Agradecemos o apoio financeiro do prêmio NSF CMMI-1000724.

1A. Formação monocamada primário no Silicon <ol><li> Cut wafer de silício em substratos 1cm 2, pó e enxágüe com água filtrada e de etanol. </li><li> Eliminar a contaminação orgânica, submergindo os substratos de silício em um prato de vidro contendo Nano strip em 75 º C. Após 15 minutos, lave cada substrato com água, deionizada filtrada. </li><li> Coloque cada substrato em uma solução de HF 5% (Aviso: HF é um material extremamente perigoso) para remover a camada de óxido nativo. Após 5 minutos seque o óxido de silício livre com nitrogênio </li><li> Para produzir um substrato clorado, imediatamente mergulhe cada pedaço de óxido livre de silício em um frasco de cintilação contendo 2 ml de PCl 5 saturada em clorobenzeno. Esta solução deve ser filtrada para 0,2 mm. </li><li> Montar um condensador frasco em cima de cada frasco e colocá-los em um conjunto heatblock a 112 ° C por uma hora. </li><li> Após a reação está completa, deixe esfriar e enxaguar os frascos cada surface com clorobenzeno e seco sob nitrogênio filtrado. </li><li> Para formar um substrato propenil-termina, o lugar de cada superfície de silício clorados em um frasco de pressão contendo 4 ml de cloreto de magnésio propenil. Coloque cada frasco de pressão em um heatblock a 130 ° C por 24 horas. </li><li> Tome cada frasco de pressão fora do heatblock e deixe esfriar. </li><li> Lave a superfície de cada rapidamente com DCM e etanol e seco sob nitrogênio filtrado. </li></ol> 1B. Formação primário em monocamada de germânio <ol><li> Cut wafer em substratos de germânio 1cm2, poeira e enxaguar com água filtrada e de etanol. </li><li> Eliminar a contaminação orgânica, submergindo as superfícies em um prato de vidro contendo acetona por 20 minutos </li><li> Coloque cada superfície em uma solução de HCl 10% por 15 minutos. Este processo, simultaneamente, remove a camada de óxido nativo e chlorinates a superfície. Após 5 minutos secar a substratos com nitrogênio. </li><li> Para formar um substrato octil-encerrado, place cada clorados superfície germânio em um frasco de pressão contendo 4 ml de cloreto de magnésio octil (2 mM). Coloque cada frasco de pressão em um heatblock a 130 ° C por 48 horas. </li><li> Tome cada frasco de pressão fora do heatblock e deixe esfriar à temperatura ambiente. </li><li> Lave a superfície de cada rapidamente com DCM e etanol e seco sob nitrogênio filtrado. </li></ol> 2. NHS funcionalização do substrato sobre o silício eo germânio <ol><li> Prepare uma solução de 0,1 M filtrada NHS-diazirine em tetracloreto de carbono. Aviso: Mantenha a exposição à luz a um mínimo. </li><li> Pipeta algumas gotas da solução sobre as superfícies de metila encerrado. Deixa-se espalhados por toda a superfície. </li><li> Coloque as superfícies sob uma lâmpada UV (☐ = 254 nm, 4400/cm2 em 0,74 polegadas). Permitir que as superfícies a reagir sob luz UV por 30 minutos, em seguida, adicione mais NHS-diazirine para a superfície e deixe a reação prosseguir por mais 30 minutos. </li><li> Lavar o NHS modificado surfaces com DCM e etanol e seco sob nitrogênio filtrado. </li></ol> 3. Funcionalização pequena molécula <ol><li> Reagir NHS-substratos modificados em 20 mM terc-butil carbamoil (Boc) etilenodiamina em solução de diclorometano (DCM) por duas horas em temperatura ambiente. </li><li> Após a reação, lavar o substrato Boc-modificado com DCM e etanol. </li><li> Desproteger o Boc substrato modificado usando 25% de ácido trifluoroacético (TFA) em DCM de uma hora em temperatura ambiente. </li><li> Lave a superfície resultante com DCM, etanol e 10% (w / v) de bicarbonato de potássio em água e seco sob nitrogênio filtrado. </li><li> Analisar todas as superfícies por XPS