Este trabalho foi apoiado pela &quot;Agence Nationale de la Recherche&quot; conceder ANR-09-JCJC-0117-01 e &quot;Neuropôle de Recherche Francilien-NERF&quot; subvenção para Romain Chery. Agradecemos a Françoise Lefebvre para o desenvolvimento de software em C + + / Qt, e Laurent e Pinot Batiste Janvier para ajudar no desenvolvimento da configuração da imagem óptica.

1. Preparar o animal para geração de imagens (de acordo com recomendações europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório, a Directiva 86/609/CEE) <ol><li> 6 a 8 semanas de idade C57BL6 camundongos machos são anestesiados com uma mistura de quetamina (10mg/kg) e xilazina (100mg/kg) injetados intraperitonealmente. Cirurgia começa quando o mouse não responde mais à pata traseira pinch. Durante todo o experimento o animal é colocado em uma almofada de aquecimento. Temperatura do corpo é continuamente monitorizada e mantida a 37 ° C. Profundidade da anestesia é mantida durante toda a cirurgia e sessões de imagens por verificar a ausência de membro se retirar. A injecção subcutânea de 20% do cocktail anestésico inicial é administrados por outra via. </li><li> Usando clippers, remover os pêlos do couro cabeludo. Limpe a pele exposta do cabelo residual usando gaze estéril embebida em soro fisiológico. </li><li> Posicione o mouse no quadro estereotáxico. O focinho tem de ser no mesmo plano que a parte de trás da cabeça,, a fim de definir a superfície do bulbo olfativo com a horizontal. Segura firmemente ouvido do nariz e bares, a fim de impedir os movimentos durante o exame. </li><li> Aplicar pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secagem e dor. </li><li> Desinfectar todos os instrumentos cirúrgicos com etanol 70 ° e na área do couro cabeludo com varreduras sucessivas de betadine. </li><li> Para remover a pele que cobre o crânio, começar por fazer uma incisão na pele com uma tesoura na parte de trás da cabeça entre as orelhas. Em seguida, corte em ambos os lados em direção à base da orelha e no sentido ântero-posterior para a testa ao longo das pálpebras. Terminar de remover o couro cabeludo, cortando a pele em cima do focinho perto do bar nariz. </li><li> Sob observação binocular, use um cotonete embebido em soro fisiológico para retirar delicadamente o periósteo na parte superior do crânio. Use uma pinça para remover o tecido remanescente e raspe a superfície do crânio com um bisturi para ter uma preparação limpo. </li><li>O OB é uma estrutura simétrica composta de duas hemibulbs que estão localizados entre as pálpebras. Eles são limitados no rostral e na direção caudal por um seio venoso, e separados pela sutura sagital. Coloque um pedaço de esponja de gelatina absorvível embebida com água destilada no osso acima do OB. É importante manter esta área do osso úmido durante todo o experimento. </li></ol> 2. Preparando a janela craniana <ol><li> Retire a esponja de gelatina e começar por delicadamente raspando o osso com n ° 10 lâmina de bisturi. Mantenha um ângulo constante de 45 ° entre a lâmina eo osso, e mova a lâmina do pálpebras para o lado sagital da área do bulbo. Não aplique pressão vertical sobre o osso ou arranhar o osso acima do seio venoso. </li><li> Durante o processo de desbaste, parar a cada 5min e coloque uma esponja de gelatina hidratada no osso para esfriar a preparação. Swab do crânio com a esponja para remover o pó de osso. </li><li> Manter varrição erefrigeração alternadamente até visualizar as trabéculas, a camada de osso esponjoso. A vasculatura fina do OB deve ser visível nesta fase. Parar de coçar o osso, e começar a usar a ponta do bisturi de forma perpendicular para &quot;desenhar&quot; uma área retangular que envolve o OB. Nesta fase n ° 11 lâmina de bisturi pode ser usado. Mantenha a cirurgia dentro dos limites dos seios venosos que deve ser segura de qualquer curso bisturi. </li><li> Dig gradualmente a vala formada retangular usando movimentos sucessivos do bisturi. Limpe a ponta do bisturi periodicamente para limpá-lo e mantê-la afiada. Ser mais cautelosos da profundidade da ponta para evitar tocar na superfície dura. </li><li> A fim de obter uma idéia da espessura do osso remanescente, empurre-o suavemente com a ponta de um par de fórceps. Se as dobras retalho ósseo sob pressão, passar para a próxima etapa. </li><li> De acordo com uma gota de solução salina, use a ponta do bisturi orientados horizontalmente para levantar o retalho ósseo. A remoção do retalho tem que ser feito carefully para evitar arrancando o osso remanescente. </li><li> Uma vez que a superfície da OB é exposta, verificar a ausência de qualquer hemorragia ou anastomose dos vasos sanguíneos. Ferindo a dura ou a superfície do