<p class="jove_content"&gt; Agradecemos DD Zhang para discussão perspicaz e generosamente fornecer reagentes. MJ é suportado pelo NIH Cardiovascular Training Grant, o Arizona Technology Fund Research Initiative, e Recompensas da realização para cientistas College. Este trabalho é suportado pelo Prêmio de Diretor do NIH Innovator Novo (1DP2OD007161-01), a National Science Foundation (0.855.890), eo James S. McDonnell Foundation.</p

1. Criação de moldes usados ​​para modelar <ol><li> Projeto conceitual de padrões. Padrões são criados que servem para formar redes de celular, entre em contato célula de controle, isolar as células, imitam estruturas naturais, ou guia de adesão celular e posicionamento. </li><li> Computer-aided design ou criação de CAD baseado em padrões e criação de fotomáscara. O padrão desejado é projetado em software CAD, como AutoCAD, e é então enviado para uma empresa de fora para produzir uma fotomáscara. </li><li> Fotolitografia para produzir modelo mestre. Lâminas de vidro são padronizados com qualquer um positivo fina resistir ou um negativo de espessura resistir dependendo do tamanho da estrutura que está sendo criado. Lâminas de vidro são usados ​​para os benefícios de ser de baixo custo, mais forte do que wafers de silício e não produzir poeira tanto quando quebrado. Alternativamente, outras estruturas convenientes, tais como redes de difração pode ser usado como o padrão de mestre. </li><li> O slide padrão está ligado a uma pilha de slides que não tenham sido estampados. Todas as etapas são realizadas dentro de uma capela de fluxo limpo para minimizar a poeira. </li><li> Criação de moldes de mestre. Um recipiente de papel alumínio um pouco maior que a pilha de slides é criada para manter a 30 g de PDMS (polidimetilsiloxano) que é então derramado sobre a superfície photolithographically padronizada para criar um molde inicial. O PDMS é desgaseificados e permitiu a cura para 1-2 dias. </li><li> Uma vez curado, o PDMS é retirado do padrão de mestre e forma um molde para a próxima etapa. </li><li> 6 g de 2 epóxi parte (Devcon # 14310 (6 g) é misturado por 1 minuto e então derramada no molde mestre, desgaseificados e permitiu a cura. Desgaseificação o epóxi deve ser feito rapidamente (&lt;8 min) usando bolha muitos quebrando ciclos e usando apenas uma fina camada antes que os conjuntos de epoxy e remoção de bolhas torna-se impossível remover as bolhas. O g 6 utilizado produz uma fina camada que facilita a remoção de bolhas rápido. </li><li> Após uma hora, o epóxi parte 2 será parcialmente curado e mais epóxi podem ser adicionados no topo sem desgaseificação para produzir uma estrutura que é mais grosso easer para lidar em etapas posteriores. O epoxy é, então, autorizado a cura para 1-2 dias. </li><li> Uma vez curado, o epóxi é removido do molde mestre PDMS e fita é enrolada em torno do molde de epóxi para formar um recipiente. Um molde de trabalho é então criada por vazamento PDMS no molde de epóxi, desgaseificação do PDMS, e cura de 1-2 dias. </li><li> Uma vez curado, o molde de trabalho é arrancado do epoxy e armazenados para manter a limpeza. </li></ol> 2. Padronização de superfícies com moldes para a orientação das células <ol><li> Pequenas seções do molde de trabalho são cortadas e colocadas em uma placa de Petri de poliestireno. As localizações dessas seções do molde são rotulados. </li><li> Um tripé é formado a partir das seções pequenas e ponderado para garantir o contato entre o molde conformal de trabalho e a superfície da placa de Petri. Boa colocação pode ser observada olhando para o fundo do prato. </li><li> O conjunto é colocado dentro da câmara de plasma. Tratamento de plasma é iniciado e continuado a 150 Pa em 29,6 W (potência máxima) por 10 minutos, com ar plasma. </li><li> Após o tratamento de plasma, o molde e acusação de peso são removidos. </li><li> Placa de Petri é colocado sob luz UV por 10 minutos de esterilização dentro da cabine de segurança biológica e