para determinar a composição elementar. </li></ol> 4. Poliuretano ácidas acrilato Stamp (PUA) Preparação <ol><li> Diluir acrilato A em 30% com trimetilolpropano B triacrylate etoxilato para reduzir a viscosidade. Adicionar fotoiniciadores C e D para a mistura de reação (Fig.ure 6). </li><li> Adicionar sódio 2-mercaptoethanesulfonate (0,2 g, 1,22 mmol) a uma solução HCl 4N em dioxano (10 ml) e agitar à temperatura ambiente por 2 minutos. </li><li> Filtro fora do cloreto de sódio primeiro através de um filtro de vidro fino e depois através de uma seringa de 0,2 μ m de membrana PTFE filtro para pagar uma solução clara de 2-mercaptoethanesulfonic ácido em dioxano. </li><li> Dioxano evaporar sob pressão reduzida </li><li> Reagir o ácido sulfônico resultante com 2 ml da mistura de acrilato de poliuretano-prepolymeric à temperatura ambiente e depois sob vácuo a 50 ° C. Certifique-se completamente livre a mistura de bolhas de ar aprisionadas. </li><li> Esfriar a solução resultante à temperatura ambiente e polimerizar entre duas lâminas de vidro de microscópio, ou uma lâmina de vidro e um mestre pela exposição à luz UV por 2 horas em temperatura ambiente. </li><li> Após a polimerização, cuidadosamente peel off o selo do mestre e lavar o selo com etanol e água e seque com nitroge filtradan. </li></ol> 5. Impressão catalítico e SEM / AFM Análise <ol><li> Coloque o selo de poliuretano-acrilato correspondente na parte superior do substrato NHS-modificada em temperatura ambiente por um minuto sem carga externa para mantê-los juntos. </li><li> Após a reação, separar o selo e substrato. </li><li> Lavar o substrato com o etanol, água e etanol, em seguida, seco com nitrogênio filtrado. </li><li> Enxágüe o selo com o etanol, água e etanol, em seguida, seco com nitrogênio filtrado. </li><li> Manter os selos em temperatura ambiente antes da aplicação seguinte. </li><li> Analisar o padrão produzido usando o modo de contato microsopy força lateral atômica (AFM) e microscopia eletrônica de varredura (SEM) </li></ol> 6. Padronização de proteína e Microscopia fluorescente <ol><li> Substrato submergir o NHS-padrão bifuncional em Lisina-N, N-diacetic ácido (20 mM) e Et 3 N (100 mM) em DMF: H20 (1:1) em temperatura ambiente por 1 hora e depois lavados comágua e etanol. </li><li> Incubar os substratos em uma solução de 50 mM NiSO4 por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Enxaguar os substratos quelatado abundantemente com água e tampão de ligação (20 mM NAP, 250 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 7,5) e submergir em uma solução de GFP filtrado (~ M μ 40) para uma hora a 0 ° C. </li><li> Lave imediatamente os substratos com tampão de ligação seguido de PBS (pH 7,4). </li><li> Manter hidratado substratos em PBS a 0 ° C até que eles estavam prontos para a análise de microscopia de fluorescência. </li></ol> 7. Padronização de proteína e Microscopia fluorescente <ol><li> Substrato submergir o NHS-padrão bifuncional em Lisina-N, N-diacetic ácido (20 mM) e Et 3 N (100 mM) em DMF: H 2 0 (1:1) em temperatura ambiente por 1 hora e depois lavados com água e etanol. </li><li> Incubar os substratos em um NISO 50 4 mM solução por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Enxaguar os substratos quelatado excessivamente wom água e tampão de ligação (20 NAP mM, 250 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 7,5) e submergir em uma solução de GFP filtrado (~ 40 mM) para 1 hora a 0 ° C. </li><li> Lave imediatamente os substratos com tampão de ligação seguido de PBS (pH 7,4). </li><li> Manter hidratado substratos em PBS a 0 ° C até que eles estavam prontos para a análise de microscopia de fluorescência. </li></ol> 8. Resultados representativos: Um exemplo de soft-litográfica