Este trabalho foi financiado pelo Massachusetts General Hospital Departamento de Fundos de Medicina Interna (JMT, MKM, MLC, JMV), Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia conceder T32EB006348 (CEC), Centro de Massachusetts General Hospital para financiar Computacional e Integrative Biology desenvolvimento e AI062773 ( rjh), concede AI062773, DK83756, e DK 043351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), e Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) AI057999 (JMV ). Agradecemos a Nicholas C. Yoder para discussões úteis, e Charles Felts (RPI, Inc.) para obter assistência técnica.

1. Condições de cultivo de patógenos para a captura óptica <ol><li> Crescer A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) em uma mídia semi-sólido de ágar contendo SBD (Sabouraud dextrose) a 30 ° C durante 3 dias. </li><li> Crescer C. albicans (SC5314) em YPD (Yeast-peptona Dextrose) de cultura líquido contendo 100 mg / mL ampicilina durante a noite em uma incubadora shaker a 30 ° C. </li></ol> 2. Preparação de agentes patogênicos para a rotulagem fluorescentes <ol><li> Colheita desejada quantidade de patógenos e transferir para um tubo de reação 1,5 mL. </li><li> Adicionar mL 300 de tampão fosfato (PBS) ao tubo de reação. </li><li> Sonicate mistura por 30 segundos. </li><li> Centrifugar a 4000 rpm por 1 minuto. </li><li> Aspirar o sobrenadante, deixando pellet imperturbável. </li><li> Repita (2.4) e (2,5) mais duas vezes. </li><li> Ressuspender em 500μL de PBS. </li></ol> 3. Rotulagem de patógenos com corante fluorescente <ol><li> Dissolver 1 mg de corante de interesse (por exemplo, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) em 100 mL dimetilformamida (DMF) (concentração de 10 mg / mL). </li><li> Adicionar 3 mL da mistura de corante para tubos de reação contendo patógenos lavada. </li><li> Girar ou agitar amostra a 37 ° C por 1 hora. </li><li> Lavar amostra com PBS 3X por centrifugação a 4000 rpm por 1 minuto. </li><li> Ressuspender em 300 mL de PBS. </li></ol> 4. A colheita de células T do sangue total <ol><li> Obtenção de sangue total (fresco). </li><li> Sangue quente, PBS + 2% de soro fetal bovino (FBS), e Histopaque à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar CD4 + T RosetteSep Human Enrichment Cocktail celular a 50 mL / mL de sangue total. </li><li> Rode a amostra e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Diluir a amostra com igual volume de PBS + 2% de SFB e misture delicadamente. </li><li> Camada de amostra diluída em cima do Histopaque, minimizando mistura </li><li> Centrifugar por 20 minutos a 1200 xg à temperatura ambiente com o freio. </li><li> Remover as células enriquecido. </li><li> Lavar as células com PBS enriquecido 2x + solução FBS 2%. </li><li> Lisar as células vermelhas do sangue durante 2 minutos com vermelho tampão de lise de glóbulos </li><li> Adicionar 10 mL de PBS + 2% de SFB e lisadas centrífuga células vermelhas do sangue a 1500 rpm por 5 minutos </li><li> Aspirar o sobrenadante, cuidado para não perturbar o pellet </li><li> Ressuspender em media IMDM contendo 10% de soro fetal bovino </li></ol> 5. Preparação de macrófagos RAW 264,7 em slides câmara <ol><li> Prepare DMEM (meio modificado Dulbecco Eagle) para conter 10% de SFB, 1% de penicilina / estreptomicina, e 1% L-glutamina. </li><li> Media quente, tripsina e PBS em banho quente a 37 ° C. </li><li> Lavar 2x placa com PBS </li><li> Aspirar PBS entre cada lavagem. </li><li> Adicionar 5 mL de tripsina a placa de cobertura da superfície (para a 10 centímetros placa de cultura de tecidos). </li><li> Incubar por 5 min a 37 ° C. </li><li> Suavemente knock lado da placa para retirar as células da superfície da placa. Tenha cuidado para não espirrar tripsina