Agradecemos ao Dr. Krishanu Ray para ações de Drosophila, Tarjani Agarwal para a manutenção de uma gaiola Drosophila, Peter Juo para nuIs25 e CGC para C. estirpes elegans. SPK jsIs609 feito em laboratório de Michael Nonet. Agradecemos Arpan Agnihotri (BITS Pilani) por sua ajuda na lapso de tempo de imagem do transporte de mitocôndrias jsIs609 animais em dispositivos microfluídicos. Somos gratos ao Dr. Vatsala Thirumalai e Prakash Surya para fornecer-nos com embriões de zebrafish. Agradecemos ao Dr. Krishna e CIFF em BCN para uso do microscópio confocal disco giratório apoiado pelo Departamento de Ciência e Tecnologia Centro-de Nanotecnologia (No. SR/55/NM-36-2005). Agradecemos também Kaustubh Rau, V. Venkatraman e Chetana Sachidanand para as discussões. Este trabalho foi financiado pela bolsa de pós-doutorado DBT (SM), o esquema de DST fast-track (SM) e uma subvenção de DBT (SPK). SA foi apoiado pelo horário de verão e CSIR subsídios a SPK.

1. SU8 Fabricação Mestre <ol><li> Projetar as estruturas microfluídicos usando software Clewin e imprimi-lo usando 65.024 plotter laser de DPI com dimensão mínima de 8 m em circuito filme bordo. </li><li> Limpar 2 cm x 2 cm com pastilhas de silício óxido nativo em KOH 20%, durante 1 minuto e enxaguar em água desionizada, um wafer de cada camada para o fluxo e a sua camada de controlo correspondente. </li><li> Seque as peças com gás de azoto e desidratação em uma placa quente a 120 ° C durante 4 horas. Permitir que as peças de arrefecer até à temperatura ambiente antes de continuar para a próxima etapa. </li><li> Coloque pedaços de silício, um de cada vez no mandril giratório e ligue o vácuo. Cobrir as superfícies de silício com 20 ul ~ hexametil-dissilazano (HMDS) e revesti-los utilizando um. SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 3.000 rpm durante 30 seg </li><li> Cubra completamente com wafers de silício de 1,5 mL de SU8-2025 ( <a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) e pastilhas de revestimento utilizando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 2,000 rpm durante 30 segundos. Este protocolo de fiação produz uma espessura de ~ fotorresistência 40 um que seja adequado para o controlo e as camadas de escoamento para os primeiros estádios larvais de C. elegans. </li><li> Spin-~ 1,5 ml SU8-2050 usando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 2,000 rpm durante 30 segundos para obter uma espessura de ~ photoresist uM 80 que é adequado para a fabricação da camada de fluxo para tardios estágios larvais de C. elegans, a camada de fluxo basal de Drosophila / zebrafish larvas e suas camadas de controle correspondente. </li><li> Coloque os pedaços de silício na chapa quente com a camada SU8 revestido em cima. Cozer os pedaços de silício macio revestido a 65 ° C durante 1 min seguido de 95 ° C durante 10 min. Permitir que as peças de arrefecer até à temperatura ambiente antes de continuar para a próxima etapa. </li><li> Coloque os pedaços de soft-cozidos de silício no palco de exposição com SU8-2025 sur revestidoface na parte superior voltada para a lâmpada UV. Use a máscara de foto com design I (L1, Figura 1B) e II design (L2, Figura 1B) para a camada de fluxo e padrão de camada de controle, respectivamente, para os primeiros estágios larvais de C. elegans. Coloque a máscara foto no topo da camada de SU8 e assegurar a máscara é plana contra a camada de revestimento. Abra o obturador da lâmpada UV e expor os soft-cozidos SU8 wafers de 200 Watt lâmpada UV através da máscara de fotos para 15 seg. </li><li> Utilize a máscara fotográfica com desenho I (L1, Figura 1B) e II da concepção (L2, Figura 1B) em SU8-2050 pedaços revestidos (preparado no passo 1.6) para fabricar a camada de fluxo de controle e camada final para as fases larvares de C. elegans. Utilize a máscara foto com o desenho I (L1, Figura 1C), e II da concepção (L2, Figura 1C), para a camada de fluxo de base e da camada de controlo, respectivamente, para Drosophila / zebrafish larvas em pastilhas revestidas com SU8-2050 (preparado in passo 1.6). Expor as superfícies SU8 através da máscara foto à lâmpada UV 200 Watt durante 15 segundos. </li><li> Colocar as peças de silício exposto sobre uma placa quente com a camada de revestimento na parte superior. Mensagem cozer as bolachas a 65 ° C durante 1 min seguido de 95 ° C durante 10 min. Permitir que as peças para arrefecer antes de prosseguir para o passo seguinte. </li><li> Desenvolver as peças usando a solução de revelação SU8 durante 20 min. Lavar as peças em álcool isopropílico (IPA) e explodir com gás nitrogênio seco. </li><li> Colocar as peças de silício em um exsicador com o padrão SU8 no topo. Cubra os pedaços com 50 ul de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor num exsicador durante 2 h. </li></ol> Precauções: Tome precauções de segurança para a manipulação de produtos químicos durante KOH tratamento, revestimento fotorresiste e em desenvolvimento. Revestimento de vapor de silano deve ser realizada dentro de um secador em uma área ventilada. Proteja SU8 resistir de excesso de exposição à luz. Use óculos de proteção com uma lig UVfonte ht. 2. PDMS fabricação de moldes <ol><li> Prepare 10:01 PDMS pela combinação de 50 g de base de Sylgard 184 com 5 g de agente de cura em um copo de plástico. Misturar