padronização nano catalisador é mostrado na Figura 7. A abordagem cria padrões quimioseletiva em óxido de silício e germânio livre, que pode ser ortogonalmente funcionalizados com diferentes produtos químicos e biológicos metades. A reação entre o substrato NHS-functioanlized eo carimbo padronizado catalisador leva à hidrólise de metades NHS em áreas de contato conformal, gerando um padrão regiões substrato bifuncional rolamento do NHS ativado e ácidos carboxílicos. Devido à diffusion natureza livre do nosso método, podemos obter uma resolução próxima da fotolitografia. Por exemplo, a Figura 7 mostra 125 nm características, que foram reproduzidos de maneira uniforme por toda a superfície de silício substrato. Notavelmente, o selo catalítico pode ser reutilizado várias vezes sem perder a eficiência. Funcionalização quimiosseletiva de semicondutores modelado com biomoléculas abre a perspectiva de integração de materiais tradicionais com eletrônica altamente seletivos substratos biológicos para aplicações em sensoriamento, diagnósticos e analíticos áreas de pesquisa. Um exemplo de funcionalização como é mostrado na Figura 8, onde NHS-padrão de silício foi seletivamente funcionalizados com moléculas de proteína. Explorando a reatividade diferencial de ativado e ácidos carboxílicos livres, nós primeiro selo nitrilotriacético ácido terminada (NTA) linkers heterobifunctional às regiões NHS-funcionalizada, e depois usou o resultadoNTA-padrão de superfície como um modelo para a fixação seletiva de hexa-histidina-tag GFP. Figura 8b mostra claramente a intensidade de fluorescência diferencial entre GFP-modificados e hidrolisados ​​regiões livres de ácido carboxílico. O tamanho ea forma das características replicados são consistentes entre os dois superfície modelada NHS (Figura 8a) e GFP-modificados superfície (Figura 8b), confirmando a estabilidade notável de carbono passivado superfícies ea seletividade da abordagem de estamparia. O protocolo não se limita a His-tag proteína, e pode ser usado para biomoléculas padrão, incluindo DNA e anticorpos. <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquema geral representando a impressão microcontact catalítico <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Estrutura de bi-camadas msistema olecular em Ge e Si. Monocamada de alquila primários formas estáveis ​​Ge-Si-C ou C laços com o substrato e fornece um sistema quimicamente inerte e fechar embalado que protege a superfície subjacente da degradação. (B) overlayer Secundária forma ligações CC estável, com camada protetora primária e fornece terminal funcional grupos <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Esquemas de reação que representa a formação de monocamadas principal protetor sobre Si (A) e Ge (B) <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Funcionalização química da monocamada primária de proteção com um doador carbeno heterobifunctional <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Reaction esquema demonstrando modificações pequena molécula de NHS-funcionalizados subsíveis e os espectros XPS correspondente <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Composição da pré-mistura polimérica catalítica, condições de polimerização, e as imagens SEM da sulfônico selo padronizado de ácido-modificados e à correspondente PMMA-Si mestre <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. SEM e AFM imagens de fricção de SAMs estampados em Si e Ge com um selo de ácido <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8 Soft-litográfica padronização e funcionalização de silício passivado com moléculas orgânicas e biológicas a:.. Imagem SEM do NHS-padrão modificado substrato b:. Micrografia fluorescentes da GFP substrato modificado.