fora do prato. </li><li> Adicionar 5 mL ou quantidade equivalente de mídia para tripsina. </li><li> Aspirar a mistura em um tubo de reação. </li><li> Centrifugar a 1000 xg por 3 minutos. </li><li> Media aspirado, cuidado para não perturbar o sedimento. </li><li> Ressuspender em 10 ml de mídia. </li><li> Adicionar 400 mL de mídia para cada uma das câmaras do slide câmara. </li><li> Adicionar 5 mL de suspensão celular para cada câmara. </li><li> Crescer durante a noite em estufa a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol> 6. Além de patógenos para amostra <ol><li> Pipete 10/05 de patógenos rotulados de interesse (dos passos 1-3) na câmara. </li><li> Misturar bem por pipetagem cima e para baixo, cuidado para não tocar o fundo da câmara de perturbar os macrófagos aderidos. </li></ol> 7. Carregamento de amostras para spinning microscópio confocal de disco (em vídeo, digitalização através de componentes) <ol><li> Ligue todos os componentes para spinning microscópio confocal de disco. </li><li> Microscópio para alinhar imagens DIC. </li><li> Remover slide câmara da incubadora. </li><li> Inserir slides em câmara de estágio especializado. </li><li> Remover topo da câmara de corrediça (necessário para geração de imagens DIC). </li></ol> 8. Preparação para a captura óptica (em vídeo, digitalização através de componentes e como ele é integrado em microscópio) <ol><li> Ligue obturador para armadilha óptica. </li><li> Ligue IR laser. </li><li> Obturador aberto (no laser) para armadilha óptica. </li><li> Confirmar obturador na frente de IR laser é fechado, verificando com cartão de IR. </li></ol> 9. Seleção e manipulação de patógeno com armadilha óptica <ol><li> Concentre-se em macrófagos no slide aderido. </li><li> Encontrar patógenos livremente flutuante em solução adjacente a macrófagos. </li><li> Mova estágio tal que o patógeno é nas proximidades da armadilha. </li><li> Obturador aberto e se engajar na armadilha. </li><li> Mova amostra para trazer macrófagos em contato com a armadilha estacionáriapatógeno ped. </li><li> Imagem com spinning microscópio confocal de disco, seja em DIC, fluorescência, ou combinação de ambos. Tipicamente, prendendo é feito em DIC, e imagens em tempo real é feita com fluorescência. </li></ol> 10. Resultados representativos: Para exercer o controle espacial e temporal total de patógenos e contas em um in vivo e in vitro ambiente, nós projetamos um aparelho de captura custom-built integrados em um microscópio confocal disco giratório (esquemático mostrado na Figura 1.). Em plena força, o laser forneceu 350 mW de potência e após o acoplamento da luz com os diversos componentes ópticos no aparelho de armadilha óptica, ~ 80 mW de potência, no objetivo TIRF, medida com um medidor de potência, foi usado para formar a armadilha na câmara. , A fim de posicionar um objeto na câmara em relação ao objeto preso, o palco foi movido, mantendo o objeto preso estável, com o laser de aprisionamento. O palco foi movido em velocidades lentas o suficiente, de modo que a força de arrasto sobre a partícula preso não exceder a força máxima armadilhas. Populações separadas de C. albicans (tamanho típico - ~ 5 mm) foram marcados com cada uma das três cores (AF488, AF568, AF647 e, correspondente ao verde, azul e vermelha na figura, respectivamente) para ilustrar de imagem com múltiplos canais de fluorescência ao mesmo tempo visualmente prendendo o patógeno. A única C. albicans foi preso e transferido em um padrão quadrado por meio de um aglomerado de outra levedura, conforme indicado pelas setas cinza, demonstrando a capacidade de capturar e manipular a localização específica de um único patógeno escolhido pelo operador mesmo em um ambiente aglomerado (Fig. 2A) . Para ilustrar