o conteúdo manualmente para ~ 3 min. Desgaseificar a mistura dentro de um dessecador para remover todas as bolhas de ar formadas durante a mistura. </li><li> Despeje uma mistura de 5 milímetros de espessura PDMS sobre as pastilhas de silício com SU8 padrão de design II, para a camada de controle, com cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. No caso de as bolhas se formam durante o vazamento, desgaseificar o PDMS no padrão SU8 em baixo vácuo para remover todas as bolhas. </li><li> Coloque as bolachas de silício com SU8-2025 padrão de projeto que eu, para a camada de fluxo, em mandril giratório e ligue o vácuo para mantê-los. Cobrir as placas com ~ 1 ml de mistura de PDMS e revestir as placas utilizando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 1,500 rpm durante 30 segundos. </li><li> Casaco ~ 1 ml mistura PDMS em placas de silício com a 80 uM SU8-2050 padrão de desenho I (L1, Figura 1B), para acamada de fluxo para final estágios larvais de C. elegans usando o spinner SPIN150 a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 1000 rpm durante 30 segundos. Casaco de uma espessa camada de mistura de PDMS sobre as peças de silício com SU8-2050 padrão de fluxo de camada de desenho I (L1, Figura 1C), para Drosophila / larvas de peixe zebra, utilizando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 35 segundos. </li><li> Asse PDMS peças de silício revestido de projeto que eu e bolachas com correspondente projeto II para controle de camada contendo PDMS para C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas em um forno de convecção de ar quente a 50 ° C durante 6 horas. </li><li> Cortar a peça PDMS do substrato de silício contendo o SU8 padrão II para C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas usando uma lâmina afiada. Perfurar um furo de pequeno diâmetro de ~ 1 mm na parte superior do reservatório de ligar a armadilha principal no molde PDMS utilizando um perfurador de Harris. </li><li> Coloque o bloco perfurado PDMS (contendo o molde 40 um de espessura para o controlocamada L2) num tabuleiro de plástico, com o lado da camada moldada de controle para cima. Colocar a placa de silício revestido de PDMS contendo os 40 um desenho SU8 espesso I na mesma bandeja, com a superfície revestida voltada para cima PDMS. Introduza o tabuleiro no interior da câmara de plasma limpo e ligar o vácuo durante 2 min. Subsequentemente, ligar a energia do plasma e reduzir a pressão da câmara até a câmara fica rosa claro na cor. Expor ambas as superfícies a 18 Watt ar plasma sob baixo vácuo durante 2 min. </li><li> Coloque o bloco perfurado PDMS removidos dos 80 mm de espessura SU8 mestre contendo padrão II para final estágios larvais de C. elegans ou Drosophila / zebrafish larvas numa bandeja de plástico, com o lado da camada moldada de controle para cima. Coloque o spin camada correspondente cozido PDMS revestido na pastilha de silício contendo 80 mm de espessura projeto eu para mais tarde C. elegans etapas ou Drosophila / larvas de peixe zebra, simultaneamente, na mesma bandeja com a parte plana PDMS revestido surface voltado para cima. Usar o mesmo protocolo acima mencionado de os expor ao ar plasma. </li><li> Coloque as duas superfícies tratadas por plasma C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas, juntamente com uma ligeira pressão e assar no forno de convecção de ar quente a 50 ° C durante 2 horas. </li><li> Corte os dispositivos ligados a partir do substrato de silício com SU8 projeto que eu para C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas. Os orifícios de acesso de perfurador em reservatórios de entrada e saída do canal de fluxo. </li><li> Coloque o molde PDMS ligado em uma bandeja de plástico para C. elegans, com o lado do desenho moldado camada de fluxo para cima. Lamínula limpa vidro (22 X 22 mm, espessura n º 1) e colocá-lo na mesma bandeja de plástico. Insira a bandeja contendo PDMS molde e deslizamento tampa de vidro no interior da câmara de plasma. Expor a superfície de PDMS parte inferior do dispositivo de deslizamento e tampa de vidro a 18 Watt de plasma de ar a baixa pressão durante 2 min. Coloque as duas superfícies de plasma tratados com gentle pressão e assar no forno de convecção de ar quente a 50 ° C durante 2 horas. </li><li> Armazenar o dispositivo num ambiente limpo para uso futuro. </li></ol> 3. Etapas adicionais para Drosophila / Zebrafish Dispositivo <ol><li> Expor a superfície de vidro limpo de tamanho 2 cm x 2 cm com 50 ul de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor num exsicador durante 2 h. </li><li> Spin-~ 1 ml de 10:1 mistura PDMS, preparado no passo 2.1 na superfície de vidro silanizada usando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 35 segundos. Coza os PDMS substratos de vidro revestidos num forno de ar quente a 50 ° C durante 6 horas, com a superfície revestida voltada para cima. Permitir que a camada de PDMS-se arrefecer até à temperatura ambiente antes de prosseguir para o passo seguinte. </li><li> Soco a camada revestida utilizando um perfurador de metal construído sob encomenda afiado no meio do PDMS, para formar a camada de espaçador PDMS. A forma do perfurador de metal é concebido similar ao desenho do fluxo de Drosophila / peixe-zebra (L1, Figura 1C </strong&gt;). </li><li> Expor