Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant 08UDE017788-05). EBP também reconhece o apoio da Fundação Espanhola para a Ciência e Tecnologia (FECYT). Os autores agradecem a Shonda T. Gaylord e Pratyusha Mogalisetti para a leitura crítica do manuscrito.

<img alt="Figura 1" width="600px" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1.jpg" /> Figura 1. . Fluxo de trabalho para aplicar matriz anticorpo microesfera de fibra óptica para a saliva de perfis (1) As microesferas são internamente codificado com dois corantes fluorescentes, (2) as microesferas codificados são externamente modificada com anticorpos monoclonais específicos para a proteína, (3) as microesferas multiplexados são misturados, e (4) depositado aleatoriamente em micropoços gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas, (5) as proteínas salivares são capturados por microesferas através de imunoensaio de sanduíche, e (6) quantificados por microscopia de fluorescência. 1. Microesferas Encoding <ol><li> Pesar európio de sódio (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 200 mM em tetra-hidrofurano (THF). Misture delicadamente por pipetagem; verificar visualmenteo corante esteja completamente dissolvido. </li><li> Pesar cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 12 mM em THF. Misturar suavemente por pipetagem; visualmente verificar o corante esteja completamente dissolvido. </li><li> Prepare a 700 ul de solução de trabalho para cada tipo de microesfera utilizando as soluções de reserva e de THF para atingir uma concentração final na Tabela 1. </li><li> Certifique-se de microsferas (10% w / v) são bem suspensas por vórtice, e depois transferir a suspensão de 60 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 600 mL PBS a suspensão de microesferas e misture pipetando 20x. Centrifuga-se o tubo a 10.000 rpm durante 3 min e remover cuidadosamente o sobrenadante. Repetir este processo mais 2x para lavar as microsferas. </li><li> Lava-se a pelete 3x com microesferas de THF utilizando um procedimento semelhante ao passo 1.5. </li><li> Centrifugar a suspensão de microsferas / THF a 10.000 rpm, durante 3 min, remover o sobrenadante, e re-suspender o sedimento em 600 ulSolução de trabalho de listados na Tabela 1. Transferir a mistura para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. </li><li> Selar o tubo de microcentrífuga com Parafilm e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 3.000 rpm e incubar por 24 horas, proteger da luz, cobrindo a instalação usando uma caixa coberta com papel alumínio. </li><li> Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete. </li><li> Remover a solução de corante sobrenadante, lavar as microesferas 6X com 600 ul de metanol e em seguida com 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20, um outro 6x, tal como descrito na etapa 1.5. </li><li> Armazenar as microesferas codificadas em 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20 a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nome do tipo de microesfera: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </strong&gt; </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Eu-TTA (mM) </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C30 (mM) </td><td></td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. As concentrações de Eu-TTA e C30 soluções de trabalho. 2. Preparação de microesferas de captura de Proteína <ol><li> Preparar tampão MES [2 - (N-morfolino) etanossulfónico (MES) 0,1 M, NaCl a 0,9%, SDS a 0,01%, pH 5,7] e tampão PBS / SDS (fosfato de sódio 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS a 0,01%, pH 7,4) com antecedência à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 200 mL de suspensão de microesferas codificadas (contendo ~ 2 mg de microesferas) em um Safe-Lock 1,5 ml tubo de microcentrífuga. É importante a utilização deste tipo de tubo de microcentrífuga para evitar o derrame durante a incubação no passo 2.6. </li> &lt;li&gt; Lavar as microesferas com 600 ul de tampão MES 3x como descrito na etapa 1.5. Adicionar 700 ul de MES para o pellet de microsferas e misturar bem por pipetagem. </li><li> Prepare a 0,105 g / ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, MW = 191,7 g / mol) e 0,163 g / ml de sulfo-N-hidroxissulf (sulfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluções em tampão MES em tubos separados. </li><li> Adicionar 150 ul de solução recém-preparada de EDC, gota a gota, à suspensão de microesferas. O EDC hidrolisa muito rapidamente, pelo que é essencial para utilizar feita recentemente solução para assegurar a eficiência de imobilização. Imediatamente após a adição de EDC, adicionar 150 ul de solução de sulfo-NHS para as microesferas, misturar bem por pipetagem e verificar se a suspensão homogénea. </li><li> Tampe o tubo, selá-lo com Parafilm, e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 1.500 rpm, durante 4 horas, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio. </li><li> Centrifugar as suspens microesferasion a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul de PBS / SDS 3x tampão como descrito no passo 1.5. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão PBS / SDS ao precipitado, as microesferas misturar bem e transferir a solução para 300 ul de tampão PBS / SDS contendo 60 ug de anticorpos de captura. É importante para suspender o sedimento de microsferas primeiro e, em seguida, adicionar a suspensão de microesferas para a solução de anticorpo. </li><li> Incubar a mistura de anticorpos-microesferas agitando a 1.500 rpm, durante 4 horas em um shaker, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio. </li><li> Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul StartingBlock (TBS) bloqueando 3x tampão, como descrito no passo 1.5. </li><li> Misturar microesferas com 1 ml de TBS tampão de bloqueio e incubar microesferas a 1.500 rpm durante 1 hora, num agitador, proteger da luz usando um enseada caixavermelho com folha de alumínio. </li><li> Centrifugar a suspensão de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Lava-se a pelete 3x com 500 ul de TBS tampão de bloqueio, como descrito no passo 1.5. </li><li> Centrifugar a solução de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Adicionar 500 mL de TBS tampão de bloqueio e misture por pipetagem. </li><li> Armazenar a suspensão de microesferas modificadas a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz. </li><li> Repita este procedimento para fazer outros tipos de microesferas utilizando anticorpos correspondentes. </li></ol> 3. Assembléia Microarray de fibra óptica <ol><li> Misturar 50 ul de cada tipo de micro-esferas de captura de proteína para um novo tubo de microcentrifugação esterilizado. Centrifugue as microesferas imagens reunir a 7.000 rpm, durante 3 min, e remover o sobrenadante, de modo que o volume remanescente é de aproximadamente 100 ul. </li><li> Feixes de fibra óptica cortados à mão a cerca de 5 cm de comprimento esequencialmente polir ambas as extremidades de uma máquina de polimento, utilizando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5, e 0,05 mM de diamante de tamanho de polimento filmes. Sonicar o pacote polido em água deionizada por 2 min para remover quaisquer partículas. </li><li> Colocar uma pequena barra de agitação magnética para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, adicionar 400 mL de PBS isento de proteína padrão e agite sobre uma placa de agitação magnética durante 30 min para remover as bolhas de ar. </li><li> Etch uma das extremidades do feixe de fibras polido em uma solução 0,025 N de HCl durante 150 segundos 10,16. Imediatamente submergir e sonicate final gravado em água deionizada por 1 min. Secam-se os feixes de fibras, com ar comprimido. </li><li> Montagem do feixe de fibras sobre um suporte de fibra e bloquear a extremidade gravadas no, tampão PBS livre de proteína livre de bolhas durante 1 hora. </li><li> Depósito 1 ul alíquota da suspensão de microesferas armazenado na extremidade entalhada do feixe de fibras ópticas. Proteja a instalação da luz com uma caixa com papel alumínio e aguarde 15 min. O volume da suspensão serádiminuir por evaporação e forçar as microesferas para os micropoços gravadas. Repetir esta etapa de carregamento mais uma vez. </li><li> Utilize um cotonete saturado com solução de amostra para remover microesferas que não estão presas nos micropoços. O microarray proteína já está pronto para usar. Vá imediatamente para o passo 4.1 para a análise de saliva. </li></ol> 4. Análise Saliva Amostra Utilizando Microesferas Microarray <ol><li> Adicionar solução de amostra de 200 ul (100 ul de sobrenadante de saliva diluída com igual volume de StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio. Do protocolo de recolha de saliva sobrenadante foi publicada previamente 10). para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml autoclavado. Mergulhar o microarray de proteína carregada sobre a fibra para dentro da solução e incubar num agitador a 600 rpm durante 2 h, protegido da luz utilizando uma caixa coberta com folha de alumínio. </li><li> Preparar 20 ml de tampão de lavagem através da adição de 200 ul de solução de BSA a 10% e 200 ul de 10% de Tween-20 em 19,6 ml de PBS, mix bem agitando suavemente. </li><li> Mergulhe o microarray de proteínas em um novo tubo de microcentrífuga autoclavada contendo 200 tampão de lavagem e agitar a 600 rpm por 2 min. Repita esta lavagem 3x. </li><li> Incubar o microarray em solução de 100 mL de um cocktail de anticorpos de detecção que contém 5 ug / ml de anti-VEGF, IP-10, IL-8, FEG, MMP-9, anticorpos de detecção de IL-1β biotinilados em StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio durante 30 min à temperatura ambiente no agitador a 600 rpm, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio. </li><li> Lavar 3x com tampão de lavagem de microarray, tal como descrito na etapa 4.3. </li><li> Incubar o microarray em 200 ul de ug / ml de conjugado de R-ficoeritrina estreptavidina (SAPE) solução a 20 em PBS, a 600 rpm no agitador durante 10 minutos, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio. </li><li> Lava-se a 5x com tampão de lavagem de microarray como descrito na etapa 4.3. </li><li> Limpar a extremidade distal da fibra (isto é, na extremidade opostaa partir das microesferas) junte com um cotonete saturado com etanol absoluto. </li><li> Seca-se ambas as extremidades da fibra com o ar comprimido. Montar a fibra num microscópio de epifluorescência e imagem através da extremidade distal da fibra. </li><li> Adquirir imagens de microesferas correspondentes ao Eu-TTA, C30 e Sapé intensidades de emissão de fluorescência. Filtros ópticos configuração e tempo de exposição para imagens de fluorescência de Eu-TTA, C30 e SAPE estão representados na Tabela 2. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Canal </td><td> Eu-TTA </td><td> C30 </td><td> SAPE </td></tr><tr><td> Excitador </td><td> 365/10x </td><td> 350/50x </td><td> 546/10x </td></tr><tr><td> Refletor </td><td> 525DCLP </td><td> 400DCLP </td><td> 560LP </td></tr><tr><td> Emitter </td><td> 620/60m </td><td> 460/50m </td><td> 580/30m </td></tr><tr><td> Tempo de exposição </td><td> 1 seg</td><td> 0,3 seg </td><td> 1 seg </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Parâmetros para as três imagens fluorescentes de microarray.

