Este trabalho foi financiado pela NSF prêmio # 0920274 e Carolina do Sul Experiment Station Project (SC-1700340) para KSS. Este artigo é Não. Contribuição Técnica 5929 da Estação Experimental de Clemson University.

O esquema geral deste protocolo é descrito na Figura 1. 1. Preparação solução para Curvas padrão e Ensaios <ol><li> Prepare 100 mL de solução 2 mol / L de hidroxilamina-HCl. Pesar 13,9 g de cloridrato de hidroxilamina (MW 69,49 g / mol) e dissolver em aproximadamente 50 mL de água destilada deionizada-(DDH 2 O). Ajustar o pH para 7,0 utilizando pellets de hidróxido de potássio ou uma solução concentrada. Reduzir o volume final de 100 mL. A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por até 30 dias ou a 4 ° C por até 90 dias. </li><li> Prepare 100 mL de um cloreto férrico / solução de ácido clorídrico. Pesar 13,5 g de cloreto férrico (MW 270,32 g / mol) e dissolver em aproximadamente 50 mL DDH 2 O. Adicionar 41,3 mL de ácido clorídrico concentrado (12,1 mol / L) e trazer para um volume final de 100 mL. A concentração final de cloreto férrico será de 0,5 mol / L ea concentração final de ácido clorídrico será de 5 mol/ L. A solução é armazenado em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 100 mL de uma solução 1,84 mol / L de ácido trichoroacetic. Pesar 30,0 g de ácido tricloroacético (MW 163,39 g / mol), dissolver em DDH 2 O e trazer o volume final de 100 mL. A solução é armazenado em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 5 mL de uma solução de fosfato 0,1 mol / L acetil. Pesar 0,092 g de fosfato de acetila (MW 184,06 g / mol), dissolver em DDH 2 O e trazer o volume final de 5 mL. Alíquota da solução para tubos de microcentrífuga (0,25 mL por tubo) e congelar a -20 ° C até o uso. Solução de descongelado deve ser colocado sobre o gelo e pode ser usado por aproximadamente 1 hora. Solução de fosfato acetil que foram descongelados não devem ser novamente congelados e reutilizados. </li><li> Prepare 5 mL de uma solução 0,1 mol / L de ADP. Pesar 0,24 g de ADP (MW 472,5 g / mol), dissolver em DDH 2 O, e trazer o volume final de 5 mL. Alíquota da solução em tubos de microcentrífuga (0,5 mL por tubo) e congelar a -20 ° C atéuso. Mantenha solução descongeladas em gelo até o uso. </li><li> Prepare 50 mL de uma solução a 1 mol / L de Tris. Pesar 6,06 g Tris (MW 121,14 g / mol), e dissolver em 40 mL DDH 2 O. Ajustar o pH da solução para 7,0 com ácido clorídrico e trazer um volume final de 50 mL. Solução de armazenamento em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 10 mL de uma solução de cloreto de 1 mol / L de magnésio. Pesar 2,03 g de cloreto de magnésio (MW 203,31 g / mol), dissolver em DDH 2 O, e trazer um volume final de 10 mL. Guardar a solução em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 25 mL solução de desenvolvimento através da mistura de volumes iguais da solução de ácido cloreto férrico / clorídrico e solução de ácido tricloroacético. Solução de desenvolvimento deve ser renovada diariamente e armazenados à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparação de uma Curve Acetyl Phosphate Padrão <ol><li> Uma curva padrão acetil fosfato é gerado utilizando quantidades conhecidas de fosfato de acetila. Uma curva padrão de seis para dezoitopontos t é adequado. Os padrões deve variar de 0,03 a 0,9 μmoles μmoles por 300 mL, que correlaciona a concentração final de 0,1 a 3 mmol / L. Diluir a solução estoque acetil fosfato à concentrações adequadas em 100 mM Tris solução em um volume final de 300 mL. A amostra de controlo sem fosfato acetil também deve estar preparado. </li><li> Incubar cada padrão e o controle a 37 ° C em um bloco de aquecimento por 1 minuto. </li><li> Adicionar 50 mL da solução de cloridrato de hidroxilamina a cada padrão e o controle e misture agitando três vezes. Coloque o padrão em um bloco de aquecimento 60 ° C e incubar por cinco minutos. </li><li> Adicionar 100 mL de solução de desenvolvimento para os padrões eo controle, misture agitando três vezes, e permitir que a cor se desenvolva, pelo menos, um minuto à temperatura ambiente. </li><li> Centrífuga todas as normas e o controle em uma microcentrífuga a 18.000 xg por 1 minuto. </li><li> Medições com as amostras espectrofotometricamente umat 540 nm usando 1mL cubetas de plástico, usando o controle como o branco para espectrofotometria. </li><li> Gerar uma curva padrão de análise de dados apropriado