a camada de espaçador PDMS eo single-ligado bloco (camada de fluxo e camada de controle, feita no passo 2,9 para Drosophila / zebrafish larvas) para 18 Watt ar mais limpo utilizando plasma plasma em baixo vácuo. Coloque as duas superfícies de plasma tratadas em conjunto e cozê-los num forno de ar quente a 50 ° C durante 2 horas. </li><li> Cortar o dispositivo ligado a partir do vidro, os orifícios de acesso de perfuração nos reservatórios de entrada e de saída e de ligação a uma lamela de vidro (22 X 22 mm, espessura No. 1), utilizando um aspirador de plasma, como mencionado no passo 2.11. Isto produziria um dispositivo de imobilização por larvas de primeiro instar de Drosophila, com uma altura de canal de ~ 500 mm. Para larvas do peixe, duplicar o espaçador PDMS processo de fabricação de camada com um passo de ligação adicional. A dupla camada de PDMS-S produz uma altura de canal de 900 | iM durante 30 larvas de peixe-zebra HFP. </li></ol> Precauções: Evite as partículas de poeira durante a fabricação do dispositivo. Dois plasma de superfície limpas necessita de ser completamente livre de poeira para a ligação adequada. Armazenar os dispositivos num exsicador em situações em que uma sala limpa especial não está disponível a fim de minimizar a acumulação de partículas de pó nos dispositivos. 4. Usando PDMS Membrana <ol><li> Conectar uma extremidade de um tubo de micro-flex (diâmetro interno ~ 1,6 mm, diâmetro externo ~ 4,8 mm) a um regulador de pressão de abastecimento de gás de azoto e a outra extremidade para o reservatório de armadilha principal através de uma agulha de calibre 18 (diâmetro externo ~ 1,25 mm) colado ao tubo. Uma torneira de 3 vias utilizadas no meio do tubo de ligação permite que a aplicação ou a libertação da pressão sobre a membrana. </li><li> Encher o tubo conectado ao dispositivo de PDMS com uma coluna de 10 cm de água destilada, antes de o ligar ao reservatório da armadilha principal de um C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish dispositivo larvas. </li><li> Girar a válvula da fonte de azoto de 14 psi ler e monitorizar a membrana da armadilha principal deflexão no sentido thcanal de fluxo e a baixa ampliação de um microscópio invertido. Comprimento da coluna de água no tubo de micro-flex é comprimida quando a torneira de passagem de 3 vias está aberta. Bordas da membrana desviada são visíveis em luz transmitida (Figura 1I e 1J). Deflexão da membrana provocam o deslocamento de partículas de poeira / bolhas sob a membrana PDMS e empurra-los para as fronteiras de canal. </li><li> Espere até que o líquido enche a frente de microcanais completamente sem qualquer ar aprisionado. </li><li> Libertar a pressão, utilizando a torneira de passagem de 3 vias para relaxar a membrana para a sua posição de repouso. </li></ol> 5. Inserindo C. elegans, Drosophila e Zebrafish larvas no dispositivo e imobilizando-os sob a membrana PDMS flexível <ol><li> Encher o canal de fluxo com tampão M9 [3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O a 1 L, esterilizar por autoclaving] para C. elegans 18 ou 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4, H 2 O a 1 L, esterilização em autoclave] para Drosophila / 19 larvas de peixe-zebra, durante 10 min antes de uma experiência. </li><li> Localize uma única C. elegans de estágio obrigatório em uma placa NGM 18 (ou primeiro larvas Drosophila da placa de ágar ovo ou manualmente dechorionated 30 larvas do peixe hpf em meio líquido 20) usando um microscópio estéreo baixo ampliação. Escolher um único animal usando um pequeno volume de solução tampão para uma ponta de micro. Utilizar uma ponta de micro corte com a sua extremidade para acomodar o maior ou Drosophila zebrafish larvas em tampão. </li><li> Empurrar o único organismo através da entrada do canal de fluxo. Ajuste a pressão de pipetagem para posicionar o animal individual sob a armadilha principal. </li><li> Aumentar a pressão da membrana PDMS lentamente para posicionar o animal contra a channel limite e imobilizá-lo, com 14 psi de pressão de C. elegans, 7 psi para Drosophila e 3 psi para larvas do peixe. </li><li> Posicionar o animal imobilizado no centro do campo de vista microscópico. Use um microscópio invertido em configurações desejadas para o campo de alta resolução brilhante ou imagens de fluorescência. Adquirir um ou lapso de tempo imagens de fluorescência na taxa de quadros predefinido. </li><li> Solte a pressão armadilha e monitorar a locomoção do animal por 5-10 minutos em baixa ampliação. </li><li> Lave o animal e inserir um animal fresco para repetir os passos acima. </li><li> Lave todos os animais do reservatório de resíduos, utilizando água destilada aplicado utilizando uma seringa. Seca-se o canal empurrando ar utilizando uma seringa para reutilização futura. </li></ol> Precauções: Animais que requerem maior pressão de pipetagem para correr dentro do canal principal tendem a mostrar locomoção ruim / saúde após o lançamento da armadilha e deve ser evitado por imaging. Limpar o canal de fluxo para qualquer traço de solução tampão para evitar o entupimento do canal por cristais. Se o óleo é usado para geração de imagens de alta resolução, limpar a lâmina de cobertura de vidro para ser capaz de manter um bom sinal-ruído para as experiências subsequentes.

