Agradecemos Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello e Karl Spuhler para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Faculdade Vassar Graduação Pesquisa Summer Institute (URSI), Maynard Lucy Fundo de Investigação salmão eo prêmio NASA # NX09AU90A, National Science Foundation Centro de Excelência de Pesquisa em Ciência e Tecnologia (NSF-CREST) ​​prêmio # 0630388 e da NSF prêmio # 1058385.

1. C. elegans Preparação para Análise de Vídeo <ol><li> Mova 10-20 nemátodos adultos grávidos para placas de agar fresco NGM cheios de Petri, utilizando um fino fio achatado picareta platina. As placas de Petri cheio com o agar NGM conter uma pequena mancha circular de E. coli (estirpe um crescimento limitado, OP50, dá os melhores resultados) para os nematóides para comer. Permitir que os nematóides para colocar ovos de 3-5 horas e, em seguida, remova os adultos, estabelecendo assim uma cultura pequena, developmentally sincronizado de 50-150 nematóides. Permitir que os nemátodos a crescer até à idade adulta precoce, incubando as placas de Petri a 20 ° C durante 4-5 dias. Estes métodos baseiam-se na cultura de procedimentos estabelecidos (Stiernagle 2006) 5. </li><li> No dia da análise de vídeo, lavar a placa de nemátodos adultos jovens com 1 ml de água desionizada destilada, recolhendo assim 50-150 vermes da cultura sincronizados. Uma solução tampão M9 ou PBS como também pode ser usado. Use uma microcentrífuga para girar a wORMs para a parte inferior do tubo, ou que permitam a resolver pela força da gravidade para cerca de 15 min. Remover a maior parte da água a partir do tubo e substitui-la com 1 ml de água desionizada destilada, a fim de lavar as bactérias que aderem a partir dos nematóides. </li><li> Transferir nematóides em água ou tampão para uma cuvette de quartzo utilizando uma micropipeta. É importante trabalhar com um número pequeno, a cerca de 5-10 nemátodes no total de uma só vez ou até mesmo menos, de modo que um nemátodo de cada vez é susceptível de ser iluminada pelo laser. Se o número de nemátodos sobre as placas de cultura é muito grande, os vermes diluir em água ou tampão até uma densidade desejada seja atingida. Também é possível escolher os nemátodos individuais para uma gota de água ou tampão numa placa de ágar fresco para lavá-los e transferir vermes individuais para a cuvete. Em nosso estudo, foram utilizados 1 mm, 2 mm e 5 mm para tamanhos cuvete examinar os efeitos de restrições físicas em nadar comportamento. </li></ol> 2. Configuração ópticos para a Analysi vídeos <ol><li> Faça a configuração como mostra a Figura 1, usando um 543 nm (verde) Hélio-Neon (HeNe) laser, dois espelhos frente da superfície de alumínio, um detentor cuvete, uma tela de projeção, e uma câmera de alta velocidade (Casio High Speed ​​Exilim) capazes de filmar em ~ 240 fps. Os dois espelhos são usados ​​para dirigir o feixe de laser através da cuvete. Os tamanhos diferentes de cuvetes pode ser utilizado, dependendo da natureza do estudo. Como um exemplo, utilizou-se cuvetes que 5 mm de espessura para mostrar os efeitos de limitações espaciais em frequências de natação. O feixe de laser deve satisfazer os requisitos de sobreamostragem,. Isto é, o organismo deve obstruir não mais do que um terço do raio laser. Para C. elegans, o feixe de laser deve ser de cerca de 2 mm de diâmetro quando ele interage com um nemátodo. O feixe de laser não deve ser maior do que 5 mm de diâmetro uma vez que o padrão de di fracção será difícil de localizar. A distância a partir do organismo de difração para a tela deve ser muito maior do queo próprio organismo. </li><li> Parafilme lugar sobre a parte superior da cuba e inverter para misturar os nemátodos na coluna de água. Coloque a cuvete num suporte de cuvete de modo a que os vermes são inicialmente perto do topo do cadinho. Usando os espelhos, dirigir o feixe de laser através do centro da cuvete. Uma vez que os nemátodes são mais densos do que a água, que vai lentamente cair para o fundo da tina, enquanto que, ao mesmo tempo nadando na coluna de água. </li><li> Na tela de projecção de cor, a mancha correspondente ao feixe laser transmitido negro para diminuir a dispersão do que o feixe transmitido se encontra com o ecrã de projecção (Figura 2). Alternativamente colocar uma abertura no ecrã de projecção para permitir que o feixe transmitido para passar através da tela. Eliminar ou reduzir a dispersão do feixe transmitido irá manter a matriz CCD da câmara de saturação em função do feixe