e software gráficos (por exemplo, Kaleidagraph Software Synergy). Valores de R 2 de 0,99 ou superior são desejáveis. Os dados são representados como absorbância a 540 nm contra μmoles de fosfato presente acetil. </li></ol> 3. Ensaio para a atividade da quinase Acetato <ol><li> Usando as soluções descritas, prepare uma mistura de reação contendo uma concentração final de 0,1 mol / L Tris buffer, 10 mmol / L de cloreto de magnésio, 5 mmol / L ADP, fosfato e 2 mmol / L acetil. A mistura de reação 10 mL 8,2 mL exigirá DDH 2 O, 1,0 mL de solução Tris, 0,1 mL de solução de cloreto de magnésio, 0,5 mL de solução ADP, e 0,2 mL de solução de fosfato de acetila. Distribua a mistura de reacção em 300 mL alíquotas para tubos de microcentrífuga. Para a determinação de parâmetros cinéticos e otimização das concentrações de substrato, um substrato podem servariada e a outra segurava a uma concentração constante nas reações. </li><li> Pré-incubar a reação por 1 minuto a 37 ° C em um bloco de calor. </li><li> Adicionar uma quantidade desejada de enzima para a reação e devolver imediatamente o tubo para o bloco de aquecimento 37 ° C. Incluir também uma reação de controle para que não enzima é adicionado. Se várias reações são realizadas, adicione enzima para os tubos em intervalos de tempo específicos. Certifique-se de manter o controle de tempo. (NOTA: A quantidade de enzima a ser utilizada terá que ser optimizados para garantir que todos os acetil fosfato ou substrato ADP não estarão esgotados - ver secção Discussão) </li><li> Após 5 minutos, adicionar 50μl da solução de cloridrato de hidroxilamina a cada reação e no controle, misture e coloque os tubos em um bloco de aquecimento 60 ° C. Se diversas reações estão sendo realizadas, isso deve ser feito no mesmo intervalo de tempo como a enzima foi adicionada. </li><li> Incubar as reações e do controle por 5 minutos a 60 ° C. </li><li> Adicionar 100 &amp;mu; L da solução de desenvolvimento para cada reação e do controle, misture e coloque em um suporte de tubos na bancada do laboratório. Permitem que a cor se desenvolva durante pelo menos 1 minuto. </li><li> Centrifugar todos os tubos em uma microcentrífuga a 18.000 xg por 1 minuto. </li><li> Amostras medida espectrofotometricamente em 540 nm usando 1mL cubetas de plástico e determinar a quantidade de fosfato presente acetil em comparação com a curva de acetil fosfato padrão. </li><li> A quantidade de substrato fosfato de acetil esgotados pode ser determinado subtraindo-se a quantidade de fosfato acetil remanescente após a reação enzimática a partir da quantidade de fosfato de acetila presente na enzima controle faltando. Realizar a análise de dados usando dados apropriados e software gráficos (por exemplo, Kaleidagraph Software Synergy). Valores de R 2 superiores a 0,97 são desejáveis. </li></ol> 4. Resultados representativos: O objetivo deste ensaio é medir a atividade quinase de acetato na diretaion de formação de acetato. Isto é feito através da medição de consumo do substrato fosfato de acetil, como não há medição, fácil e direta para a produção de acetato. Fosfato acetil remanescentes após um determinado tempo durante a reação enzimática é convertido em acetil hidroxamato e, posteriormente, para o complexo hidroxamato férrico, que tem uma cor avermelhada (Figura 2) que pode ser medido em 540 nm. A curva padrão traçando absorbância versus μmoles presente acetil fosfato nos padrões é usado para determinar a quantidade de fosfato acetil remanescentes em cada reação. A curva padrão deve ser linear através do ponto zero. A curva representativa padrão mostrado na Figura 3 tem uma inclinação de 1,2332 unidades de absorbância por apresentar fosfato μmole acetil e um valor de R 2 de 0,99, indicando os dados ajusta a equação linear assim. A equação para o ajuste linear para os dados da curva padrão é usado para calcular a quantidade de fosfato de acetil remanescentes na reação. O μmolesde fosfato de acetil consumida é determinada como a diferença entre o μmoles de fosfato de acetila presentes na reação controle sem enzima e do μmoles de fosfato de acetil remanescente após a reação enzimática. Purificada, M. recombinante thermophila acetato quinase foi quantificada usando o protocolo descrito. Para o experimento mostrado na Figura 4, a concentração de ADP foi mantida constante em 5 mmol / L ea concentração de fosfato de acetila na reação foi variado