ainda mais a flexibilidade deste sistema para prender as morfologias forma diferente exibido por organismos patogênicos, a pinça óptica também foi capaz de segurar e situar um C. albicans de partículas com um pseudo. O C. albicans rotulados com AF647 (vermelho) foi movido ao longo de uma trajetória descrita pela seta branca e colocado ao lado de células GFP-LC3-RAW fluorescente (Fig. 2B). A porção de fermento da C. albicans foi preso como o pseudo arrastou junto. Nós também posicionados Aspergillus fumigatus ao lado de uma célula do rato macrófagos RAW, a fim de analisar a estrutura de tempo absoluto de fagocitose com esta linha celular particular e patógeno (Fig. 3A). Uma vez que o patógeno entra em contato com a célula, a armadilha é desligado, e lapso de tempo de imagem é utilizado para observar os eventos subseqüentes celular (Fig. 3B). A armadilha óptica também foi usado para captação primária células T isoladas do sangue e dirigido adjacentes aos grânulos revestidos com anticorpo anti-CD3 para que as células T para formar uma sinapse imunológica com o talão (Fig. 4), mostram o adicional versatilidade diretamente armadilha e manipular células imunitárias. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Descrições e esquemática de armadilha óptica combinada e girando disco de instalação do microscópio confocal. Layout do instrumento mostrando o feixe de captura (roxo), caminho para a iluminação de campo claro de imagem (laranja), feixe de excitação de fluorescência (vermelho), emissão de fluorescência (verde), charge-coupled device (CCD) da câmera, elétron-multiplicando dispositivo de carga acoplado (EM- CCD da câmera), espelhos dicróicos (D1 e D2), espelhos (M1 e M2) e lentes (L1, L2, L3, L4). Todos os outros componentes do sistema de microscópio confocal armadilha são rotulados na figura. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) imagens de fluorescência de presos e manipulados C. albicans. Um preso fluorescente marcado organismo (Alexa Fluor 488 (AF488), azul) em um campo de outros C. fluorescente marcado albicans (AF568, AF647 verde e vermelho). O estágio é movido em torno da partícula presa CA, azul, conforme indicado pelas setas cinza. (B) Preso forma pseudo-hifas de C. albicans ao lado de GFP-LC3 células RAW. Fluorescente etiquetado forma psuedohyphal de CA (vermelho, AF647) opticamente preso e mudou-se junto ao GFP-LC3 expressa macrófagos RAW. O organismo CA é movido ao longo da trajetória como indicado pela seta branca. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Trapping e posicionamento de A. fumigatus ao lado de uma célula fagocitária RAW. (A) Brightfield imagens de um preso A. fumigatus, como indicado pela seta branca, movido e posicionado ao longo do caminho, como indicado pela seta vermelha. O patógeno é preso ligeiramente fora de foco devido à armadilha empurrando o organismo ligeiramente acima do plano focal. A. fumigatus é movido até que ele é colocado ao lado da célula desejada RAW. (B) Fluimagem orescence de fagocitose de A. fumigatus por célula RAW. Após o patógeno preso é colocado próximo a uma célula RAW, o processo de fagocitose é ativado. Em 30 s, a membrana da célula RAW começa a mudar e formar um copo ao redor da partícula. Em 60 s, o copo está completamente formado. De 90 a 150s, a A. fumigatus é engolida, e por 180 s, a partícula é totalmente internalizado <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Trapping primários de células T para formar sinapses com anti-CD3 grânulos revestidos. DIC imagens de um primário de células T movido pela armadilha óptica para uma posição ao lado de um cordão revestido com anticorpo anti-CD3. A célula, então, forma uma sinapse imunológica, que não pode ser facilmente percebido nas imagens.