transmitido. </li><li> Para capturar uma medida do tamanho do padrão de difracção, desenhar uma linha decerca de 5 cm no ecrã de projecção ao lado do ponto de laser de feixe transmitido, sem interferir com a imagem de luz difractada. </li><li> Iniciar a gravação com a câmera enquanto a luz do quarto está no modo que a linha de 5 cm é sobre a mesma metragem como as imagens de difração. Desligue a luz da sala. Gravar imagens de difração na tela com a câmera como vermes passam pelo feixe de laser. </li></ol> 3. Preparação de dados de vídeo <ol><li> Instale o programa de vídeo análise (Logger Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> ) no computador. Importe o vídeo para programa de análise de vídeo </li><li> Definir a origem de forma a coincidir com o ponto de laser transmitido. Defina a escala usando a linha de 5 cm na tela de projeção. </li><li> Controlar o deslocamento angular da imagem de difracção formado por cada nemátodo usando o software de análise de vídeo (figura 3) </li><li> Para encontrar o angular deslocamento tomando o arctan (y / x), copiar e colar dados em uma planilha eletrônica (Excel) e adicionar 180 graus ou π para todos os ângulos negativos para produzir um gráfico contínuo (Figura. 4). </li></ol> 4. Real Time de Aquisição de Dados para a observação instantânea de Frequências Natação <ol><li> Usando a mesma configuração como para a análise de vídeo, coloque um fotodíodo (DET10A de Thorlabs) com uma área pequena (~ 1 mm 2) para fora do centro do padrão de difracção em frente do ecrã de projecção. </li><li> Conecte o fotodiodo para o osciloscópio digital (PicoScope feito por tecnologia Pico) que se conecta ao computador via porta USB. Observar os padrões thrashing na tela do computador. </li><li> Salvar conjuntos de dados adquiridos em formato ASCII ou texto. </li></ol> 5. Análise de Dados <ol><li> Importe os dados adquiridos através de vídeo ou o fotodiodo em um programa de análise de dados capaz de encaixe onda qui-quadrado de minimização. O programa usado aqui é Origem ( <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). Traçar uma curva sinusoidal para determinar a freqüência goleada (Figuras 4 e 5). </li><li> Média de freqüências de natação de várias amostras e determinar variância. Para este estudo, os dados foram analisados ​​estatisticamente utilizando uma ANOVA factor único seguido pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. Um valor de p &lt;0,05 foi considerado estatisticamente significativo. </li></ol> 6. Modelo Padrões de difração usando Mathematica como Exemplo Nota: os padrões de difração pode ser modelada utilizando diversas ferramentas computacionais. Este procedimento será diferente para diferentes ferramentas computacionais, como MatLab, Excel, origem, etc <ol><li> Criar Imagem: Tire fotos de nematóides em uma lâmina de microscópio utilizando um microscópio tradicional. </li><li> Binarize imagem: Importar &#39;Verme&#39; a imagem verme into Mathematica, arrastando a imagem em Mathematica. Converter a imagem em uma imagem em preto e branco (binarize). Isto pode ser conseguido com o &#39;Binarize&#39; comando em Mathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [Worm]. A imagem pode ser vista como uma imagem em preto e branco. Como alternativa, use o comando &#39;EdgeDetect&#39; para criar uma BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], onde os dois números finais controlar a aspereza das bordas resultantes. </li><li> Converter a imagem em uma matriz de zeros e uns: Isso pode ser alcançado com o &quot;ImageData &#39;comando no Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> Transformada de Fourier matriz: Use o comando &quot;Fourier&quot; em Mathematica para Fourier transformar a matriz usando as FourierParameters indicados: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> Módulo quadrado da matriz para obter a matriz de difração e melhorar o contraste da imagem: Praça do absolutovalor da matriz e visualizar a imagem resultante, que é o padrão de difracção correspondente à imagem original. Além disso, usar o &#39;Log&#39; função para escalar o contraste da imagem: ImageContrast = Imagem [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5]. </li><li> Redimensionar a imagem para facilitar a visualização: Cortar o padrão de difração central e redimensionar como desejado: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li> Comparar os padrões de difração modelados com padrões de difração obtidos de vermes livremente natação. (Figura 6) </li></ol>

