Este protocolo permite a rotulagem específica e posterior enriquecimento e identificação de substratos ck2 endógenos de uma amostra biológica complexa, como uma célula ou tecido lysate. Este método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou tecido. Facilitando, o estudo do CK2 em diversos contextos biológicos.
Demonstrando o procedimento será John Chojnowski, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, mecanicamente, lise a amostra de tecido ou células cultivadas conforme descrito no protocolo de texto para coletar um total de 900 microlitadores de amostra. Centrífuga a 17.500 vezes a gravidade e a 4 graus celsius por três minutos.
Em seguida, transfira 270 microlitadores do supernaente para cada um dos três novos tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Remova 40 microliters do supernatante restante para ser usado como controle de entrada e transfira-o para um novo tubo. Coloque todas as amostras no gelo.
Primeiro, rotule cada um dos três tubos de amostra, como mostrado aqui. Ao tubo Kinase Reaction, adicione 2,7 microliters de CK2 e 2,7 microliters de 2,5 mililitros GTPgammaS. Flick o tubo para misturar, e imediatamente colocá-lo no gelo.
Apenas ao tubo GTPgammaS, adicione 2,7 microliters de 2,5 mililitros GTPgammaS e 2,7 microliters de Lysis Buffer. Flick este tubo para misturar, e imediatamente colocá-lo no gelo. Ao tubo PNBM apenas adicione 5,4 microliters de Lysis Buffer.
Flick o tubo para misturar, e imediatamente colocá-lo no gelo. Incubar os três tubos em um banho de água a 30 graus Celsius por um minuto. Depois disso, adicione 13,5 microliters de PNBM a 12 miligramas por mililitro em cada tubo.
Inverta os tubos para misturar as amostras e incubar as amostras à temperatura ambiente por uma hora. Enquanto as amostras estão incubando, rotule cada uma das colunas para que a amostra seja carregada, como mostrado aqui. Prepare as colunas invertendo cada coluna várias vezes para resuspensar a resina Sephadex G-25 no buffer de armazenamento.
Coloque cada coluna em um suporte de grampo e deixe-a sentada sem ser perturbada por aproximadamente cinco minutos para deixar a resina se instalar. Em seguida, coloque um tubo abaixo da abertura inferior de cada coluna. Remova as tampas tanto da parte superior quanto da parte inferior de cada coluna, para permitir que o buffer de armazenamento escorra para os tubos por gravidade.
Uma vez que o buffer de armazenamento esteja esgotado, adicione aproximadamente 2,7 mililitros de Tampão de Lysis a cada coluna para equilibrá-los, certificando-se de coletar e descartar o fluxo através. Repita este processo de adicionar Lysis Buffer e descartar o fluxo através de três vezes. Para começar, carregue cada amostra em sua respectiva coluna.
Coletar e descartar o fluxo através. Adicione 420 microliters de Tampão de Lise a cada coluna para lavar as amostras. Deixe o tampão de lise filtrar a coluna e coletar e descartar o fluxo.
Em seguida, coloque os tubos em posição sob cada coluna para coleta de amostras. Adicione 500 microliters de Tampão de Lysis a cada coluna para eluto das amostras. Colete o fluxo através, que agora contém uma população enriquecida de substratos CK2 tiofosforilados e alquilados na reação de quinase.
A reação somente gtpgammas conterá substratos tiofosforilados e alquilados por qualquer CK2 endógeno presente. A reação única da PNMB conterá proteínas alquiladas de fundo. Remova 80 microliters de cada Elução como uma amostra de controle de entrada de elução.
Em seguida, divida cada amostra em dois tubos que contêm 200 microliters. Rotule cada um dos tubos como sendo ester anti-tiofosfato ou imunoglobulina G, como mostrado aqui. Adicione 2,8 microgramas de anticorpo éster antiofosfato a cada um dos tubos de éster antiofosfato.
Adicione 2,8 microgramas de anticorpo isótipo controle a cada um dos tubos IGG. Em seguida, coloque os tubos em um rotador a quatro graus Celsius por duas horas. Durante os últimos 15 minutos da incubação da amostra, use uma lâmina de barbear limpa para cortar a extremidade de uma ponta de pipeta P200 para aumentar o tamanho do medidor.
