Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation, o McKnight Endowment Fund for Neuroscience, o Christopher Reeve e Dana Foundation e Fundação Amerisure Charitable.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Existem várias boas discussões de microcirurgia laser com sistemas de laser diferentes 3,5-11. Lasers de femtossegundos IR são o &quot;padrão ouro&quot; para ablação a laser subcelulares 12 e conveniente se associado a um mecanismo de imagem, mas são muitas vezes demasiado caros para usuários individuais. Se você precisar de um laser de femtossegundos IR para imagens de sua amostra por causa da profundidade da imagem, então você provavelmente precisará de um para o laser axotomia. Tecidos transparentes com axônios alvo dentro de 30-50 hum da superfície são provavelmente viável com lasers de pulso azul e verde na faixa de 20 UJ / pulso direcionados através de uma lente de alta imersão na. Haverá mais danos colaterais com o nano e pico lasers segundo em comparação com o laser de femtossegundos, especialmente como a profundidade dos aumentos axônio alvo. C. elegans é transparente e todos os axônios estão dentro de 20-30 hum da superfície. Rotineiramente corte axônios motores que são dentro de 5 hum da superfície. Temos também facilmente cortar machadoons dentro do anel nervosas que são cerca de 20 hm a partir da superfície da cutícula. Encontramos o limite para o corte de axônios em cerca de 30-50 hum através do diâmetro de um verme adulto. É provável que o sistema de ablação a laser descrita aqui seria muito bem com muitas preparações diferentes que se ajustam aos critérios de transparência e profundidade de axônios alvo. Ainda assim, é um pouco surpreendente, dadas as vantagens teóricas dos lasers de femtossegundos IR, que nano e picosegundo 355 nm e 532 nm lasers executar tão bem para o laser axotomia em C. elegans 6,13. Não vemos diferenças na regeneração do axônio em resposta ao laser axotomia com nanossegundo 440 nm, 532 nm nanossegundo, e lasers de femtossegundos IR. Lasers de estado sólido 355 nm UV são sobre o mesmo custo que o diodo de 532 nm bombeado passivamente Q-Switched laser de estado sólido, mas exigem poderes para mais ou ótica que passam de forma eficiente estes comprimentos de onda mais curto. A maioria das ópticas são projetados para um bom desempenho com 400 visível -700 nm de luz. 355 nm lasers ofereceria algumas vantagens, tais como limiar 6 plasma reduzido, menor tamanho do local, e um passe longo dichroic seria eficiente direta de 100% do laser ablação para o alvo e permitir gravação simultânea de GFP sem perda de sinal da amostra. 440 nm lasers azuis manteria as vantagens de trabalhar com um laser de luz visível (o bom desempenho com a óptica padrão e de segurança). Infelizmente, o custo de um DPP Q-switched de estado sólido de 440 nm do laser é 3 vezes o custo de um laser de 355nm ou 532 nm de poder similar neste momento. Se nós estivéssemos projetando um novo sistema para C. elegans, onde a profundidade-alvo é mínima, poderíamos optar por uma lente UV transparente (custou cerca de US $ 3.000 para uma lente de óleo 40X 1.3na com 50-70% de transmitância em 355nm) e um laser de 355 nm produzindo UJ 10/05 / pulso a 1 kHz -20. Ablação axônio é pensado para ser devido à formação de plasma. Pulsos curtos produzirá limiares plasma em baixa potência e os volumes de plasma w<html> doente ser menor 6. O objetivo é produzir o plasma menor e mais curto de vida, ajustando a energia de pulso para o menor poder. Maiores de longa duração plasmas irá gerar bolhas de cavitação que os danos que envolve as células. Temos encontrado geralmente que a ablação utilizando cerca de 50-100 pulsos na freqüência mais alta (isto é, 2,5 kHz) dá os melhores resultados. Isto sugere que os danos podem ser gradualmente integrada sobre uma série de pulsos para controlar melhor a extensão dos danos. O sistema de ablação a laser descrita aqui é muito perdoar se o feixe esteja alinhado e expandido com precisão. Começamos corte axônios em vermes adultos em potência do laser de 10% (média de 0,3 mW medido em 2500 Hz e cerca de 1 UJ / pulso) e pode cortar com danos localizados limitada pelo poder de 14%. Você pode observar áreas maiores de dano 15-39% de potência do laser, mas só acima do poder de 40% (cerca de 1 MW médios medidos em 2500 Hz) fazer o worms explodir devido a bolhas de cavitação e grandes danos à cutícula do verme. e_content &quot;&gt; O Steinmeyer et al. 2010 de papel 2 é um excelente recurso para a construção de um sistema de ablação por laser. Leon Avery também tem uma boa descrição prática de um sistema de ablação a laser baseado em um laser de gás N2 barato nm 337 e ele fornece algumas práticas grande conselho (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Ao projetar seu próprio sistema você deve primeiro conversar com o seu representante microscópio para determinar como alvo o laser ablação para a objetiva do microscópio. Seu microscópio deve ser montado sobre uma mesa de isolamento de vibração (Newport, TMI, Thor). A top breadboard é o ideal, mas uma parte superior de aço sólido ainda pode ser usado com posicionadores magnético. Um módulo dedicado intermediário em um escopo de pé é bom porque todos os elementos ópticos podem ser deixados no local. No entanto, ele pode ser menos caro e mais conveniente usar uma porta da câmera (invertido) ou um &quot;combinador&quot; ligado a uma porta de epi-fluorescente. Você precisa saber o tamanho da abertura para trás e para a transmissão (ao um<html> blation laser de comprimento de onda) da lente objetiva que você pretende usar. Depois de decidir sobre um laser (por exemplo, Crylas, TEEM, Crystal, ou CRC), você deve entrar em contato Thor ou Newport para ajudar com a seleção correta