<ol>
	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós desenvolvemos uma nova abordagem para a medição em tempo real, de circulação e de comportamentos simples locomotor em organismos microscópicos como nemátodos que não requer a utilização de microscópios. 8 Esta abordagem metodológica também poderiam ser utilizados para o estudo de vários organismos microscópicos como protistas. Este método só é limitada pelo comprimento de onda da luz utilizada. O organismo não deve ser menor do que o comprimento de onda da luz. Além da economia de custos e a portabilidade do equipamento necessário, uma vantagem desta abordagem é a possibilidade de medir o comportamento em tempo real e em três dimensões, sem as limitações estreitas de planos de imagem sob um microscópio. É também possível com esta técnica para examinar influências das forças gravitacionais ou numerosas outras condições de comportamento que não podem ser estudados utilizando as abordagens baseadas em microscópio. 9 Assim, pode-se obter uma melhor compreensão do microorganismo natural, locomotora comportaviors libertados a partir dos limites de gotículas de lâmina de microscópio ou câmaras especializadas microfluídicos (Park et al, 2008). 10 A falta de informação de fase num modelo de difracção não permite a recuperação directa de a imagem correspondente ao objeto difração desde que o padrão de difracção de campo distante é proporcional ao quadrado do valor absoluto da transformada de Fourier. Estamos portanto calcular padrões de difracção a partir de imagens de vermes de modo que possam ser comparados com os padrões de difracção de nemátodos livremente natação (Figura 6). Este método produziu resultados para realmente nadar livremente C. elegans e pode ser aplicado a qualquer espécie microscópicos que manobras em um ambiente opticamente transparente como a água ou diversas soluções iónicas. Microscópios convencionais só permitem estudos com uma profundidade focal da ordem de micrômetros. 11 Isto é devido à limitadaprofundidade de campo quando o foco de luz: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> em que o número f-N tem uma relação de reciprocidade com o círculo de confusão (c) de modo que uma distância focal curta está associado a uma grande c. 12,13 Embora este método de difracção não é certamente um substituto para microscopia convencional, é capaz para fornecer resultados quantitativos rapidamente, de modo que mesmo as espécies podem ser manipulados em tempo real a baixo custo. Os padrões de difracção pode ser obtida com qualquer ponteiro laser. Os padrões de difração pode ser filmado em uma resolução reduzida temporal utilizando uma câmera digital comum. Enquanto o usuário não pode ter um microscópio ou um fotodiodo prontamente disponíveis, as peças-chave deste experimento, como medir freqüências debulhando e avaliar os padrões de difração pode ser concluída a um custo extremamente baixo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> 543 nm Laser HeNe </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> Qualquer laser na gama do visível, com menos do que 5 mW pode ser usado. </td></tr><tr><td> 2 Os espelhos de alumínio superfície frontal </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> High Speed ​​Exilim Câmara </td><td> Casio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Quartzo Cuvette </td><td> Células Starna </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (Software) </td><td> Vernônio </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> Volfrâmio </td><td></td><td&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

Solo e organismos microscópicos aquáticos vivem e se comportam em um ambiente tridimensional complexa. A maioria dos estudos de comportamento organismo microscópico, pelo contrário, foram realizados utilizando microscópio abordagens, que limitam o movimento e comportamento de um estreito campo quase bidimensional focal. Uma Apresentamos uma nova abordagem analítica que fornece em tempo real A análise de livremente nadar C. elegans num cuvete sem dependência de equipamento microscópio baseada. Esta abordagem consiste em acompanhar a periodicidade temporal de padrões de difração gerados por direcionar a luz de laser através da cuvete. Medimos freqüências de oscilação para os nematóides livremente natação. Análise dos padrões de difracção de campo distante revela pistas sobre as formas de onda dos nematóides. Difração é o processo de dobragem de luz em torno de um objecto. Neste caso, a luz é difratada pelos organismos. As ondas de luz interferem e podem formar anúncioiffraction padrão. Um campo distante, ou de Fraunhofer, o padrão de difração é formado se a distância tela-objeto é muito maior do que o objeto difração. Neste caso, o padrão de difracção podem ser calculadas (modelada) utilizando uma transformada de Fourier. Dois C. elegans são de vida livre do solo-moradia nematóides que navegam em três dimensões. Eles se movem ambos em uma matriz sólida como o solo ou ágar em um padrão sinusoidal locomotora chamado rastreamento e no líquido em um padrão diferente, chamado de natação. Três os papéis desempenhados por informações sensoriais fornecidas pelo mecanosensorial, chemosensory, e as células thermosensory que governam mudanças plásticas em locomotora padrões e interruptores em padrões estão apenas começando a ser elucidado. 4 Nós descrevemos uma abordagem óptica para medir a locomoção de nematóides em três dimensões que não requerem um microscópio e vai nos permitir começar a explorar as complexidades de locomoção do nematóide, em co diferentenditions.