tecido irá reduzir as chances de obtenção de sinais ópticos. Limpe a área com uma esponja de gelatina embebida em solução salina, a fim de manter a umidade do bulbo. </li><li> Aplicar cimento dental poliacrilato para formar um bem sobre o osso ao redor da janela. </li><li> Coloque uma gota de baixo ponto de fusão de agarose (1,2%) sobre a dura-máter, e colocar uma tampa de vidro estéreis as dimensões da janela. Durante a sessão de imagens, uma pequena quantidade de agarose podem ser adicionados a fim de compensar a desidratação. Agarose impedirá que o OB do movimento com a respiração e irá proporcionar uma superfície plana para imagem óptica. </li></ol> 3. Configuração de imagem óptica para o mapeamento de atividade olfativa <ol><li> A estimulação olfativa deve ser definido com precisão no tempo e intensidade do uso de um olfatômetro. Usamos uma versão personalizada modificada do sistema de perfusão multivial Valvebank 8II de Automatize Científica associada a um compressor de ar básico (ar comprimido respirável seria adequado também). Este sistema permite o controle preciso da válvula, e rápido externo. Soluções de odores puros são diluídos em óleo mineral na concentração escolhida. Para ativar os aldeídos dorsal OB, como hexanal são comumente usados. Um volume preciso da odorant diluída (20 a 50μl) é carregado em um filtro de papel e colocados em um reservatório da seringa. Através do sistema de perfusão, pressão de ar controlada é entregue ao sistema, garantindo uma taxa constante de odorizado entrega fluxo de ar para o nariz de animais durante a abertura da válvula. Odorante é entregue através de uma tubulação de Tygon R-3603 de vácuo (Saint-Gobain Corporation) transportando ar a uma taxa de fluxo de ~ 1000ml/min. Evitar a contaminação entre odores e quantidades residuais de odores na tubulação. Se disponível, a reprodutibilidade do estímulo odorante pode ser controlled através do uso de um detector de ionização de chama (microFID Photovac 2020). </li><li> A configuração óptica está ligado. Ele consiste de um resfriado entrelaçado 12 bits câmera CCD (ORCA AG Hamamatsu) associado com um estereomicroscópio de fluorescência (Leica MZ16), um olfatômetro controlado por computador e lâmpadas de excitação estabilizado com filtros de interferência apropriado bandpass. Um esquema que descreve a nossa configuração é fornecido na figura 2. Intrínseca para sinais ópticos Imaging (IOSI), uma lâmpada halógena de 200W de tungstênio (QTH Oriel) acoplado com uma luz anel de fibra (Schott) conectado em torno da objetiva do microscópio são usados ​​para fornecer iluminação estável e uniforme. Para flavoproteína autofluorescência Sinais Imaging (FASI), uma lâmpada de 150W de metal Halide (Leica), com uma guia de luz 5 milímetros núcleo líquido fornecer mesmo excitação localizada da fluorescência através da porta de epi-iluminação do estereomicroscópio. Aquisição de imagens e sincronização de hardware são realizados por software personalizado. A s abertasource micromanager software também pode ser usado para controlar a configuração óptica e aquisição. </li></ol> 4. Imagem óptica <ol><li> Coloque o quadro estereotáxico sob o estereomicroscópio, a janela craniana centrado no campo de visão (ver fig. 2A para um esquema da configuração óptica). </li><li> Sintonize o microscópio para se concentrar nos capilares. Antes de ensaios estímulo (ver descrição em 5) uma imagem da lâmpada é tomada sob a luz 560nm (verde) (anel de fibra), que fornece um bom contraste para imagens de vasos sanguíneos. Esta imagem é usado como um controle anatômica para verificar o estado da preparação e é adquirido várias vezes durante o experimento. </li><li> Para IOS imagem, refletida intensidade da luz é gravado pela câmera CCD em 630 + / -10 nm (vermelho) de iluminação. As imagens são adquiridas em full frame (sem binning) a 5 quadros por segundo que correspondem a um tempo de exposição de cerca de 150ms. Potência da fonte de luz é ajustado para re<html> níveis ach cinza de pelo menos ~ 3000 na área de OB, perto da saturação dos pixels CCD poços. Se o fizer, torna possível para aproveitar a dinâmica 12bits do CCD para capturar alterações de intensidade leve durante a ativação. IOS máximo amplitudes chegar ~ 1%. </li><li> FAS para imagens de fluorescência é adquirido sob excitação de 480nm + /-20nm de luz (azul) epiflurorescence. Um filtro passa-alta em 515nm é configurado para capturar a luz. As imagens são adquiridas em 5 quadros por segundo com um binning de 4 por 4 a maximizar a sensibilidade. Poder de luz de excitação é ajustada de forma semelhante ao IOS com níveis de cinza de 3000 na área de OB. Máxima FAS amplitudes chegar ~ 3%. Para ambas as modalidades