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P., Rothuizen, H., Schmid, H., Schmidt-Winkel, P., Stutz, R., Wolf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+meets+lithography:+Soft+approaches+to+high-resolution+printing.">Printing meets lithography: Soft approaches to high-resolution printing.</a> IBM Journal of Research and Development. 45 (5), 697-719 (2001).</li><li>Libioulle, L., Bietsch, A., Schmid, H., Michel, B., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Inking+Stamps+for+Microcontact+Printing+of+Alkanethiols+on+Gold.">Contact-Inking Stamps for Microcontact Printing of Alkanethiols on Gold.</a> Langmuir. 15 (2), 300-304 (1999).</li><li>Sharpe, R. B. A., Burdinski, D., Huskens, J., Zandvliet, H. J. W., Reinhoudt, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-Lithographic+Approach+to+Functionalization+and+Nanopatterning+Oxide-Free+Silicon.">Soft-Lithographic Approach to Functionalization and Nanopatterning Oxide-Free Silicon.</a> Langmuir. 27 (10), 6478-6485 (2011).</li></ol>

Não temos nada a divulgar

O protocolo apresentado é uma forma ou de impressão microcontact inkless que pode ser universalmente aplicadas a qualquer substrato capaz de suportar simples bem-ordenada monocamadas. Neste método, um selo-imobilizada catalisador transfere um padrão para uma superfície de apoio correspondentes grupos funcionais. Porque o processo não depende de transferência de tinta de carimbo para a superfície da limitação resolução difusivo de μCP tradicional e reativa é evitado, permitindo fabricação rotina de objetos em nanoescala. A incorporação de um sistema altamente ordenado molecular primária fornece proteção completa do semicondutor subjacente dos danos da oxidação. Ao mesmo tempo, o método oferece suporte imobilização de volumosos grupos reativos utilizando um overlayer secundário reativa; juntos o sistema alcança tanto a proteção e funcionalização. A técnica começa com a formação de carbono estável superfície títulos permitindo primar quimicamente inertey monocamada que serve como uma barreira efetiva para a formação de óxido. Formação de um overlayer secundário reativa fornece grupos terminal NHS funcionais que servem como pontos de fixação para uma variedade de moléculas químicas e biológicas. Este sistema bicamadas estável molecular é posteriormente modelado usando nossa abordagem μCP catalítico. A abordagem apresentada neste estudo oferece um método geral para substratos semicondutores padronização com uma ampla gama de materiais orgânicos e biológicos. A capacidade de criar padrões de semicondutores orgânicos interfaces sem instrumentação, caro complexo oferece inúmeras oportunidades em áreas como eletrônica, nanotecnologia, bioquímica e biofísica.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Empresa / modelo </th></tr><tr><td> Espectrômetro de XPS </td><td> Kratos Axis Ultra </td></tr><tr><td> Microscópio de força atômica </td><td> Veeco D3100 </td></tr><tr><td> SEM-FEG microscópio </td><td> FEI XL30 </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Zeiss Axio Imager </td></tr><tr><td> Heatblock </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> Boc Edwards </td></tr><tr><td> Sistema de purificação de água </td><td> Millipore </td></tr><tr><td> Tesp sondas de silício </td><td> Veeco </td></tr><tr><td> Silício </td><td></td></tr><tr><td> Frascos de pressão </td><td> Chemglass </td></tr><tr><td> Colector de vácuo </td><td> Chemglass </td></tr><tr><td> Lâmpada UV </td><td> UVP </td></tr><tr><td> Selo de materiais </td><td> Ver referências 20 e 18 </td></tr><tr><td> Seringa filtros PFTE </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Nano Faixa </td><td> Cyantek </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> HF </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Clorobenzeno </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> PCl5 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Propenil Cloreto de Magnésio </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Cloreto de Magnésio octil </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Tetracloreto de carbono </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Etilenodiamina Boc protegidos </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> De sódio 2-mercaptoethanesulfonate </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> 4N HCl solução em dioxano </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Lisina-N, N-diacetic ácido </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Et 3 N </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Niso 4 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> PAN </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> imidazol </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Sigma </td></tr></tbody></table>

soft lithographic functionalization and patterning oxide-free silicon and germanium