<ol>
	<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li><li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Microarray. , (2004).</li><li>Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+eight+human+Th1/Th2+cytokines+using+microarrays.">Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays.</a> J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).</li><li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+multiplexed+screening+and+quantitation+of+human+cytokines+and+chemokines.">Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines.</a> J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).</li><li>de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+measurements+of+antibody+arrays+for+the+multiplexed+detection+of+low+molecular+weight+protein+biomarkers.">Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers.</a> Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).</li><li>Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+particle-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed particle-based flow cytometric assays.</a> J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-sealed+femtoliter+fiber-optic+arrays+for+single+molecule+analysis.">Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis.</a> Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).</li><li>Blicharz, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-Optic+Microsphere-Based+Antibody+Array+for+the+Analysis+of+Inflammatory+Cytokines+in+Saliva.">Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva.</a> Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).</li><li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+to+drool+for.">Devices to drool for.</a> Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).</li><li>Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+diagnostics+powered+by+nanotechnologies,+proteomics+and+genomics.">Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics.</a> J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).</li><li>Segal, A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+diagnostics:+enhancing+disease+detection+and+making+medicine+better.">Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better.</a> Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).</li><li>St John, M. A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+6+and+interleukin+8+as+potential+biomarkers+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).</li><li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics.">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).</li><li>Pantano, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+nanowell+arrays.">Ordered nanowell arrays.</a> Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).</li><li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Microarrays. , (2005).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os investigadores devem prestar atenção extra para os seguintes passos: para uma melhor precisão de decodificação, é necessário verificar as microesferas foram homogeneamente suspensa em todos incubação e lavagem etapas durante o processo de microesferas de codificação. Além disso, as microesferas codificados devem ser protegidos da luz durante todo o experimento. Após os procedimentos de codificação e armazenamento adequados, descobrimos que a precisão geral de decodificação foi acima de 99%. As micro...