de imagem, a profundidade de campo no plano do assunto é o mesmo e foi medido em 0,5 mm para uma ampliação de cerca de 4 vezes. </li><li> Luz devem ser desligados entre ensaios imagem para evitar aquecimento e fotodegradação da preparação. </li></ol>le &quot;&gt; 5. Imagem ensaios <ol><li> Sessão de imagem padrão incluía uma base de 5 a 10s onde o ar só é entregue, seguido pela estimulação odor por 3 a 10s, dependendo da concentração odor escolhido, e 70 a 82s são ainda gravado com um fluxo de ar constante para a recuperação de base (Fig. 2A). No final do julgamento, a luz é desligada e ar puro é entregue durante o período inter julgamento intervalo (1-3 minutos) para lavar as moléculas de odor residual e evitar a habituação sensorial. Odor ensaios foram intercaladas com ensaios em branco (entrega de ar). </li><li> Odor-evoked zonas ativadas são visualizadas como áreas aproximadamente esférica nos mapas e correspondem ao tamanho dos glomérulos individuais (80 a 200μm de diâmetro 9). Processamento de imagens é explicada na Figura 2B. Mapas olfactivos são apresentados na Figura 3. Ao contrário do que qualquer outro sistema sensorial, a relação sinal-ruído na OB foi suficiente para resolver odor evocadas respostas em testes simples (Fig. 3B para IOS e Figo. 3D para FAS). </li><li> Os ratos são sacrificados imediatamente no final da sessão de imagem usando métodos de acordo com recomendações europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório. </li></ol> 6. Resultados representante (ver mapas olfactivos na figura 3): <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" /> Figura 1 Organização estrutural do bulbo olfatório em roedores. Neurônios sensoriais olfativos primários, células sensoriais localizadas no epitélio olfatório, expressam o receptor de odorante mesmo e convergem para a mesma glomérulos no OB. Glomérulos olfativos, o neuropils de forma arredondada (círculos tracejada), estão localizados na superfície do OB. Note-se que uma rede muito densa e complexa vascular está presente ao nível glomerular. Abreviações (em cima / para baixo): ONL: camada nervo olfatório; GL: camada glomerular, EPL: camada plexiforme externa; MCL:camada de células mitral; GCL: camada de células granulares. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" /> Figura Reflectância 2 e gravação de sinais de fluorescência in vivo. A. Wide-field configuração de imagem óptica. O cérebro de um rato anestesiado é exposto para vermelho (IOS) ou azul (FAS) de luz, quer através de um anel de fibra anular acoplado à lente óptica ou uma porta de epi-iluminação de um microscópio. Odores são carregadas em frascos lacrados e odorizado ar é entregue ao nariz animal (luz verde: válvula aberta). B. Gravação protocolo e processamento de dados. IOS e FAS são registrados como uma série de ensaios individuais (90 de duração). O diagrama mostra a timeline de um julgamento único: linha de base varia de 5 a 10s, a estimulação de 3 a 10s, e retornar ao valor basal de 70 a 82s. Processamento de imagem requer pixel por pixel de subtração de valores de intensidade durante a linha de base para valores de intensidade durante os períodos de estimulação (por FAS) or estimulação mais o retorno à linha de base (para IOS). Esta diferença é então dividido por valores de base para obter uma variação em% (ver imagens resultantes na fig. 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" /> Figura 3 Odor evocadas mapas atividade no OB usando IOS e FAS imagem. A. Vascularização do OB dorsal visualizado sob luz verde. BC. IOS imaged (trial única versus média de três ensaios, respectivamente) para uma apresentação 10s de hexanal 20%. Setas brancas indicam as regiões de interesse esférica ativadas por esse odor. Estes mapas de ativação foram obtidos utilizando os quadros em média durante o primeiro segundo após o término da estimulação odor (máximo de reflectância variação -0,63% em A e -0,52% em B). Nota as zonas negras de absorbância onde a ativação odor ocorreu. CD. FAS adquiridos seqüencialmente no mesmo mouse para o mesmo odor (trial única versus média de três ensaios respectivosly). Estes mapas de ativação foram obtidos utilizando os quadros em média durante o primeiro segundo após o início da estimulação odor (máximo de fluorescência variação 0,72% na D e 0,66% em E). Note-se que as zonas brancas de emissão de autofluorescência indicado por setas pretas correspondem às zonas negras no IOS. O aspecto granulado visto no mapa FAS é devido ao 4 por 4 binning necessários para a melhoria da sensibilidade. FAS imagens não foram corrigidos de autofluorescência de branqueamento. Dimensões reais de imagens BE: 0,7 mm de largura x 1,2 mm de comprimento.