O desenvolvimento de dispositivos eletrônicos híbridos depende em grande parte, sobre a integração de (bio) materiais orgânicos e inorgânicos semicondutores através de uma interface estável que permita o transporte de elétrons eficiente e protege os substratos subjacentes da degradação oxidativa. Semicondutores do grupo IV podem ser eficazmente protegidos com altamente ordenado monocamadas auto-organizadas (SAMs) composta de simples cadeias alquila que agem como barreiras impermeáveis ​​às soluções orgânicas e aquosas. Simples SAMs alquila, entretanto, são inertes e não passíveis de padronização de técnicas tradicionais. A motivação para a imobilização orgânica sistemas moleculares em semicondutores é dar uma nova funcionalidade para a superfície que pode fornecer função ótica, eletrônica e mecânica, bem como atividade química e biológica. Impressão microcontact (CP μ) é uma técnica de litografia suave para SAMs padronização em superfícies miríade. 1-9 Apesar de sua simplicity e versatilidade, a abordagem tem sido amplamente limitado a superfícies de metal nobre e não foi bem desenvolvida para a transferência de padrão para substratos tecnologicamente importantes, tais como óxido de livre de silício e germânio. Além disso, porque esta técnica baseia-se na difusão de tinta para transferência de padrões a partir do elastômero ao substrato, a resolução de impressão tradicionais, é essencialmente limitada a cerca de 1 m. μ 16/10 Em contraste com a impressão tradicional, padronização CP inkless μ depende de uma reação específica entre uma superfície-imobilizada substrato e um catalisador de selo-bound. Porque a técnica não depende de formação de SAM difusivo, que amplia significativamente a diversidade de superfícies patternable. Além disso, a técnica inkless elimina a limitações de recursos impostas pelo tamanho da difusão molecular, facilitando a replicação de recursos muito pequenos (&lt;200 nm). 17-23 No entanto, até agora μ, inkless CP tem sido usado principalmente para a padronização relativamente desordenada sistemas moleculares, que não protegem superfícies subjacentes da degradação. Aqui, nós relatamos um método simples, de alto rendimento confiável para padronização passivado silício e germânio com monocamadas orgânicas reativas e demonstrar funcionalização seletiva dos substratos padronizados com as duas pequenas moléculas e proteínas. A técnica utiliza um sistema de pré-formados NHS-reativa bicamadas em óxido de silício e germânio livre. A fracção NHS é hidrolisado de uma forma padrão específico com um selo de acrilato de ácido sulfônico modificada para produzir padrões quimicamente distintos de NHS-ativado e ácidos carboxílicos. Uma limitação importante para a resolução de técnicas CP muitos μ é o uso de material PDMS que não tem a rigidez mecânica necessária para a transferência de alta fidelidade. Para aliviar essa limitação que utilizou um polímero de acrilato de poliuretano, um material relativamente rígido que pode serfacilmente funcionalizados com diferentes metades orgânicos. Nossa abordagem completamente padronização protege tanto o silício eo germânio de oxidação química, oferece um controle preciso sobre a forma eo tamanho das características padronizadas, e dá fácil acesso a padrões quimicamente discriminado que pode ser ainda mais funcionalizados com moléculas orgânicas e biológicas. A abordagem é geral e aplicável a outras superfícies tecnologicamente relevantes.

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Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Aqui nós descrevemos um método simples para padronização funcionalização silício e germânio com monocamadas orgânicas reativas e demonstrar-óxido livre dos substratos padrão com pequenas moléculas e proteínas. A abordagem completamente protege as superfícies da oxidação química, oferece um controle preciso sobre a morfologia característica, e fornece fácil acesso a padrões quimicamente discriminados.