<html> Como um exemplo, estudamos C. elegans em um quartzo cubeta 1 cm de largura, 5 mm de espessura e 4 cm de altura cuvete. Amostragem de um sem-fim único, utilizando a análise de vídeo, a frequência de natação médio obtido a partir da análise de vídeo numa cuvete de 5 mm de espessura é de cerca de 2,5 Hz (Figura 4). Do mesmo modo, a amostragem de um sem-fim único, utilizando o método de aquisição em tempo real de dados, obtém-se uma frequência de natação de cerca de 2,7 Hz (Figura 5), utilizando o osciloscópio digital (PicoScope). Este procedimento pode ser repetido para muitos vermes. Um estudo detalhado de vermes que nadam livremente revelou uma frequência média de natação de 2,37 Hz a uma cuvette de 5 mm. 6 Tal como esperado, a frequência de natação é maior do que para um verme rastejante (~ 0,8 Hz). 3 Usando este método de difracção, o média freqüências de natação de um C. elegans, que se limita a uma lâmina de microscópio, verificou-se coincidir com o valor publicado anteriormente de 2 Hz. 1,7 ve_content &quot;&gt; Seguindo procedimentos 3.) e, em seguida, 6.) permite a modelagem de natação padrões de difracção, com a ajuda do sem-fim imagens obtidas com um microscópio convencional. Os padrões de difracção modelados são usados ​​para simular um ciclo de mergulho da C. elegans ( Figura 6). Um modelo de sucesso consiste fisicamente realizáveis ​​padrões nadar sucessivas correspondentes as frequências de natação. O sem-fim deve ser a mesma forma que no final de um ciclo de mergulho como foi no início de um ciclo de mergulho. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> Figura 1. Um verde laser HeNe foi usado para criar um padrão de difracção dinâmica usando vivo C. elegans. Este padrão de difração foi filmado a 240 fps. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> Figura 2. Dra<html> asa de um ponto preto aumenta a absorção do feixe transmitido. Saturação da câmara devido a luz dispersa é reduzida e o padrão de difracção se torna visível. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> Figura 3. Captura de tela do software de análise de vídeo (Logger Pro), com um padrão de difração worm que está sendo monitorado. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> Figura 4. Os dados de vídeo que correspondem ao ciclo de mergulho de um nemátodo numa cuvete de 5 mm. O ajuste da curva revela uma frequência de natação Hz ~ 2,5. &quot;/&gt; Figura 5. Dados em tempo real que correspondem ao ciclo de mergulho de um nemátodo numa cuvete de 5 mm. O ajuste da curva revela uma frequência de natação Hz ~ 2,7. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> Figura 6. A linha superior representa os padrões de difração de reais e é comparado com os padrões de difração modelados na linha de fundo. Os padrões de difracção modeladas foram produzidas usando vermes sobre uma lâmina de microscópio (linha do meio).

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction at JoVE.com

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Organismos microscópicos, como o nematóide de natação livre<em&gt; C. elegans</em&gt;, Viver e se comportar em um ambiente tridimensional complexa. Nós relatamos uma nova abordagem que prevê a análise de<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando os padrões de difração. Esta abordagem consiste em acompanhar a periodicidade temporal de padrões de difração gerados por direcionar a luz de laser através de uma cuvete.

Estudo quantitativo de locomoção livremente Natação Micro-organismos Usando Difração Laser

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K visualizações.  Vassar College. Organismos microscópicos, como o nematóide de natação livre C. elegans, Viver e se comportar em um ambiente tridimensional complexa. Nós relatamos uma nova abordagem que prevê a análise de C. elegans Usando os padrões de difração. Esta abordagem consiste em acompanhar a periodicidade temporal de padrões de difração gerados por direcionar a luz de laser através de uma cuvete.

Vídeo: Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Bioengenharia

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

Duplo Emulsion Geração de utilizar um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-Axial Flow Foco

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

Um protocolo eficiente e reprodutível para distração osteogênese em um modelo de rato, levando a um fêmur regenerada funcional

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Imagem fotoacoustic de pequeno animal de varredura dupla raster-scaning para visualização vascular

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...