiente eterogeneo, la capacità delle cellule di rimodellare la ECM, meccanicamente coppia e contratto è potenzialmente ostruito. E &#39;anche importante per evitare la formazione di bolle d&#39;aria durante l&#39;iniezione dei costrutti al fine di prevenire turbative nella continuità del tessuto ingegnerizzato. Un modo per alleviare questo problema è attirare più gel che è necessario per rendere il costrutto nella siringa e iniettare lentamente. Infine, una volta che la matrice di fibrina ha creato ed è stato nel terreno di coltura per 24 ore, è essenziale per staccare il costrutto dai lati dello stampo ad anello per promuovere il cell-based compattazione del gel di fibrina. Mantenere il costrutto nel mezzo dello stampo facilita lo scambio di gas e dei nutrienti. L&#39;aderenza ai lati dello stampo ad anello può anche disturbare l&#39;allineamento desiderato cellulare. E &#39;importante notare che la decapitazione cosciente è utilizzato come metodo di euthanization in questo protocollo, che è un metodo accettabile in base alle direttive sia dal National Institutes of Health e la American Veterinary Medical Association. Tuttavia, alcuni istituti di raccomandare l&#39;uso anestetico seguita dalla decapitazione di ratti neonati. Abbiamo scelto la decapitazione consapevole in quanto garantisce la minima quantità di tempo in condizioni di ipossia per il tessuto cardiaco asportato / cellule. Quantità relativamente piccole di ipossia può portare a miociti ischemia e la morte potenzialmente miociti, che potrebbero influenzare significativamente i risultati di questo protocollo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio bibasico </td><td> Sigma </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G5400 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> emostatica </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 91308-12 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> bene pinzette </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11251-20 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> forbici di grandi dimensioni </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 91401-14 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> micro-forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 91501-09 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> manico bisturi </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 10008-13 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> bisturi lama </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-918-5A </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> Banco underpad assorbente </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> telino sterile </td><td> Fisher Scientific </td><td> GM42526 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> autoclave borsa </td><td> Pescatore </td><td> 01-812-54 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> garza tampone </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-761-52 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Purdue Prodotti </td><td> 67618-150-01 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> guanti sterili </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-020 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> trasferimento pipetta sterile </td><td> Fisher Scientific </td><td> 9962 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> collagenasi </td><td> Worthington </td><td> CLS2 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> Teflon asta 1 / 4 pollici di diametro </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8546K11 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Teflon diametro interno del tubo 1 / 4 pollici, 1 / 2 pollice OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8547K31 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Silicone O-Ring 1 / 4 ID pollice, 1 / 2 pollice OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 9396K204 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Teflon tubo 1 / 4 ID pollici, 5 / 16 pollici OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 52355K14 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Kendall siringhe monoject 6cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-561-41 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> BD siringa da 3 cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Fibrinogen bovina </td><td> Sigma </td><td> F8630 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Trombina bovina </td><td> Sigma </td><td> T7513 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma </td><td> 383147 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> 0,2 micron filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> SCGVT05RE </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Filtri cellula 40 micron </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-363-547 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> 0,45 micron bottiglia filtro superiore </td><td> Corning </td><td> 430627 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> vetro pre-filtro </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 pollice di lunghezza ago </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826-5D </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Ago 21G 1 pollice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826C </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> costruire vasi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2116 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Media </td></tr><tr><td> siero di cavallo </td><td> Sigma </td><td> H1138 </td><td> Media </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> Media </td></tr><tr><td> acido aminocaproico </td><td> Acros Organics </td><td> 103305000 </td><td> Media </td></tr><tr><td> acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A5960 </td><td> Media </td></tr><tr><td> insulina </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td><td> Media </td></tr><tr><td> Paraformaldeide, il 16% </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Taglio temperatura ottimale (OCT) </td><td> Ted Pella </td><td> 27050 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> 2-metilbutano </td><td> Pescatore </td><td> 03551-4 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Topo MYH1/2/4/6 anticorpo primario </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-32732 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Coniglio connessina 43 anticorpo primario </td><td> Tecnologia delle celle di segnalazione </td><td> 3512 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Dylight 549-asino coniugato anti-topo anticorpo secondario </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratori </td><td> 715-505-151 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Dylight 488-coniugato Donke anti-coniglio anticorpo secondario </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratori </td><td> 711-485-152 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Live / Dead test </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> Analisi </td></tr></tbody></table>

encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering

Coltura di cellule in un ambiente tridimensionale tre idrogel è una tecnica importante per lo sviluppo di costrutti per l&#39;ingegneria dei tessuti e lo studio delle risposte cellulari in condizioni di coltura in vitro diverse. I tre ambiente tridimensionale più da vicino ciò che imita le cellule osservare in vivo per l&#39;applicazione di stimoli meccanici e chimici in tutte le dimensioni 1. Tridimensionale idrogel possono essere a base di polimeri sintetici come il PEG-DA PLGA 2 e 3 o una serie di proteine ​​che si verificano naturalmente come il collagene 4, 5 o acido ialuronico fibrina 6,7. Idrogel creato da fibrina, una proteina naturale coagulazione del sangue, può polimerizzare per formare una maglia che fa parte di guarigione naturali del corpo processi 8. Fibrina è cellule autologhe potenzialmente degradabile e 9, che lo rende un ideale impalcatura provvisoria per l&#39;ingegneria tissutale. Qui si descrivono in dettaglio l&#39;isolamento di cardiomiociti neonatali da tre cuccioli di ratto giorno di vita e la preparazione delle cellule per l&#39;incapsulamento nei costrutti idrogel fibrina per l&#39;ingegneria tissutale. Miociti neonatali sono una fonte di cellule comuni utilizzati per studi in vitro nella formazione del tessuto cardiaco e ingegneria 4. Fibrina gel è creato da fibrinogeno miscelazione con l&#39;enzima trombina. La trombina scinde fibrinopeptidi CQP e FPB dal fibrinogeno, rivelando siti di legame che interagiscono con altri monomeri 10. Queste interazioni causano i monomeri di auto-assemblarsi in fibre che formano la rete idrogel. Poiché i tempi di questa reazione enzimatica può essere regolata modificando il rapporto della trombina al fibrinogeno, o il rapporto di calcio con la trombina, si costruisce stampi ad iniezione con una serie di diverse geometrie 11,12. Inoltre siamo in grado di generare l&#39;allineamento del tessuto risultante dal modo in cui vincolare il gel durante cultura 13. Dopo la coltura dei costrutti ingegnerizzati tessuto cardiaco per due settimane in condizioni statiche, le cellule cardiache hanno cominciato a rimodellare il costrutto e può generare una forza di contrazione in condizioni stimolazione elettrica 6. Come parte di questo protocollo, abbiamo anche descrivere i metodi per analizzare il tessuto ingegnerizzato miocardio dopo il periodo di cultura tra cui l&#39;analisi funzionale della forza attiva generata dal muscolo cardiaco costruire su di stimolazione elettrica, così come i metodi per determinare la vitalità cellulare finale (Live-Morto saggio) e colorazione immunoistologiche per esaminare l&#39;espressione e la morfologia di proteine ​​tipiche importante per la contrazione (catena pesante della miosina o MHC) e giunto cellulare (connessina 43 o Cx43) tra miociti.

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Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Abbiamo descritto l&#39;isolamento di cardiomiociti neonatali e la preparazione delle cellule per l&#39;incapsulamento nei costrutti idrogel fibrina per l&#39;ingegneria tissutale. Ci descrivono i metodi per l&#39;analisi della ingegneria tessutale miocardio dopo il periodo della cultura tra cui forza attiva generata sulla stimolazione elettrica e la vitalità cellulare e la colorazione immunoistologiche.

Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l&#39;ingegneria tissutale cardiaca

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

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Bioengineering

24.0K Views.  Tufts University. Abbiamo descritto l'isolamento di cardiomiociti neonatali e la preparazione delle cellule per l'incapsulamento nei costrutti idrogel fibrina per l'ingegneria tissutale. Ci descrivono i metodi per l'analisi della ingegneria tessutale miocardio dopo il periodo della cultura tra cui forza attiva generata sulla stimolazione elettrica e la vitalità cellulare e la colorazione immunoistologiche.