Funcionalização litografia macia e livre de óxido Patterning silício e germânio

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K visualizações.  Duke University. Aqui nós descrevemos um método simples para padronização funcionalização silício e germânio com monocamadas orgânicas reativas e demonstrar-óxido livre dos substratos padrão com pequenas moléculas e proteínas. A abordagem completamente protege as superfícies da oxidação química, oferece um controle preciso sobre a morfologia característica, e fornece fácil acesso a padrões quimicamente discriminados.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Bioengenharia

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Um método versátil de padronização proteínas e células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

Procedimento litográfico macio para a produção de dispositivos microfluídicos plástico com vista-portas transparentes à luz visível e infravermelho

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Projetar filmes de silício poroso como portadores do fator de crescimento do nervo

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics paradigm, especially in biomedical research. Recreating artificial life-like actuation dynamics is crucial for a soft-robotic system. However, the precise control and tuning of actuation behavior still represents one of the main challenges of modern soft robotic systems. This method describes a low-cost, highly scalable, and easy-to-use procedure to fabricate an electrically controllable soft robot with life-like movements that is activated and controlled by the contraction of cardiac muscle tissue on a micropatterned sting ray-like hydrogel scaffold. The use of soft photolithography methods makes it possible to successfully integrate multiple components in the soft robotic system, including micropatterned hydrogel-based scaffolds with carbon nanotubes (CNTs) embedded gelatin methacryloyl (CNT-GelMA), poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA), flexible gold (Au) microelectrodes, and cardiac muscle tissue. In particular, the hydrogels alignment and micropattern are designed to mimic the muscle and cartilage structure of the sting ray. The electrically conductive CNT-GelMA hydrogel acts as a cell scaffold that improves the maturation and contraction behavior of cardiomyocytes, while the mechanically robust PEGDA hydrogel provides structural cartilage-like support to the whole soft robot. To overcome the hard and brittle nature of metal-based microelectrodes, we designed a serpentine pattern that has high flexibility and can avoid hampering the beating dynamics of cardiomyocytes. The incorporated flexible Au microelectrodes provide electrical stimulation across the soft robot, making it easier to control the contraction behavior of cardiac tissue.

A bioinspired scaffold is fabricated by a soft photolithography technique using mechanically robust and electrically conductive hydrogels. The micropatterned hydrogels provide directional cardiomyocyte cell alignment, resulting in a tailored direction of actuation. Flexible microelectrodes are also integrated into the scaffold to bring electrical controllability for a self-actuating cardiac tissue.

Robô macio bioinspirado com microeletrodos incorporados

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These cell-silicon hybrids offer leadless optical modulation capabilities with minimal perturbation to normal cell behavior. The optical capabilities are obtained by the photothermal and photoelectric properties of SiNWs. These hybrids can be harvested using standard tissue culture techniques and then applied to different biological scenarios. We demonstrate here how these hybrids can be used to study the electrical coupling of cardiac cells and compare how myofibroblasts couple to one another or to cardiomyocytes. This process can be accomplished without special equipment beyond a fluorescent microscope with coupled laser line. Also shown is the use of a custom-built MATLAB routine that allows the quantification of calcium propagation within and between the different cells in the culture. Myofibroblasts are shown to have a slower electrical response than that of cardiomyocytes. Moreover, the myofibroblast intercellular propagation shows slightly slower, though comparable velocities to their intracellular velocities, suggesting passive propagation through gap junctions or nanotubes. This technique is highly adaptable and can be easily applied to other cellular arenas, for in vitro as well as in vivo or ex vivo investigations.

This protocol describes the use of silicon nanowires for intracellular optical bio-modulation of cell in a simple and easy to perform method. The technique is highly adaptable to diverse cell types and can be used for in vitro as well as in vivo applications.

Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Padronização simples, acessível e modular de células usando DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...