para determinar o K m para o fosfato de acetila. Como esperado, este experimento demonstra que a enzima segue padrão de Michaelis-Menten-like cinética para cada substrato e produziu uma curva de saturação hiperbólica ao plotar atividade versus concentração de fosfato de acetila. A aparente K valor m para o fosfato de acetila foi de 0,27 ± 0,01 mmol / L, o que compara favoravelmente com a publicação de valor K m de 0,47 ± 0,01 mmol / L usando o juntamente comodigo 13. O ensaio direto também pode ser usado para medir a atividade de quinases de acetato que utilizam outros substratos de ATP, o que não é possível usando o ensaio padrão acoplado. Purificada E. recombinante acetato quinase histolytica 16, que produz PP i ao invés de ATP na direção de acetato de formação, foi submetido a este ensaio utilizando fosfato de sódio no lugar de ADP. A concentração de fosfato de sódio na reação foi mantida constante em 0,2 mol / L ea concentração de fosfato de acetil foi variado. Quanto ao M. thermophila acetato quinase, o E. histolytica acetato quinase seguido Michaelis-Menten-like cinética para o fosfato de acetila e uma curva de saturação hiperbólica foi observada (Figura 5). A aparente K valor m para o fosfato de acetila foi de 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves e Guthrie 15 determinou um valor de K m de 0,06 mmol / L de fosfato para a enzima acetil nativas; como<html> nunca, a sua enzima foi parcialmente purificada e suas ensaio envolveu quatro enzimas de acoplamento que também foram apenas parcialmente purificada. Assim, é difícil comparar diretamente esses valores. Protocolo Scheme <ol><li> Gerar uma curva padrão acetil fosfato </li><li> Enzima para diluir a concentração desejada </li><li> Preparar a reação da mistura e alíquota 300 ml para tubos de microcentrífuga </li><li> Reações Pré-incubação a 37 ° C por 1 minuto </li><li> Iniciar reações adicionando enzima em intervalos de tempo específicos </li><li> Adicionar hidroxilamina com os mesmos intervalos para parar as reações e incubar a 60 ° C por 5 minutos </li><li> Adicionar cloreto férrico / solução de ácido tricloroacético para o desenvolvimento de cor </li><li> Centrifugar a 18.000 xg tubos durante 1 minuto </li><li> Medir a absorvância a 540 nm </li><li> Determinar a quantidade de fosfato de acetil consumida por comparação com a curva padrão </li></ol>tp_upload/3474/3474fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Scheme Protocolo <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" /> Figura 2. Acetyl padrões de fosfato. Concentrações crescentes de fosfato de acetila foram reagiu com hidroxilamina e cor foi desenvolvida como descrito. O controle falta de fosfato de acetila é amarelo brilhante, e as reações contendo quantidades crescentes de fosfato de acetil são sucessivamente de cor mais escura. Esta mudança de cor é medida em 540 nm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" /> Figura 3. Sample curva padrão acetil fosfato. Diferentes quantidades de fosfato de acetila foram reagiu com hidroxilamina, e a solução de desenvolvimento de cor e absorbância foi medida em 540 nm. A absorvância a 540 nm contra μmoles fosfato de acetil foi plotada e um ajuste linear aos dados foi aplicado. &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" /> Figura 4. Utilização de fosfato de acetil pela M. ATP de produção thermophila quinase acetato. Atividade enzimática foi determinada na direção da formação de acetato na presença de 5 mmol / L ADP com diferentes concentrações de fosfato de acetila. A quantidade de fosfato consumido acetil foi determinada como a diferença entre o montante inicial de fosfato de acetila na reação e da quantidade de fosfato de acetil remanescente após a reação enzimática. Os ensaios foram realizados em triplicata com barras de erro mostrada. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" /> Figura 5. Utilização de fosfato de acetil pelo PP i-produzindo E. histolytica quinase acetato. Atividade enzimática na direção da formação de acetato foi determinada na presença de 0.Fosfato de sódio 2 mol / L com diferentes concentrações de fosfato de acetila. A quantidade de fosfato consumido acetil foi determinada como a diferença entre o montante inicial de fosfato de acetila na reação e da quantidade de fosfato de acetil remanescente após a reação enzimática. Os ensaios foram realizados em triplicata com barras de erro mostrada.

