Captura assistida por acicl-resina ou Acyl-RAC é um método sensível e confiável que pode ser usado para detectar aciilação de proteínas em uma variedade de amostras biológicas. Este protocolo contorna algumas das limitações da rotulagem metabólica e rotulagem de rádio, e permite a detecção simultânea da S-acylation de múltiplas proteínas. Não só células vivas, mas também tecidos primários e amostras congeladas.
A aciilação de S pode regular uma variedade de processos celulares, como tráfico de proteínas, segmentação de membrana plasmática, transdução de sinal, transporte de ferro e interações proteína-proteína. É importante usar a solução de hidroxilamina recém-preparada com pH cuidadosamente ajustado para cada experimento para garantir um decote eficiente e específico da ligação do tioester. Com uma demonstração deste método é fundamental para passos como clorofórmio, precipitação de metanol.
A pelota de forma de panqueca obtida durante esta etapa deve ser manuseada com muito cuidado. Pode ser frágil e a perda parcial da amostra durante a etapa pode levar à recuperação desigual da amostra. Demonstrando o procedimento será Savannah West, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório.
Para obter lisescelulares, colete as células de interesse em um tubo de centrífuga cônica. E remova qualquer detrito celular por centrifugação. Lave a pelota em 5 mililitros de PBS.
E imediatamente resuspensa as células em 600 microliters de tampão de lise recém-preparado. Agitar a amostra a 1.500 revoluções por minuto em um agitador termo por 30 minutos a 4 graus Celsius. Antes de limpar os lises, detergente de pelota e material solúvel por centrifugação.
No final da centrifugação, colete o lysate limpo em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro no gelo. E realize um ensaio de ácido bradford ou bicinchonínico para estimar a concentração de proteína de acordo com os protocolos padrão. Adicione metanol e clorofórmio à lise a uma proporção de 2:1.
Agite rigorosamente para criar uma suspensão homogênea e centrifugar a amostra para coletar uma pelota de proteína na interface entre as fases aquosa e orgânica. Inclinando o tubo, use uma agulha ou uma ponta de carregamento de gel para aspirar o máximo de solvente possível. O ar secou a pelota de proteína por alguns minutos.
Antes de misturar suavemente o conteúdo do tubo com 600 microliters de metanol, tomando cuidado para não quebrar a pelota. Depois de remover cuidadosamente a lavagem do metanol, seque a pelota de proteína em uma parte superior do banco por aproximadamente cinco minutos. Em seguida, resuspenja a pelota de proteína em 200 microliters de tampão 2SHB.
E vórtice a 42 graus Celsius e 1.500 revoluções por minuto em um agitador termo. Quando a pelota for dissolvida, adicione 200 microliters de 0,2% MMTS em 2SHB à amostra. E incubar a proteína por 15 minutos a 42 graus Celsius e 1.500 revoluções por minuto em um agitador termo.
No final da incubação, realize precipitações de clorofórmio-metanol 3:4, como demonstrado. Para remover o MMTS, dissolva a pelota em 100 microliters de tampão 2SHB fresco com vórtice. E diluir a amostra com 300 microliters de tampão A após cada precipitação.
Após a precipitação final, dissolva as amostras em 200 microliters de tampão 2SHB e diluir com 240 microliters de buffer A.Meça novamente a concentração proteica e reserve 40 microliters de cada amostra como controles de entrada. As amostras divididas em dois volumes iguais de 200 microliters. E marque os tubos como mais hidroxilamina e menos hidroxilamina.
Adicione 50 microliters de hidroxilamina neutra recém-preparada a uma concentração final de 400 mililitros ao tubo de hidroxilamina plus. E 50 microliters de dois cloretos de sódio molar neutro para o controle negativo, um tubo de hidroxilamina menos. Em seguida, adicione 30 microliters de chorume de contas TS a cada tubo.
E gire os tubos por uma a duas horas em temperatura ambiente. No final da incubação lave as contas quatro vezes com 1%SDS no buffer A para remover qualquer hidroxilamina residual. Após a última lavagem, lave todas as amostras de contas com três microcentrifugações suaves de um minuto.
Aspirando cuidadosamente os supernantes e reutilizando as contas em 500 microlitres de 1%SDS no buffer A em cada lavagem. Após a última lavagem, gire suavemente as contas como demonstrado. E aspirar o máximo de supernascida possível sem perturbar as contas.
Para recuperar as proteínas das contas, adicione 50 microliters de 4%SDS tampão de amostra em cada tubo e incubar as amostras a 80 graus Celsius e 1.500 revoluções por minuto durante 15 minutos em um agitador termo. No final da incubação, deixe as amostras esfriarem antes de centrifugar para pastar completamente as contas. Em seguida, use uma ponta de carregamento de gel para transferir as proteínas elucidadas em novos tubos de 1,5 mililitro.
E execute as amostras em um gel SDS-PAGE para analisar a S-acylation das proteínas de interesse por manchas ocidentais. Tyrosine quinase Lck pode ser detectado em lysates tratados com hidroxilamina molar neutra. para cortar a ligação thioester entre resíduos de cisteína e a moiety ácido graxo.
Descascando e rerobinando com anticorpos contra proteínas Fyn e LAT demonstram que o ensaio de captura assistida aciila-resina pode ser usado para analisar a aciilação de múltiplas proteínas ao mesmo tempo. Além disso, a aciilação de Lck, Fyn e LAT pode ser prontamente detectada em esplenócitos de camundongos primários. Indicando que esta modificação é conservada entre duas espécies.
Além da identificação de novas proteínas S-acylated, este método também pode ser usado para avaliar mudanças na proteína S-acylation em diferentes condições biológicas. O número de proteínas S-acylated recém-identificadas aumentou tremendamente após o double-up significou uma técnica rápida e confiável, como a Acyl-RAC. Além da identificação de novas proteínas S-acylated, este método também pode ser usado para avaliar mudanças na proteína S-acylation em diferentes condições biológicas.