<ol>
	<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Rubin, B. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odorant+representations+in+the+mammalian+olfactory+bulb.">Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb.</a> Neuron. 23, 499-511 (1999).</li><li>Chance, B., Cohen, P., J&amp;246, b. s. i. s., &amp;amp, F., Schoener, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+oxidation-reduction+states+in+vivo.">Intracellular oxidation-reduction states in vivo.</a> Science. 137, 499-508 (1962).</li><li>Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+somatosensory+cortical+activity+in+the+rat+visualized+by+flavoprotein+autofluorescence.">Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence.</a> J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).</li><li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb:+domain+organization+and+odorant+structural+features.">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).</li><li>Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory-evoked+intrinsic+optical+signals+in+the+olfactory+bulb+are+coupled+to+glutamate+release+and+uptake.">Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake.</a> Neuron. 52, 335-345 (2006).</li><li>Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+diversity+in+an+odor+map+on+the+olfactory+bulb.">Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb.</a> Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).</li><li>Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+functional+architecture+and+local+coupling+between+neuronal+activity+and+the+microcirculation+revealed+by+in+vivo+high-resolution+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).</li><li>Meister, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+and+topography+in+an+odor+map+on+the+rat+olfactory+bulb.">Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).</li><li>Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+total+cerebral+hemoglobin+concentration,+oxygenation,+and+blood+flow+during+functional+activation.">Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation.</a> Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).</li><li>L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+imaging+of+NADH+and+flavoproteins+in+the+rat+brain:+insights+from+Monte+Carlo+simulations.">Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations.</a> Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).</li><li>Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+the+olfactory+bulb+activation:+influence+of+realistic+differential+pathlength+correction+factors+on+the+derivation+of+oxygenation+and+total+hemoglobin+concentration+maps+(Proceedings+Paper).">Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper).</a> , (2011).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Neste artigo apresentamos técnicas IOS e de imagem para FAS nas gravações vivo de odor evocadas atividades no OB mouse. Para atingir este objetivo relativamente simples e acessível de campo amplo de configuração de imageamento óptico é necessário. A aquisição de imagens de dados requer treinamento para realizar os procedimentos cirúrgicos bem e evitar qualquer prejuízo para a dura-máter ou tecido cerebral. Em particular, hemorragia grave vai absorver fótons registrados para a imagem latente e acabar o experimento. Um dos benefícios de IOS e imagem FAS é evitar a injeção de traçadores fluorescentes, que pode resultar em toxicidade celular ou efeitos colaterais indesejáveis. Eles fazem o possível para enfrentar as questões sobre mapas olfactivos, portanto, a codificação espacial de estímulos sensoriais. Ao contrário do que 2-Desoxiglucose imagem, eles fornecem a possibilidade de odores imagem várias em um único animal. No entanto, uma vez que a penetração fóton é limitada no tecido, IOS e FAS são restritas à parte dorsal da OBe não pode ser gravado a partir de regiões ventral. Imagem do sinal óptico endógena oferece excelente resolução espacial na imagem in vivo. Técnico cálculos melhorias preocupação quantitativa de componentes vasculares na reflectância sinais 8,9, bem como a dinâmica de oxigenação do sangue e volume durante a ativação sensorial 10. Imagem Múltiplos Comprimentos de Onda de abordagens IOS imagem são actualmente desenvolvidos em nosso laboratório para quantificar completamente a concentração de hemoglobina total e oxigenação no OB durante a ativação sensorial. Estas medições espectroscópicas ópticas adicionado ao FAS imagem dará a oportunidade de responder a relação não resolvida entre a dinâmica vascular e intracelular durante a ativação sensorial 11,12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de The Regent </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Imalgene </td><td> Merial </td><td></td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> Agarose, tipo III-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9793-50G </td></tr><tr><td> Hexanal 98% </td><td> Aldrich </td><td> 115606-100ML </td></tr></tbody></table>