Desde o primeiro microarray relatado por Mark Schena e colegas de trabalho em meados de 1990, esta poderosa ferramenta tem sido utilizada em muitos campos da pesquisa biológica 1. Microarrays de anticorpo capaz de detectar simultaneamente várias proteínas em fluidos de diagnóstico, tais como o sangue, tem aplicações importantes no diagnóstico clínico e biomarcador rastreio 2-10. Saliva, que contém muitos dos mesmos analitos como sangue, tem sido considerada como uma alternativa preferível ao sangue porque recolha de saliva é seguro, não invasivo, e pode ser levada a cabo por pessoal médico minimamente treinados 11-13. Actualmente, a análise da proteína multiplexado utilizando amostras de saliva é limitada por vários factores importantes, incluindo a baixa concentração do analito alvo 14 e o largo intervalo de concentração de diferentes biomarcadores 15. . Aqui, nós demonstramos a análise de seis proteínas: fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), proteína induzida por interferão gama, 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crescimento epidérmico (EGF), metalopeptidase matriz 9 (MMP-9), e interleucina-1 beta (IL-1β) . O desempenho do método foi inicialmente verificado utilizando soluções padrão constituindo proteínas recombinantes de analitos e tampão de bloqueio. Amostras de saliva reais coletadas de pacientes de diferentes doenças respiratórias crônicas, bem como controles saudáveis ​​também foram testados com desempenho satisfatório. O protocolo deve ser aplicável a outros analitos de proteína e outros ensaios baseados em microesferas. Esta plataforma oferece vantagens consideráveis ​​para o campo Analytical Chemistry, uma vez que permite a análise simultânea rápido, preciso e reprodutível de baixas concentrações de várias proteínas com uma gama ampla dinâmica, as interações não-específicas mínimas, reduziu o consumo de amostra, e de baixo custo em comparação com um análogo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eu-TTA dye</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC42319-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34865-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coumarin 30 dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>PC05N/6698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tw-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BupH MES buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05030-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS256-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR labshop</td>
			<td>53511-997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IP-10 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MMP-9 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-1&#946; capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 isotype control antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StartingBlock (TBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard solution 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-free (PBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGF 165</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IP-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>266-IP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human MMP-9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>911-MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-1&#946;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>201-LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StartingBlock T20 (PBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker BSA in PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated VEGF detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IP-10 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IL-8 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated EGF detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated MMP-9 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IL-1&#946; detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-phycoerythrin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-21388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent microarray for human salivary protein analysis using polymer microspheres and fiber-optic bundles

Relata-se um protocolo para medir simultaneamente seis proteínas na saliva usando uma baseada em microesfera variedade de anticorpos de fibra óptica. A tecnologia de imuno-matriz empregada combina as vantagens de suspensão à base de fabrico de microesferas de matriz com a utilização de microscopia de fluorescência. Tal como descrito no protocolo de vídeo, microesferas de polímero 4,5 mM disponíveis comercialmente foram codificados em sete tipos diferentes, diferenciadas por a concentração de dois corantes fluorescentes aprisionados fisicamente dentro das microesferas. As microesferas codificados contendo grupos carboxilo de superfície foram modificados com anticorpos de captura monoclonais através de EDC / NHS acoplamento química. Para montar o microarray de proteínas, os diferentes tipos de microesferas codificados e funcionalizados foram misturadas e depositadas aleatoriamente em 4,5 mM microcavidades, que foram quimicamente gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas. O feixe de fibras ópticas, foi usado como um portador para a imagem latente e o microspheres. Depois de montada, a micromatriz foi utilizado para capturar as proteínas no sobrenadante da saliva recolhida a partir da clínica. A detecção foi baseada num imunoensaio de sanduíche utilizando uma mistura de anticorpos de detecção de bioestanhados para diferentes analitos com uma sonda fluorescente de estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina. O microarray foram visualizados por meio de microscopia de fluorescência, em três canais diferentes, dois para o registo de microesferas e um para o sinal de ensaio. As micrografias de fluorescência foram decodificados e analisados ​​por meio de um algoritmo de caseiro em MATLAB.