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	<li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity:+Learning+on+the+fly.">Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+neutral+particles+using+lasers.">Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+and+trapping+of+particles+by+radiation+pressure.">Acceleration and trapping of particles by radiation pressure.</a> Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).</li><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria+Science.">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science.</a> Nature. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+M13+bacteriophage+tethering+and+stretching.">Single M13 bacteriophage tethering and stretching.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin's+cover-neck+bundle+folds+forward+to+generate+force.">Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force.</a> Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+tether+formation+from+outer+hair+cells+with+optical+tweezers.">Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers.</a> Biophys J. , 1386-1395 (2002).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;&#946;+T+cell+receptor+is+an+anisotropic+mechanosensor.">The &#945;&#946; T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.</a> J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).</li><li>Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+interaction+of+RBC+with+optical+tweezers.">Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers.</a> Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).</li><li>Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+manipulation+of+pathogens+with+an+optical+trap+for+live+cell+imaging+of+intercellular+interactions.">Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.</a> PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).</li><li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+case-fatality+rate:+Systematic+review+of+the+literature.">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li><li>Wey, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hospital-acquired+candidemia+-+the+attributable+mortality+and+excess+length+of+stay.">Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay.</a> Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste trabalho nós usamos uma armadilha óptica para capturar patógenos com dimensões entre 3 mm - 5 mm. Apesar de patógenos de interesse para o nosso laboratório normalmente têm estas dimensões, o sistema de pinça óptica aqui descrito é flexível para capturar uma grande variedade de tamanhos. Na verdade armadilhas ópticas têm sido usados ​​para capturar partículas que variam de átomos individuais para as células de aproximadamente 10 m de diâmetro. Além disso, este sistema de captura óptica foi c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> Tensão Albino, B-5233/RGD12-8, dom de KJ Kwon-Chung, NIH </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50-B mutante, presente de Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 tensão, presente de Gerald Fink, Whitehead Institute </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> dimetilformamida </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Sangue fresco </td><td></td><td></td><td> Dom de RJW Heath, MGH, HMS </td></tr><tr><td> Nikon microscópio invertido </td><td> Nikon </td><td></td><td> Modelo Ti-E </td></tr><tr><td> Laser de aprisionamento, ChromaLase </td><td> Pesquisa Blue Sky </td><td> CLAS-106-STF02-02 </td><td></td></tr><tr><td> Laser de excitação de fluorescência </td><td> Coerente </td><td></td><td> Innova modelo 70C </td></tr><tr><td> Breadboards para componentes armadilhas </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> Mesa de ar óptica </td><td> Técnico Manufacturing Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Obturador eletrônico com controle de pedal </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> Comprado de Vincent Associates, Rochester, NY </td></tr><tr><td> Fibra óptica monomodo </td><td> Oz Optics </td><td> PMJ-3S3S-1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> Posicionador de fibra </td><td> Thorlabs </td><td> PAF-X-5-C </td><td></td></tr><tr><td> Colimador de fibra </td><td> Oz Optics </td><td> HPUCO-23-1064-P-25AC </td><td></td></tr><tr><td> Lentes para o telescópio </td><td> Thorlabs </td><td> AC254-150-B </td><td> Distância focal de 150 mm </td></tr><tr><td> Estágios de tradução (x, y, z) </td><td> Newport </td><td> M-461-XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR dichroic espelho </td><td> Chroma </td><td> ET750-sp-2p8 </td><td></td></tr><tr><td> Lente objetiva (100X) </td><td> Nikon </td><td></td><td> NA = 1,49, imersão em óleo, o objetivo TIRF </td></tr><tr><td> Cabeça confocal </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-XI </td><td></td></tr><tr><td> Polarizador </td><td> Nikon </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> Wollaston prisma </td><td> Nikon </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM-câmera CCD </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td></td></tr><tr><td> CCD da câmera (ORCA ER) </td><td> Hamamatsu </td><td> C4742-80-12AG </td><td></td></tr><tr><td> Roda de filtros </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> Roda de filtros </td><td> Sutter </td><td> LB10-NWE </td><td></td></tr><tr><td> Chambered lamela </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111-51D </td><td> Revestidas com anti-CD3 </td></tr><tr><td> Meio modificado Dulbecco Águia (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