imaging odor-evoked activities in the mouse olfactory bulb using optical reflectance and autofluorescence signals

No cérebro, a estimulação sensorial ativa populações de neurônios distribuída entre os módulos funcionais que participam com a codificação do estímulo. Funcionais técnicas de imageamento óptico são vantajosas para visualizar a ativação destes módulos no córtex sensorial com alta resolução espacial. Neste contexto, endógena sinais ópticos que surgem a partir de mecanismos moleculares ligados à neuroenergetics são fontes valiosas de contraste para gravar mapas espaciais de estímulos sensoriais sobre os campos de largura no cérebro de roedores. Aqui, apresentamos duas técnicas com base nas alterações de propriedades ópticas endógena do tecido cerebral durante a ativação. Primeiro os sinais ópticos intrínsecos (IOS) são produzidos por uma alteração local na reflexão da luz vermelha devido a: (i) absorção por alterações no nível de oxigenação do sangue eo volume de sangue (ii) dispersão de fótons. O uso de in vivo IOS para gravar mapas espaciais começou em meados de 1980 com o observatina óptica de mapas de barris whisker no rato e as colunas de orientação do córtex visual do gato 1. IOS imagem da superfície do roedor bulbo olfatório (OB), em resposta a odores mais tarde foi demonstrado pelo grupo de Larry Katz 2. A segunda abordagem se baseia em sinais flavoproteína autofluorescência (FAS), devido a mudanças no estado redox desses intermediários metabólicos mitocondrial. Mais precisamente, a técnica é baseada na fluorescência verde devido ao estado oxidado de flavoproteínas quando o tecido está animado com luz azul. Embora tais sinais estavam provavelmente entre as primeiras moléculas fluorescentes gravadas para o estudo da atividade cerebral pelos estudos pioneiros de Chances Britton e colegas 3, não foi até recentemente que eles têm sido usados ​​para o mapeamento de ativação do cérebro in vivo. FAS imagem foi aplicada pela primeira vez para o córtex somatossensorial em roedores, em resposta à estimulação pata traseira por grupo Katsuei Shibuki 4. O sistema olfativo é de importância central para a sobrevivência da grande maioria das espécies vivas, pois permite a detecção eficiente e identificação de substâncias químicas no ambiente (comida, predadores). O OB é o primeiro relé de processamento da informação olfativa do cérebro. Que recebe projeções aferentes do olfactory principal neurônios sensoriais que detectam as moléculas de odores voláteis. Cada neurônio sensorial expressa apenas um tipo de receptor de odorante e neurônios transportando o mesmo tipo de receptor envia seus processos de nervo para o mesmo bem definido microrregiões de ~ 100μm constituído de três neuropil discreta, o glomérulo olfatório (Fig. 1). Na última década, imagem IOS tem fomentado a exploração funcional do OB 5, 6, 7, que se tornou uma das estruturas mais estudadas sensorial. O mapeamento da atividade OB com FAS imagem não foi realizada ainda. Aqui, we mostrar as etapas sucessivas de um protocolo eficiente para IOS e imagem FAS para mapear odor evocadas atividades no OB mouse.