As imagens de fluorescência a partir de três canais, mostrando uma pequena parte do feixe de fibras ópticas, são mostrados nas Figuras 2A-C. Estas imagens foram analisadas utilizando um algoritmo escrito em Matlab (como descrito em mais detalhe na secção Discussão). A análise utiliza tanto a informação de codificação de imagem do Eu-ATT (Figura 2A) e da imagem de codificação C30 (Figura 2B) para descodificar as microesferas, e as intensidades de fluorescê...

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Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.

Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

multiplexed-fluorescent-microarray-for-human-salivary-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.6K visualizações.  Tufts University.  Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência. 

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Gyroid Nickel Nanostructures from Diblock Copolymer Supramolecules

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, have high porosity, high surface-to-volume and strength-to-weight ratio. Unfortunately, common approaches for preparation of metallic nanostructures render materials with highly disordered architecture, which might have an adverse effect on their mechanical properties. Block copolymers have the ability to self-assemble into ordered nanostructures and can be applied as templates for the preparation of well-ordered metal nanofoams. Here we describe the application of a block copolymer-based supramolecular complex - polystyrene-block-poly(4-vinylpyridine)(pentadecylphenol) PS-b-P4VP(PDP) - as a precursor for well-ordered nickel nanofoam. The supramolecular complexes exhibit a phase behavior similar to conventional block copolymers and can self-assemble into the bicontinuous gyroid morphology with two PS networks placed in a P4VP(PDP) matrix. PDP can be dissolved in ethanol leading to the formation of a porous structure that can be backfilled with metal. Using electroless plating technique, nickel can be inserted into the template&#39;s channels. Finally, the remaining polymer can be removed via pyrolysis from the polymer/inorganic nanohybrid resulting in nanoporous nickel foam with inverse gyroid morphology.

This article describes the preparation of well-ordered nickel nanofoams via electroless metal deposition onto nanoporous templates obtained from self-assembled diblock copolymer based supramolecules.

Gyroid Nickel Nanoestruturas de dibloco copolímero supramoléculas

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, ...

Química

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous polymer monoliths. The developed approach is based on the preparation of a macroporous polymer containing carboxylic acid functional groups and the subsequent step-by-step solution-based controlled growth of a layer of a porous coordination polymer on the surface of the pores of the polymer monolith. The prepared metal-organic polymer hybrid has a high specific micropore surface area. The amount of iron(III) sites is enhanced through metal-organic coordination on the surface of the pores of the functional polymer support. The increase of metal sites is related to the number of iterations of the coating process.
The developed preparation scheme is easily adapted to a capillary column format. The functional porous polymer is prepared as a self-contained single-block porous monolith within the capillary, yielding a flow-through separation device with excellent flow permeability and modest back-pressure. The metal-organic polymer hybrid column showed excellent performance for the enrichment of phosphopeptides from digested proteins and their subsequent detection using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. The presented experimental protocol is highly versatile, and can be easily implemented to different organic polymer supports and coatings with a plethora of porous coordination polymers and metal-organic frameworks for multiple purification and/or separation applications.

A procedure for the preparation of porous hybrid separation media composed of a macroporous polymer monolith internally coated by a high surface area microporous coordination polymer is presented.

Preparação de altamente poroso Coordenação Polymer Revestimentos em macroporosas Polymer Monólitos para o enriquecimento avançado de Fosfopeptídeos

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous solution. In a carbon nanotube/PEO105-PPO70-PEO105 (poloxamer 407) aqueous solution, the amphiphilic poloxamer 407 adsorbs onto the carbon nanotube surfaces and self-assembles into continuous layers, driven by intermolecular interactions between constituent molecules. The addition of 5-methylsalicylic acid changes the self-assembled structure from spherical-micellar to a cylindrical morphology. The fabricated poloxamer 407/carbon nanotube hybrid particles exhibit thermo-responsive structural features so that the density and thickness of poloxamer 407 layers are also reversibly controllable by varying temperature. The detailed structural properties of the poloxamer 407/carbon nanotube particles in suspension can be characterized by small-angle neutron scattering experiments and model fit analyses. The distinct curve shapes of the scattering intensities depending on temperature control or addition of aromatic additives are well described by a modified core-shell cylinder model consisting of a carbon nanotube core cylinder, a hydrophobic shell, and a hydrated polymer layer. This method can provide a simple but efficient way for the fabrication and in-situ characterization of carbon nanotube-based nano particles with a structure-tunable encapsulation.