armazenado lá até semeadas com células. </li></ol> 3. Semeadura superfícies com células <ol><li> Células SH-SY5Y CRL-2266 Neuroblastoma Humano ou outros são cultivadas utilizando protocolos padrão para o tipo de célula. </li><li> Confluência dos SH-SY5Y CRL-2266 células Neuroblastoma Humano é medido visualmente antes da semeadura sobre a superfície modelada. </li><li> Divisão celular normal é realizada para remover as células da superfície da sua placa de Petri. </li><li> As células, flutuando uma vez livre, são semeados sobre a superfície da placa de Petri padronizada depois de ser diluída para atingir a confluência desejada, quando colocado na superfície padronizada. </li><li> As células são autorizados a instalar e anexar à superfície. </li><li> O padrão de Petri é incubada por várias horas a vários dias enquanto as células para montar o padrão criado pelo plasma. </li><li> Quando a cultura de células do neuroblastoma, o ácido retinóico (10 mM) é adicionados diariamente a fim de induzir as células a se diferenciar em um estado neurônio-like. A adição do ácido retinóico é feito no escuro. </li><li> O ácido retinóico é adicionados diariamente por vários dias, após o que a diferenciação será observável. </li><li> Media é substituído a cada 3-4 dias. </li></ol> 4. Observação e Análise <ol><li> Imagens periódica das células vivas ou vídeos são tomadas a fim de observar o comportamento das células ao longo do tempo. Para imagens ao vivo, as células são colocadas em uma incubadora microscópio estágio superior que mantém as células a 37 ° C, umidade de 100%, e 5% CO 2. As células podem também ser fixados e corados para observação sob fluorescência </li><li&gt; As imagens ou vídeos das células que foram capturados são importados para um sistema de análise de imagem e as medições são realizadas, incluindo taxa de crescimento, tamanho da célula, a velocidade de migração, diferenciação, o alinhamento, a localização de proteínas específicas, e outros. </li></ol> 5. Resultados representativos: Um resultado típico da aplicação da técnica de litografia de plasma é a formação de um padrão de células que se assemelha a uma estrutura arbitrária ou natural. Isto é visto na Figura 1a-b onde as linhas e redes de neurônios foram criados. Outros tipos de células podem ser usadas, assim como visto na Figura 1c-d, o que mostra células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e C2C12 células do músculo esquelético formando grades. Materiais, tais como poli-l-lisina também pode ser modelado, Figura 1e para facilitar a fixação de certos tipos celulares e para outros usos. No caso dos neurônios mostrado, o que foi criado são redes de células que possuem conexões entre eles. Esta replica o que ocorre naturalmente no cérebro onde os neurônios têm ligações discretas entre células vizinhas que influencia o funcionamento do cérebro. Com a criação de uma estrutura deste tipo no laboratório, o número, posição, freqüência e outros fatores das ligações podem ser sistematicamente controlados. O resultado dessas arraignments pode ser medida visualmente e insumos adicionais, tais como produtos químicos ou estimulação elétrica pode ser implementada para investigar o comportamento da rede. Um resultado negativo seria um padrão overgrown ou incompletos uma amostra contaminada. Um padrão incompleto ou overgrown resultaria de semeadura o substrato ou com células muito poucos ou muitos que não iria fornecer o padrão com uma quantidade ideal de células. Além disso, se o padrão não foi projetada corretamente (por exemplo, linhas muito estreito) as células não será capaz de unir e crescer com sucesso nele. No caso de uma amostra contaminada, limpeza adequada não teria sido mantida durante uma das etapas que isso é raro quando na sequência de protocolo de cultura celular adequada devido ao fato de que a padronização plasma também esteriliza o substrato. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Padronização de células e proteínas.