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Este artigo apresenta os protocolos de sinais ópticos intrínsecos e flavoproteínas imagem sinais autofluorescência para mapear odor evocadas atividades na superfície do bulbo olfatório em ratos.

Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

imaging-odor-evoked-activities-mouse-olfactory-bulb-using-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K visualizações.  UMR8165 Université Paris Sud 11, Paris Diderot 7 – CNRS. Este artigo apresenta os protocolos de sinais ópticos intrínsecos e flavoproteínas imagem sinais autofluorescência para mapear odor evocadas atividades na superfície do bulbo olfatório em ratos.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Neurociência

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

Avaliação simultânea de Cerebral Hemodinâmica e de espalhamento de luz Propriedades do<em&gt; In Vivo</em&gt; Cérebro de Rato Utilizando Imagem de Reflexão Difusa Multispectral

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the substantia nigra, is essential. To estimate the total dopaminergic neuron number, unbiased stereology using the optical fractionator method is currently considered the gold standard. Because the theory behind the optical fractionator method is complex and because stereology is difficult to achieve without specialized equipment, several commercially available complete stereology systems that include the necessary software do exist, purely for cell counting reasons. Since purchasing a specialized stereology setup is not always feasible, for many reasons, this report describes a method for the stereological estimation of dopaminergic neuronal cell counts using standard microscopy equipment, including a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane) with imaging software, and a computer for analysis. A step-by-step explanation is given on how to perform stereological quantification using the optical fractionator method, and pre-programmed files for the calculation of estimated cell counts are provided. To assess the accuracy of this method, a comparison to data obtained from a commercially available stereology apparatus was performed. Comparable cell numbers were found using this protocol and the stereology device, thus demonstrating the precision of this protocol for unbiased stereology.

This work presents a step-by-step protocol for the unbiased stereological estimation of dopaminergic neuronal cell numbers in the mouse substantia nigra using standard microscopy equipment (i.e., a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane), and public domain software for digital image analysis.

Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...