Imediatamente antes do uso, o vórtice brevemente o tubo de armazenamento contendo as contas agarose. Usando a ponta de pipeta cortada, transfira 100 microliters das contas por imunoprecipitação para um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. É importante vórtice as contas antes de cada transferência para evitar que as contas se instalem.
Centrifugar os tubos a 17.500 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por um minuto. Remova e descarte o supernaspe. Resuspenja as contas adicionando 200 microliters de Lysis Buffer e brevemente vórtice para misturar.
Repita este processo de centrifugação e lavagem das contas três vezes. Após a lavagem final, coloque as contas no gelo até que esteja pronto para prosseguir. Quando as amostras terminarem de incubar, centrifuá-las a 17.500 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por três minutos.
Em seguida, transfira 200 microliters de cada amostra para os tubos contendo as contas lavadas. Coloque os tubos em um rotador a quatro graus Celsius durante uma hora. Em seguida, centrifugar os tubos a 17.500 vezes de gravidade e a quatro graus Celsius por um minuto.
Remova 40 microliters de cada supernatante para economizar como um controle de esgotamento. Remova e descarte o restante do supernaspeuta, tomando cuidado para não perturbar as contas. Lave as amostras adicionando 200 microliters de Tampão de Lysis a cada um e vórtice brevemente.
Centrífuga a 17.500 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por um minuto, descartando o supernante. Repita este processo de lavagem e centrifugação três vezes tomando cuidado para não perturbar as contas. Depois disso, adicione 50 microliters de tampão de amostra 2X a cada amostra contendo contas.
Para todas as outras amostras, que incluem o Controle de Entrada, os Controles de Entrada de Elução e os Controles de Esgotamento, adicione 8 microliters de buffer de amostra 6X. Pipeta cada tubo para cima e para baixo para misturar com exceção de tubos contendo contas, e aquecer todas as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos antes de prosseguir com ODS-PAGE. Para avaliar se a imunoprecipitação foi bem sucedida, execute de 25 a 30 microlitres de cada amostra que foi iludida de contas em um gel de poliacrilamida separado de 12,5%.
Colorisse cada gel com Coomassie Blue para visualizar proteínas enriquecidas de vários estágios do protocolo experimental. Usando lâminas de barbear novas e limpas, extirpa cuidadosamente quaisquer bandas únicas presentes na reação de quinase anti-tifosfato ér IP Lane enquanto anotam seus pesos moleculares aproximados. Uma nova lâmina de barbear deve ser usada para cada banda única.
A base subjacente desta técnica é esta técnica é a habilidade incomum de CK2 para usar GTP para transferência de grupo fosforila. A adição de holoenzima CK2 exógena junto com o analógico GTP, GTPgammaS, a um lisetê celular, resulta em uma tiafosforilação de substratos CK2 endógenos. O tratamento subsequente do lysato com o reagente alquilante p-Nitrobenzyl mesillate gera moiety ester de tiofosfato nessas proteínas específicas do substrato, que podem então ser imunoprecipitados usando um anticorpo ester anti-tiofosfato e, finalmente, identificado pela espectrometria de Massa.
Nos resultados positivos representativos aqui apresentados, foram bem sucedidos os resultados dependentes da CK2, a tiafosforilação e a alquilação subsequente. Como esperado, um sinal de éster anti-tiofosfato aprimorado por manchas ocidentais é observado apenas na pista contendo a reação completa da quinase, e não apenas no GTPgammaS e amostras tratadas apenas por PNMB. Um gel manchado Coomassie Blue das proteínas imunoprecipitadas e aludidas, também demonstram um resultado positivo.
Como várias bandas únicas são evidentes apenas no éster anti-tiofosfato IP Lane, no qual o lysate foi incubado com exógeno CK2 e GTPgammaS. A banda marcada é então extirpada do gel e submetida à identificação de proteínas por espectrometria de massa. Após este procedimento, substratos putativos CK2 identificados por espectrometria de massa devem ser validados usando uma abordagem adicional, como por CK2 a fosforilação dependente em um ensaio padrão in vitro quinase.