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+gene+unc-104+is+required+for+axonal+transport+of+synaptic+vesicles+in+C.+elegans.">Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans.</a> Cell. 65, 837-847 (1991).</li><li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).</li><li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts.">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth.">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li><li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila.">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dispositivos PDMS microfluidicos são opticamente transparentes, por conseguinte, pode ser utilizado em alta resolução em imagiologia in vivo de qualquer organismo modelo transparente / translúcida. Nosso projeto é adequado para alta de ampliação de imagem espaço-temporal de eventos celulares e sub-celular em intactas animais vivos. Microfabricação utilizando técnicas de litografia suave permite uma fácil manipulação de dimensões do dispositivo para vários tamanhos de organismos modelo. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Wafers de silício </td><td> Wafer Universidade </td><td> 150 mm (100) Grade Mech SSP Si </td><td></td></tr><tr><td> Clewin Software </td><td> WieWeb software </td><td> Versão 2,90 </td><td></td></tr><tr><td> Plotter Laser </td><td> Imagem Fine Line </td><td> 65.024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440.191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td> Microchem </td><td> SU8-2025, SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td> Revelador </td><td> Microchem </td><td> SU8 desenvolvedor </td><td></td></tr><tr><td> Silano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmpada UV </td><td> Janela saliente </td><td> 66943 </td><td> 200W Hg Oriel Luz </td></tr><tr><td> Forno de ar quente </td><td> Instrumentos Ultra </td><td> Feitos </td><td> Ajustado a 50 ° C </td></tr><tr><td> Chapa elétrica </td><td> Equipamentos de Laboratório IKA </td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td> Aspirador de Plasma </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td> Fiandeiro </td><td> Sistemas de produção de semicondutores </td><td> SPIN150-NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.SPS-Europe.com</a> </td></tr><tr><td> Lamínula de vidro </td><td> Gold Seal </td><td> 22 X 22 mm, espessura 1 No. </td><td></td></tr><tr><td>C. elegans </td><td> Caenorhabditis Genetics Center (CGC) </td><td> e1265, ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila </td><td> Bloomington </td><td> P {chaGAL4} / cio, UAS-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td> Zebrafish </td><td> Tipo selvagem indiano </td><td> Tipo selvagem </td><td></td></tr><tr><td> Tubo Tygon </td><td> Sigma </td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td> Micro agulha </td><td> Sigma </td><td> Z118044 </td><td> Corte em pedaços 1 centímetro </td></tr><tr><td> 3-way torneira </td><td> Sigma </td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td> Perfurador Harris </td><td> Sigma </td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td> Gás comprimido nitrogênio </td><td> Fornecedor de gás local </td><td></td><td> Utilizar um regulador de pressão para controlar a </td></tr><tr><td> Microscópio estéreo &lt;/ Td&gt; <td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Andor &amp; Olympus </td><td> Yokogawa disco giratório microscópio confocal </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / ij</a> </td><td> Java programa de processamento de imagem baseada em </td></tr></tbody></table>