A method for the functionalization of carbon nanotubes with structure-tunable polymeric encapsulation layers and structural characterization using small-angle neutron scattering is presented.

Funcionalização da murada-Single nanotubos de carbono com termo-reversível copolímeros em bloco e caracterização por Small-angle Neutron Scattering

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ethylene-propylene rubber, grafted with maleic anhydride, is thermo-reversibly cross-linked in two steps. The pending anhydride moieties are first modified with furfurylamine to graft furan groups to the rubber backbone. These pendant furan groups are then cross-linked with a bis-maleimide via a Diels-Alder coupling reaction. Both reactions can be performed under a broad range of experimental conditions and can easily be applied on a large scale. The material properties of the resulting Diels-Alder cross-linked rubbers are similar to a peroxide-cured ethylene/propylene/diene rubber (EPDM) reference. The cross-links break at elevated temperatures (&#62; 150 &#176;C) via the retro-Diels-Alder reaction and can be reformed by thermal annealing at lower temperatures (50-70 &#176;C). Reversibility of the system was proven with infrared spectroscopy, solubility tests and mechanical properties. Recyclability of the material was also shown in a practical way, i.e., by cutting a cross-linked sample into small parts and compression molding them into new samples displaying comparable mechanical properties, which is not possible for conventionally cross-linked rubbers.

A simple two-step approach involving rubber modification and cross-linking yields fully reworkable, elastic rubber products.

A preparação e propriedades de termo-reversível reticulada Química Rubber Via Diels-Alder

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Usando Eletroforese Capilar para quantificar ácidos orgânicos a partir de tecido da planta: um caso de teste de exame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Sementes

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

Microfluidic seco-fiação e caracterização de fibras regeneradas da fibroína de seda

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

Espectroscopia de impedância eletroquímica como uma ferramenta para estimativa de constante taxa eletroquímica

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

Tempo-resolvido compostos orgânicos de Photophysical caracterização dos Triplet-colheita em um livre de oxigênio ambiente usando uma câmera de iCCD

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Using Cyclic Voltammetry, UV-Vis-NIR, and EPR Spectroelectrochemistry to Analyze Organic Compounds

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance (EPR) or ultraviolet-visible and near-infrared (UV-Vis-NIR) spectroscopies, we obtain useful information such as electron affinity, ionization potential, band-gap energies, the type of charge carriers, and degradation information that can be used to synthesize stable organic electronic devices. In this study, we present electrochemical and spectroelectrochemical methods to analyze the processes occurring in active layers of an organic device as well as the generated charge carriers.

In this article, we describe electrochemical, electron paramagnetic resonance, and ultraviolet-visible and near-infrared spectroelectrochemical methods to analyze organic compounds for application in organic electronics.

Usando Voltametria Cíclica, UV-Vis-NIR e Espectroeletroquímica EPR para Analisar Compostos Orgânicos

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of the data and determines which properties of the film can be quantified. The quartz crystal microbalance offers a uniquely sensitive platform for measuring fine changes in mass and/or mechanical properties of an applied film by observing the changes in mechanical resonance of a quartz crystal oscillating at high frequency. The advantages of this approach include its experimental versatility, ability to study changes in properties over a wide range of experimental time lengths, and the use of small sample sizes. We demonstrate that, based on the thickness and shear modulus of the layer deposited on the sensor, we can acquire different information from the material. Here, this concept is specifically exploited to display experimental parameters resulting in mass and viscoelastic calculations of adsorbed collagen on gold and polyelectrolyte complexes during swelling as a function of salt concentration.

The quartz crystal microbalance can provide accurate mass and viscoelastic properties for films in the micron or submicron range, which is relevant for investigations in biomedical and environmental sensing, coatings, and polymer science. The sample thickness influences which information can be obtained from the material in contact with the sensor.

Preparação de amostras em medições de microequilíbrio de cristal de quartzo de adsorção de proteínas e mecânica de polímeros

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...