<ol>
	<li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography.">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li><li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography.">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li><li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. 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L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth.">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li><li>Murakami, T., Kuroda, S. -. i., Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma:+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment.">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li><li>Strobel, M., Lyons, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-treated+polystyrene+surfaces:+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions.">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li><li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Sch&#246;n, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion.">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de investigação de células aqui apresentada permite a criação de padrões complexos de redes multicelulares que imitam estruturas biológicas, bem como fornece um método para produzir estímulos que são subcelulares na natureza que, em seguida, facilita as investigações de ambos o comportamento das células agrupadas e respostas única célula a fatores ambientais. O uso deste método é simples, mas robusto, pois ele pode ser rapidamente realizados com equipamentos de baixo custo no mesmo laboratório como a cultura de células. É também fortemente células sensíveis, permite fácil observação do comportamento resultante e é por natureza estável por longos períodos de tempo, o que permite investigação do comportamento das células a longo prazo. Além disso, também permite uma gama diversificada de experimentos a serem realizados, uma vez que é compatível com muitos tipos de células e pode criar padrões arbitrários. A estabilidade a longo prazo da técnica deriva do fato de que a funcionalização da superfície transmitida pelo plasma é parte da superfície e não é um revestimento ou outra camada, que podem ser removidos ou degradados. Se mantida sob líquidos, este tipo de modificação pode manter a sua capacidade de orientação para celular meses. A parte mais crítica da experiência necessárias para garantir resultados significativos é a de criar o modelo mestre que acabará por ser usado para a orientação das células. Se esse padrão não é adequadamente projetado, as células não respondem adequadamente ao padrão e não pode produzir um comportamento útil. Parâmetros como largura de linha, espaçamento padrão, e outros podem influenciar bastante a compatibilidade célula com um determinado padrão e, normalmente, uma série de parâmetros como pode ser criado no fotomáscara inicial para a tela para o projeto mais adequado. Outros parâmetros importantes relacionados com a realização de padrões incluem a criação de moldes, manutenção de um ambiente livre de poeira, a semeadura de células e esterilidade geral de cultura de células. Criação de moldes pode ser efectuada pelas etapas de transferência de vários que são realizadas para permitir repetidas PDMS elenco fora de um molde de epóxi. O molde de epóxi é criada porque ela não irá degradar da mesma forma como resistir molde com pequenas estruturas de aspecto alta relação de fundição sob repetidos. Se a moldagem de transferência é feito corretamente, as dimensões eo rendimento não será afetado, mas se for feito de forma incorreta, como por mal de desgaseificação de cura, incompletas ou aquecimento excessivo, bolhas de aspereza, e deformação de um padrão pode ocorrer que afeta o resultado final. Em relação à manutenção de um ambiente livre de poeira, os moldes devem ser mantidas o mais limpo possível, pois a poeira pode interferir com o contato adequado entre o molde PDMS de trabalho e da superfície e, portanto, adequada blindagem plasma e padronização de produtos químicos. A densidade de semeadura das células também devem ser otimizados para garantir que nem as células muito poucos ou muitos habitam a área padrão e esterilidade deve ser mantida para evitar a contaminação bacteriana e outras das células sendo usado. A técnica também pode ser incorporado com outros elementos, como a microfluídica, microeletrodos e sondas mecânicas. Isto proporciona estímulos adicionais para as células, a fim de melhor reproduzir várias condições fisiológicas durante a experimentação e os trabalhos futuros está focada em estudar os efeitos dessas combinações

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner e câmara de vácuo </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescência invertido e microscópio de contraste de fase </td><td> Nikon </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio estágio superior incubadora </td><td> AmScope </td><td> Modelo TCS-100 </td><td> Modificado para incluir um gabinete que fornece uma atmosfera apropriada </td></tr><tr><td> Prato de Petri de poliestireno </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS (polidimetilsiloxano) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Epóxi </td><td> Devcon </td><td> 2 epoxy ton clara # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura da mídia celular </td><td> Vários </td><td></td><td> Mídia segue formulações padrão para tipo de célula </td></tr><tr><td> Ácido retinóico </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography surface patterning for creation of cell networks