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	<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins,+sugar+kinases,+actin,+and+hsp70+heat+shock+proteins.">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds:+the+hexokinase,+ribokinase,+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases.">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li><li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urkinase:+structure+of+acetate+kinase,+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases.">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li><li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+kinase/heat+shock+protein+70/actin+superfamily:+implications+of+conserved+structure+for+mechanism.">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li><li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ATP-binding+fold+in+actin,+hexokinase+and+Hsc70.">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequence+analysis,+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li><li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li><li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+transition+state+analog,+MgADP-aluminum+fluoride-acetate,+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li><li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase.">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li><li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li><li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching.">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li><li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase+(pyrophosphate).+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica.">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li><li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica.">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , (2011).</li><li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate.">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li><li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates.">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li><li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction.">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li><li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+phosphorylation+of+acetate.">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li><li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation.">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li><li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants.">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li><li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity:+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate.">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li><li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus.">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A detecção de fosfato de acetil neste ensaio é dependente de uma concentração suficiente de cloridrato de hidroxilamina, e da concentração e da acidez da solução de cloreto férrico. Alteração do volume de ensaio requer a reconsideração de ambos os componentes. As reações enzimáticas descritas aqui foram realizados a 37 ° C com o término hidroxilamina realizada a 60 ° C por 5 minutos. Esta temperatura mais elevada é fundamental para permitir a rápida conversão do fosfato restantes acetil para hidro...