simple microfluidic devices for in vivo imaging of c. elegans, drosophila and zebrafish

Micro fabricados dispositivos fluídicos fornecer um micro-ambiente acessíveis para estudos in vivo sobre os organismos pequenos. Processos de fabricação simples estão disponíveis para dispositivos microfluídicos usando técnicas de litografia suave 1-3. Dispositivos microfluídicos têm sido utilizados para sub-celular de imagem 4,5, in vivo microcirurgia laser 2,6 e imagiologia celular 4,7. In vivo de imagem requer a imobilização dos organismos. Isto foi conseguido usando sucção 5,8, 6,7,9 canais cónicos, membranas deformáveis ​​2-4,10, com arrefecimento adicional de sucção 5, o gás anestésico 11, geles sensíveis à temperatura 12, 13 e cola de cianoacrilato, tais como anestésicos levamisole 14 de 15. Anestésicos comumente utilizados influenciar a transmissão sináptica 16,17 e são conhecidos por terem efeitos prejudiciais sobre a sub-celular de transporte 4 neuronal. Neste stUdy demonstramos uma membrana de base de poli-dimetil-siloxano dispositivo (PDMS) que permite a imobilização sem anestésico intactos organismos modelo genéticas tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila e larvas de larvas de peixe zebra. Estes organismos modelo são adequados para estudos in vivo em dispositivos microfluídicos devido às suas diâmetros pequenos e corpos opticamente transparentes ou translúcidas. Diâmetros de corpo variar de 10 a ~ uM ~ 800 uM para os primeiros estádios larvais de C. elegans e larvas do peixe-zebra e exigir dispositivos microfluídicos de tamanhos diferentes para atingir a imobilização completa de alta resolução de imagem time-lapse. Estes organismos são imobilizadas através de pressão aplicada por comprimido de gás de azoto através de uma coluna de líquido e visualizados utilizando um microscópio invertido. Animais libertados da armadilha retornar para locomoção normais dentro de 10 min. Demonstramos quatro aplicações de lapso de tempo de imagem em C. elegansou seja, a imagem de transporte mitocondrial nos neurônios, pré-sináptica transporte vesicular em um transporte defeituoso mutante transporte receptor, glutamato e divisão celular Q neuroblastos. Os dados obtidos a partir de tais filmes mostram que a imobilização de microfluidos é um meio útil e precisa de adquirir dados in vivo de eventos celulares e subcelulares em comparação com animais anestesiados (Figura 1J e 3C F-4). Dimensões do dispositivo foram alteradas para permitir lapso de tempo imagens de diferentes fases da C. elegans, primeiro larvas Drosophila e larvas de peixe-zebra. Transporte de vesículas marcadas com sinaptotagmina marcados com GFP (syt.eGFP) em neurônios sensoriais mostra movimento dirigido de marcadores das vesículas sinápticas expressos em colinérgicos neurônios sensoriais intactas em primeira larvas Drosophila estádio. Um dispositivo semelhante tem sido utilizada para a realização de lapso de tempo de imagem de pulsação em ~ 30 h pós-fertilização (hpf)Zebrafish larvas. Estes dados mostram que os dispositivos simples que desenvolvemos pode ser aplicada a uma variedade de sistemas modelo para estudar os fenómenos biológicos diversos celulares e de desenvolvimento in vivo.