dos elementos ópticos, equipamentos de hardware e segurança. Decidimos em um expansor de feixe duplo de Galileu para economizar espaço, mas uma simples expansão de Kepler é uma opção (f2/f1 = fator de expansão). Um expansor de feixe personalizado será menos caro, mas Newport, Thor, e vários dos fabricantes de laser oferecem uma excelente qualidade comercial feixe de expansores. Alguns fabricantes também oferecem a laser atenuadores manual e eletronicamente controlado, que pode ser rentável e economia de espaço, mas não tão versátil como o polarizador Glan-Thompson e placa de meia onda. Você também precisa decidir como controlar a laser. Você pode projetar um controlador baseado em LabView, use um gerador de TTL comercial, ou software fornecido pela empresa laser. Discutir as opções com o fabricante de laser específico. tenda &quot;&gt; Nós fornecemos uma lista de hardware que temos usado apenas como um guia geral. O sistema descrito aqui custa cerca de $ 15.000, quando adicionado em nosso sistema de imagem existente. O departamento de Física locais, muitas vezes, tem alguém disposto a oferecer uma introdução prática ao com segurança trabalhando com lasers de feixe livre. Métodos alternativos para imobilização e lapso de tempo de imagem de C. elegans foram recentemente descritos. 14 Solução de problemas O passo mais difícil e crítica é o alinhamento do feixe centrado expandiu-se para o eixo óptico do microscópio. Depois de ter o feixe centrado e expandido através das lentes de Galileu que você deve trabalhar duro para obtê-lo alinhado dentro de 5 de hum eixo óptico do microscópio ANTES de usar os espelhos de direcção para o alinhamento final para o centro. Uso excessivo dos espelhos de direção para alinhar o feixe para o microscópio vai movê-lo fora do eixo através do feixeexpansor. USANDO EXTREMO CUIDADO você pode atenuar o feixe de laser com o filtro ND apropriado e visualizar diretamente o perfil de feixe de laser sobre um alvo refletivo (espelho de superfície frontal). Você pode gentilmente empurrar o microscópio com precisão centro do feixe no campo objetivo 60X de vista (se ele não pode ser centrada para cima / para baixo faixa que você precisa para ajustar a altura do trilho). O perfil do feixe pode ser usado para alinhar precisamente o eixo microscópio óptico para dar um feixe centrado que é circular e &quot;flares&quot; simetricamente. Um alargamento assimétrico é uma indicação de que o eixo do microscópio não está perfeitamente alinhado (ou o trilho não é nível). Finalmente, você deve ajustar L3 e ver uma expansão ainda e simétrica e contração do feixe. O foco do microscópio precisamente sobre a superfície do alvo e depois ajustar L3 para focar o feixe de laser para o menor ponto. Agora você deve achar que o feixe de laser é dentro de 5 hum do centro quando fotografada através LSCM ou sistema CCD eo local está dentro de ablação1um de foco Z. Se você achar que você está &quot;explodindo&quot; worms ou consistentemente gerar bolhas de cavitação grande para cortar axônios seu problema é mais provável que o alinhamento fino do laser de ablação. Certifique-se que o mínimo (&lt;500nm) no local da ablação é localizada ao foco Z (ajustar a convergência com L3 lente) e para o local XY fiduciária (ajustar com espelho cinematicamente montado passado). Segmentação axônios mais perto da superfície vai exigir menos energia laser. Da mesma forma, animais menores (L1 e L2) irá requerer menos energia do laser para axotomia em comparação com a segmentação dos axônios mesmo em adultos. Se o seu axônios de tipo selvagem não se regeneram ou a lixívia axônios você deve tentar reduzir a potência do laser de imagens ou diminuindo a taxa de amostragem. Se o seu worms morrem ou ficam doentes tente reduzir o percentual Agarose em passos de 1%. Verifique se você não está movendo a lamela após worms montagem como esta, muitas vezes, levá-los a morrer ao usar alta porpercentual de agarose e microesferas. Se o seu worms estourar ou morrer durante uma sessão de lapso de tempo é devido a: 1. Percentual de agarose é muito alto. 2. Danos à cutícula ablação por laser. 3. Movimento de lamela após a montagem. Em caso de danos à cutícula é a culpa será só afetam worms montada que têm sido alvo com o laser de ablação. Se o seu verme se move muito durante uma sessão de lapso de tempo tentar aumentar o percentual de agarose em passos de 0,5%. Axônios saudável em vermes saudáveis ​​são sempre &quot;ativo&quot; e apresentar um nível consistente de fluorescência. Se você ver uma diminuição súbita da fluorescência ou atividade do worm está morrendo ou morto. Múltiplos axônios de contas ou fragmentados são um sinal certo de um worm morrendo ou morto. Se você tiver problemas para manter seus axônios em foco durante toda a sessão lapso de tempo, pode haver vários problemas diferentes. Primeiro verifique a sua fase de drift por imagem uma amostra inerte sobre uma lâmina de vidro com mais de 10 hrs. A deriva poucos microns pode ser devido à instabilidade térmica, mas superior a 5 hum é provavelmente devido a problemas mecânicos com seu microscópio. Problemas com a montagem são mais comuns. Deixe sua worms montado equilibrar com o seu estágio do microscópio por 30 minutos antes de iniciar o seu lapso de tempo. Verifique se o seu selo vaselina não desenvolveram vazamentos durante o curso de sua sessão de lapso de tempo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> 535 nm Laser </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (TEEM, Crystal, e CRC também oferecem lasers comparáveis) </td></tr><tr><td> Todos os óptica e hardware </td><td></td><td></td><td> (Thor oferece ópticas comparáveis ​​e hardware) </td></tr><tr><td> SUPREMA Optical Monte, de 1,0 de diâmetro </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Um &quot;post de diâmetro, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;fork pós diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromática Zero Order-Placa Wavel, ½ Retardo Wave, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Estágio de rotação, 1 Abertura &quot; </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;post de diâmetro, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;fork pós diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Polarizador Calcita, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polarizador de rotação Monte </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;espaçador para um&quot; post diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;de altura, um&quot; post diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Garfo, uma pós &quot;de diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Dump feixe </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Microscópio Objetivo Montagem de Lente </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;post de diâmetro, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Um &quot;fork pós diâmetro </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Nd: YAG laser Mirror, 25,4 mm de diâmetro, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA Optical Monte, 1.0 polegadas de diâmetro, furo espaço de montagem </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> High Precision Parafuso de Ajuste Knob, 12,7 milímetros de viagens, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Adaptador de rosca, ¼ do sexo masculino -20, 8-32 feminino </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod Grampo para haste de 1,5 polegadas de diâmetro </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, de 14 polegadas (35,5 cm) de altura </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Transportador ferroviário para X26 duração quadrados, 40mm </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Aço Rail, 384 milímetros de comprimento (15 &quot;) </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rod Plataforma de 1,5 polegadas de diâmetro da haste </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, de 14 polegadas (35,5 cm) de altura </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Concave Lens, 12,7 milímetros de diâmetro, EFL-25mm, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Convexo Lens, 25,4 milímetros de diâmetro, 50,2 milímetros EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plano-Convexo Lens, 25,4 milímetros de diâmetro, 62,9 milímetros EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Montagem de Lente fixa de 0,5 &quot;de diâmetro, 1,0&quot; de altura Axis </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Montagem de Lente fixa, 1,0 &quot;de diâmetro, 1,0&quot; de altura Axis </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Microesferas 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> Assuntos EEO </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Laser axotomia seguido por microscopia de lapso de tempo é um ensaio sensível para a regeneração do axônio fenótipos em C. elegans 1. A principal dificuldade deste ensaio é o custo percebido (US $ 25-100K) e conhecimentos técnicos necessários para a implementação de um sistema de ablação a laser 2,3. No entanto, lasers de estado sólido de pulso de custos modestos (&lt;$ 10K) pode fornecer um desempenho robusto para ablação a laser em preparações transparente, onde os axônios alvo são &quot;próximas&quot; à superfície do tecido. Construção e alinhamento de um sistema pode ser realizado em um dia. O caminho óptico fornecido pela luz do condensador focado para o laser de ablação fornece um guia de alinhamento conveniente. Um módulo intermediário com todos os óptica removido pode ser dedicado a ablação a laser e garante que nenhum dos elementos ópticos precisam ser movidas durante uma sessão de ablação por laser. A dicróicas no módulo intermediário permite gravação simultânea e ablação a laser. Centralizar o feixe de laser to feixe de saída a partir da lente focada microscópio condensador orienta o alinhamento inicial do sistema. A variedade de lentes são usadas para condicionar e expandir o feixe de laser para encher a abertura parte de trás da lente objetiva escolhido. Alinhamento e ensaios finais é realizada com uma superfície espelhada frente alvo lâmina de vidro. Potência do laser é ajustada para proporcionar um ponto de ablação tamanho mínimo (&lt;1um). O local da ablação é centrado com ajustes finos do espelho última cinematicamente montado para uma mira fixa na janela de imagem. Laser de energia para axotomia será de aproximadamente 10X maior do que o necessário para o ponto mínimo de ablação no slide-alvo (isto pode variar com o destino que você usa). Worms pode ser imobilizado por laser de axotomia e lapso de tempo de imagem através da montagem de blocos de agarose (ou em câmaras microfluídicos 4). Almofadas de agarose são facilmente feitas com 10% de agarose em solução salina equilibrada derretido em um forno de microondas. Uma gota de agarose fundida é colocado numa lâmina de vidro e achatado com outrolâmina de vidro em um bloco de cerca de 200 um de espessura (uma única camada de fita de tempo em lâminas adjacentes é usado como um espaçador). A &quot;Sharpie&quot; cap é usado para cortar um bloco de diâmetro uniforme circular de 13mm. Anestésico (1ul Muscimol 20mM) e microesferas (Chris comunicação fang Yen-pessoais) (2,65% 1ul Poliestireno 0,1 hm em água) são adicionados ao centro do painel seguido de 3-5 worms orientados para que eles estão mentindo em seus lados esquerdo. A lamela de vidro é aplicada e depois vaselina é usada para selar a lamela e evitar a evaporação da amostra.