Manipulação sistemática de um microambiente celular com resolução de micro e nanoescala é muitas vezes necessária para decifrar vários fenômenos celulares e moleculares. Para atender a esse requisito, temos desenvolvido uma técnica de litografia plasma para manipular o microambiente celular, criando uma superfície modelada com tamanhos recurso que variam de 100 nm para milímetros. O objetivo desta técnica é ser capaz de estudar, de forma controlada, o comportamento de células individuais, bem como grupos de células e suas interações. Este método de litografia de plasma é baseado na modificação seletiva da química de superfície sobre um substrato por meio de proteger o contato de plasma de baixa temperatura com um molde físico. Esta blindagem seletiva deixa um padrão químico que pode guiá-adesão celular e movimento. Este padrão, ou modelo de superfície, pode então ser usado para criar redes de células cuja estrutura pode imitar aquela encontrada na natureza e produz um ambiente controlável para investigações experimentais. A técnica é bem adequado para estudar fenômeno biológico, uma vez que produz padrões de superfície estável em substratos poliméricos transparentes de forma biocompatíveis. Os padrões de superfície durar de semanas a meses e pode, assim, orientar a interação com as células por longos períodos o que facilita o estudo de longo prazo processos celulares, como diferenciação e adaptação. A modificação da superfície é principalmente de natureza química e, portanto, não apresenta interferência topográfica ou física para a interpretação dos resultados. Ele também não envolve quaisquer substâncias duras ou tóxicas para a alcançar padrões e é compatível para cultura de tecidos. Além disso, ele pode ser aplicado para modificar vários tipos de substratos poliméricos, que devido à capacidade de ajustar as suas propriedades são ideais para e são amplamente utilizados em aplicações biológicas. A resolução alcançável também é benéfico, como o isolamento dos processos específicos, tais como a migração, adesão ou ligação permite discretos, observações claro no único nível multicell. Este método tem sido empregado para formar diversas redes de diferentes tipos de células para as investigações envolvendo a migração, sinalização, formação de tecido, eo comportamento e as interações de neurônios acusado em uma rede.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

A técnica de litografia versátil plasma foi desenvolvido para gerar padrões de superfície estável para orientar adesão celular. Esta técnica pode ser aplicada para criar redes de células, incluindo as que imitam tecidos naturais e tem sido usada para estudar vários tipos de células distintas.

Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K visualizações.  University of Arizona. A técnica de litografia versátil plasma foi desenvolvido para gerar padrões de superfície estável para orientar adesão celular. Esta técnica pode ser aplicada para criar redes de células, incluindo as que imitam tecidos naturais e tem sido usada para estudar vários tipos de células distintas.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Bioengenharia

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&amp;#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Um sistema microfluídico com padrões de superfície para investigar bolha de cavitação (s) Interação -cell e os Efeitos Biológicos resultante no nível de célula única

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data sets of patient or specimen anatomy in clinical or preclinical settings. However, the use of a virtual, on-screen display limits the ability of these tomographic images to fully convey the anatomical information embedded within. One solution is to interface a biomedical imaging data set with 3D printing technology to generate a physical replica. Here we detail a complementary method to visualize tomographic imaging data with a hand-held model: Sub Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. SSLE offers several unique benefits including: the facile ability to include anatomical labels, as well as a scale bar; streamlined multipart assembly of complex structures in one medium; high resolution in the X, Y, and Z planes; and semi-transparent shells for visualization of internal anatomical substructures. Here we demonstrate the process of SSLE with CT data sets derived from pre-clinical and clinical sources. This protocol will serve as a powerful and inexpensive new tool with which to visualize complex anatomical structures for scientists and students in a number of educational and research settings.

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving SSLE of Glass Crystals

A methodology is described herein for representing anatomical imaging data within crystals. We create scaled three-dimensional models of biomedical imaging data for use in Sub-Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. This tool offers a useful complement to computational display or three-dimensionally printed models used within clinical or educational settings.

Escamas Modelo Anatómico Creation of Biomedical Tomografia de imagem e de dados associadas As etiquetas para posterior sub-superfície de gravação a laser (SSLE) de cristais de vidro

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...