Imagens de células ao vivo dinâmica permite a visualização direta de tempo-real interações entre as células do sistema imunitário 1, 2, no entanto, a falta de controle espacial e temporal entre a célula fagocítica e micróbio tornou foco observações sobre a interação inicial de resposta do hospedeiro a patógenos difícil. Historicamente, os eventos de contato intercelular tais como fagocitose 3 foram fotografadas pela mistura de dois tipos de células, e depois continuamente digitalização do campo de visão para encontrar serendipitous contatos intercelulares no estágio apropriado de interação. A natureza estocástica desses eventos torna este processo tedioso, e é difícil de observar eventos cedo ou fugazes em contato célula-célula por esta abordagem. Este método requer encontrar pares de células que estão à beira de contato, e observá-los até que entre em contato com consumado, ou não. Para lidar com essas limitações, nós usamos a captura óptica como um método não invasivo, não-destrutivo, mas rápido e eficaz para a posição células em cultura. Armadilhas ópticas, ou pinças ópticas, estão cada vez mais utilizados em pesquisa biológica para capturar e manipular fisicamente as células e outros micro-empresas partículas em três dimensões 4. Pressão de radiação foi observada pela primeira vez e aplicada a sistemas de pinça óptica em 1970 5, 6, e foi usado pela primeira vez para controlar espécimes biológicos em 1987 7. Desde então, a pinça óptica amadureceram em uma tecnologia para sondar uma variedade de fenômenos biológicos 13/08. Nós descrevemos um método de 14 que avanços ao vivo imagens de células através da integração de uma armadilha óptica com spinning microscopia confocal de disco com controle de temperatura e umidade para fornecer controle espacial e temporal requintada de organismos patogênicos em um ambiente fisiológico para facilitar a interação com células hospedeiras, como determinado pelo operador. Live, organismos patogênicos, como Candida albicans e Aspergillus fumigatus, que pode causar potencialmente letal, infecções invasivas em indivíduos imunocomprometidos 15, 16 (por exemplo, AIDS, quimioterapia e transplante de órgãos doentes), foram presos opticamente usando intensidades não-destrutivo a laser e mudou-se junto ao macrófagos, o que pode fagocitam o patógeno. De alta resolução, transmitido filmes de luz e de fluorescência baseada estabelecida a capacidade de observar os primeiros eventos de fagocitose em células vivas. Para demonstrar a ampla aplicabilidade em imunologia, principais células T também foram presos e manipulados para formar sinapses com anti-CD3 microesferas revestidas in vivo, e lapso de tempo de imagem de formação de sinapses também foi obtida. Ao fornecer um método para exercer o controle de patógenos espaciais bem viver com respeito às células imunológicas, as interações celulares podem ser capturados por microscopia de fluorescência com perturbação mínima para as células e pode render uma visão poderosa em respostas iniciais de imunidade inata e adaptativa.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Um método é descrito para selecionar individualmente, manipular e patógenos imagem ao vivo usando uma armadilha óptica acoplada a um microscópio disco giratório. A armadilha óptica fornece controle espacial e temporal dos organismos e os coloca ao lado células hospedeiras. Microscopia de fluorescência captura dinâmica interações intercelulares com perturbação mínima para as células.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K visualizações.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Um método é descrito para selecionar individualmente, manipular e patógenos imagem ao vivo usando uma armadilha óptica acoplada a um microscópio disco giratório. A armadilha óptica fornece controle espacial e temporal dos organismos e os coloca ao lado células hospedeiras. Microscopia de fluorescência captura dinâmica interações intercelulares com perturbação mínima para as células.

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Imunologia e Infecção

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

Fabricação de superfícies de vidro de qualidade óptica para estudar a fusão do macrófago

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...