<table border="1"><tr><td width="160"> Nome do reagente </td><td width="108"> Companhia </td><td width="134"> Número de catálogo </td><td width="103"> Comentários </td></tr><tr><td> Fosfato de acetila </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 01409 </td><td> Sal de lítio (97%) </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico (desidratar) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico (anidro) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio (hexa) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base de Dados </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto férrico (hexa) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido tricloroacético </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de hidroxilamina </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosina 5&#39;-difosfato sal de sódio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> BIOMATE III Espectrofotômetro </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> Espectrofotômetro UV / Vis padrão </td></tr></table>

direct detection of the acetate-forming activity  of the enzyme acetate kinase

Quinase acetato, um membro do acetato e-quinase Hsp70-actina açúcar superfamília de enzimas (ASKHA) 1-5, é responsável pela fosforilação reversível de acetato de acetil fosfato ATP, utilizando como substrato. Acetato de quinases são onipresentes na bactéria, encontrada em um gênero de Archaea, e também estão presentes em micróbios da Eukarya 6. O acetato quinase mais bem caracterizado é que a partir do metano produzindo archaeon Methanosarcina thermophila 14/07. Uma quinase de acetato, que só pode utilizar PP i ATP, mas não na direção do acetil-fosfato formando foi isolado de Entamoeba histolytica, o agente causador da disenteria amebiana, e até agora só foi encontrado nesta 15,16 gênero. Na direção da formação de fosfato de acetil, acetato de atividade da quinase é normalmente medido utilizando o ensaio de hidroxamato, primeiramente descrita por Lipmann17-20, um ensaio acoplado em que a conversão de ATP a ADP é acoplada a oxidação de NADH para NAD + pela enzimas piruvato quinase e lactato desidrogenase 21,22, ou um ensaio de medição de liberação de fosfato inorgânico após a reação do produto acetil fosfato com hidroxilamina 23. Atividade no lado oposto, o acetato de formação de sentido é medida pelo acoplamento formação de ATP a partir de ADP para a redução do NADP + a NADPH pela hexoquinase enzimas e glicose 6-fosfato desidrogenase 24. Aqui nós descrevemos um método para a detecção de atividade de acetato quinase na direção da formação de acetato de que não necessita de enzimas de acoplamento, mas em vez disso é baseada na determinação direta do consumo de fosfato de acetila. Após a reação enzimática, permanecendo acetil fosfato é convertido em um complexo hidroxamato férrico que pode ser medido espectrofotometricamente, como para o ensaio hidroxamato. Assim, ao contrário do stensaio acoplado andard para esta direcção, que é dependente da produção de ATP a partir de ADP, este ensaio direto podem ser utilizados para quinases acetato que produzem ATP ou PP i.

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Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Um método para a determinação da atividade da quinase de acetato é descrito. Este ensaio utiliza uma reação direta para determinar a atividade enzimática e cinética de acetato quinase na direção de formação de acetato com diferentes aceptores fosforil. Além disso, este método pode ser utilizado para a dosagem de fosfato de acetila ou outras enzimas acetil-CoA utilizando.

Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

direct-detection-acetate-forming-activity-enzyme-acetate

Research

JoVE Journal

Biology

23.0K visualizações.  Clemson University. Um método para a determinação da atividade da quinase de acetato é descrito. Este ensaio utiliza uma reação direta para determinar a atividade enzimática e cinética de acetato quinase na direção de formação de acetato com diferentes aceptores fosforil. Além disso, este método pode ser utilizado para a dosagem de fosfato de acetila ou outras enzimas acetil-CoA utilizando.

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Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Detecção de Ubiquitinação Protein

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biologia

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME Método (Enzyme Linked Immuno Magnetic eletroquímica) para Detecção de micotoxinas

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

GC baseado em detecção de ácido Aldononitrile Glucosamina e Murâmicos Acetato derivatizados à determinação do resíduo microbiana em solo

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the foundation to develop novel strategies for pest control. Here, a series of methods are described that are routinely utilized to determine the functional roles of neuropeptides and other neuronal factors (i.e., biogenic amines) on the excretory system of the mosquito, Aedes aegypti. The Malpighian tubules (MTs), responsible for primary urine formation, can continue functioning for hours when removed from the mosquito, allowing for fluid secretion measurements following hormone treatments. As such, the Ramsay assay is a useful technique to measure secretion rates from isolated MTs. Ion-selective microelectrodes (ISME) can sequentially be used to measure ion concentrations (i.e., Na+ and K+) in the secreted fluid. This assay allows for the measurement of several MTs at a given time, determining the effects of various hormones and drugs. The Scanning Ion-selective Electrode Technique uses ISME to measure voltage representative of ionic activity in the unstirred layer adjacent to the surface of ion transporting organs to determine transepithelial transport of ions in near real time. This method can be used to understand the role of hormones and other regulators on ion absorption or secretion across epithelia. Hindgut contraction assays are also a useful tool to characterize myoactive neuropeptides, that may enhance or reduce the ability of this organ to remove excess fluid and waste. Collectively, these methods provide insight into how the excretory system is regulated in adult mosquitoes. This is important because functional coordination of the excretory organs is crucial in overcoming challenges such as desiccation stress after eclosion and before finding a suitable vertebrate host to obtain a bloodmeal.

This protocol outlines methodologies behind the Ramsay assay, ion-selective microelectrodes, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) and in vitro contraction assays, applied to study the adult mosquito excretory system, comprised of the Malpighian tubules and hindgut, to collectively measure ion and fluid secretion rates, contractile activity, and transepithelial ion transport.

Estudando a Atividade de Neuropeptídeos e Outros Reguladores do Sistema Excretório no Mosquito Adulto

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...