O dispositivo de imobilização é um bloco de PDMS bicamada fabricadas por colagem de duas camadas: uma camada de fluxo (camada 1) e uma camada de controlo (camada 2), como mostrado na Figura 1. A armadilha principal está ligada a um cilindro de gás de azoto através de um regulador e uma torneira de 3 vias para aplicar pressão (3-14 psi) necessário para a membrana através de uma coluna de líquido (Figura 1A). A membrana é desviado imobiliza C. elegans, Drosophila ou ze...

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Um dispositivo simples de microfluidos foi desenvolvido para realizar anestésico livre<em&gt; In vivo</em&gt; Imagiologia de<em&gt; C. elegans</em&gt;, Intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas e larvas de peixe-zebra. O dispositivo utiliza uma membrana deformável PDMS para imobilizar estes organismos modelo, a fim de realizar imagem de lapso de tempo de vários processos, tais como o batimento cardíaco, a divisão celular e subcelular transporte neuronal. Nós demonstramos a utilização deste dispositivo e mostram exemplos de diferentes tipos de dados recolhidos a partir de sistemas de modelos diferentes.

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

simple-microfluidic-devices-for-vivo-imaging-c-elegans-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

17.0K visualizações.  NCBS-TIFR. Um dispositivo simples de microfluidos foi desenvolvido para realizar anestésico livre In vivo Imagiologia de C. elegans, Intacta Drosophila Larvas e larvas de peixe-zebra. O dispositivo utiliza uma membrana deformável PDMS para imobilizar estes organismos modelo, a fim de realizar imagem de lapso de tempo de vários processos, tais como o batimento cardíaco, a divisão celular e subcelular transporte neuronal. Nós demonstr...

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Bioengenharia

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Estudos de pulmão células de câncer usando um Multichannel Dual-elétrico-campo Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-passo fotolitografia Variável Altura para Valved multicamada microfluídicos Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

Fabricação de dispositivos microfluídicos tridimensional baseados em papel para imunoensaios

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Um método de fabricação simples e escalável para dispositivos eletrônicos orgânicos sobre os têxteis

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...