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Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomia seguido por lapso de tempo de gravação é uma maneira sensível ao ensaio os efeitos das mutações no<em&gt; C. elegans</em&gt; Sobre a regeneração do axônio. A alta qualidade, mas barato, laser sistema de ablação pode ser facilmente adicionado a maioria dos microscópios. Lapso de tempo de imagem mais de 15 horas exige imobilização cuidadosa do worm.

Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

constructing-low-budget-laser-axotomy-system-to-study-axon

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

15.3K visualizações.  University of Utah. Laser axotomia seguido por lapso de tempo de gravação é uma maneira sensível ao ensaio os efeitos das mutações no C. elegans Sobre a regeneração do axônio. A alta qualidade, mas barato, laser sistema de ablação pode ser facilmente adicionado a maioria dos microscópios. Lapso de tempo de imagem mais de 15 horas exige imobilização cuidadosa do worm.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

Um sistema experimental para estudar Mecanotransdução em células do pulmão fetal

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

Estudo quantitativo de locomoção livremente Natação Micro-organismos Usando Difração Laser

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

Medição da tensão Lançamento Durante Laser Induced Axon lesão axonal Avaliar Adesão ao substrato em piconewton e resolução de milissegundos

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Imagem fotoacoustic de pequeno animal de varredura dupla raster-scaning para visualização vascular

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...