O CMOD Pack permite padronizar células com alta precisão e cultuas em 2d ou 3d. Isso abre oportunidades para estudar as interações célula-célula e a morfogênese dos novos tecidos do motor. A principal vantagem dessa técnica é que é fácil para outros laboratórios adotar, não requer uma sala limpa, equipamentos especializados ou reagentes sintetizados personalizados.
Comece soltando pequenas gotas da foto positiva resista ao slide de aldeído, usando uma pipeta descartável. Gire o slide a 3000 RPM por 30 segundos usando o codificador de giro e coloque-o em uma placa quente de 100 graus Celsius por 1,5 minutos para cruzar a resistência da foto. Retire o slide da placa quente e coloque uma máscara de foto com as características desejadas em cima do slide, pese-o com um pedaço de vidro e cubra toda a configuração em uma caixa opaca.
Exponha a configuração com uma lâmpada UV por dois minutos, desenvolva o slide imergindo-o na solução do desenvolvedor por três a cinco minutos e, em seguida, enxágue a solução do desenvolvedor em excesso com água, seque-a sob um fluxo de ar ou nitrogênio. Observe esta luz sob um microscópio para confirmar o sucesso da foto litografia e armazená-la no escuro. Adicione uma gotícula de 20 micromolar amina modificada solução oligos em cada região padronizada da foto do slide e espalhe a gota suavemente por toda a região, usando uma ponta de pipeta, tomando cuidado, para não arranhar o slide, assar o slide em um forno Celsius de 65 graus até que a solução de DNA tenha secado totalmente, realizar a aminação redutiva colocando o slide assado e um prato de cultura de células de 15 centímetros em um prato de cultura de fumaça em cima de um agitador.
Misture suavemente 100 miligramas de hidreto de sódio em 40 mililitros de PBS e adicione ao prato. Em seguida, ligue o agitador por 15 minutos. Após a reação, lave este slide duas vezes com sulfato de dodecil de 0,1% de sódio para remover o DNA não redigido.
Em seguida, lave o slide três vezes com água. Dirija este slide sob o fluxo de nitrogênio ou ar. Por fim, enxágüe-o com acetona para remover a resista restante da foto.
Prepare uma solução de âncora e adaptador universal de quatro micromolars, conforme descrito no manuscrito do texto e prepare uma solução de co-âncora universal de 20 micromolars na PBS. Prepare a suspensão celular reutilizando a pelota celular em um mililitro de PBS gelado ou mídia livre de soro e transfira de uma a 3 milhões de células para uma centrífuga de tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro. Centrifugar a 160 vezes G por quatro minutos.
Resuspenja a pelota celular obtida em 75 microliters de PBS gelado ou mídia livre de soro e adicione 75 microliters do preparado para a solução de âncora e adaptador universal micromolar. Misture bem e incubar por cinco minutos no gelo, adicione 15 microliters da solução universal co-âncora ao tubo e misture bem, depois incubar a amostra por cinco minutos no gelo. Para remover oligos em excesso da suspensão celular, adicione um mililitro de PBS gelado ou mídia livre de soro ao tubo e misture com uma pipeta.
Pelotar as células por centrifugação a 160 vezes G por quatro minutos a quatro graus Celsius, em seguida, descartar o supernatante. Repita este passo mais duas vezes. Resuspende as células em gelo col PBS ou mídia livre de soro para criar uma solução densa celular de pelo menos 25 milhões de células por mililitro, inclinar ligeiramente o slide padrão, em seguida, adicionar 25 microliters desta suspensão celular à entrada de cada célula de fluxo.
Remova a solução PBS e 1%BSA da tomada, permitindo que a suspensão da célula encha a célula de fluxo PDMs. Incubar no gelo ou à temperatura ambiente por 30 segundos, aspirar cinco microlitres da suspensão celular a partir da saída do slide e adicioná-lo de volta na entrada. Repita isso 10 vezes por célula de fluxo.
Delicadamente pipeta PBS ou mídia livre de soro na entrada de cada célula de fluxo para lavar as células em excesso e coletar a suspensão celular da tomada. Repita isso duas a quatro vezes até que não haja excesso de células no slide. Para a cultura 3d, prepare uma solução precursora de gel hidráulico contendo 2%DNAs e adicione 50 microliters dele à entrada de cada célula de fluxo.
Aspire o excesso de fluido da tomada, levando a solução de hidrogel para a célula de fluxo. Incubar o slide a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos para permitir que os hidrogéis ajustem e apertem a adesão baseada em DNA entre as células e a superfície. Adicione 50 microliters de hidro gel precursor a um poço de dois poços de deslizamento de câmara ou uma placa de seis poços.
Pipeta 10 microliters de PBS em cada lado de cada célula de fluxo. Distribua-o ao longo de toda a extensão da célula de fluxo usando um razorblade ou encontre pinças de ponto e levante suavemente os lados das células de fluxo para que o PBS corra sob o gel hidráulico. Usando um razorblade, mova a célula de fluxo para a borda do slide invertendo o slide e empurrando a célula de fluxo para fora do slide para que ela caia em cima do lâmina de barbear.
Pegue a célula de fluxo da lâmina usando fórceps curvas. Inverta as células de fluxo para que as células estejam na parte inferior e coloque-as em cima da gota da solução precursora do gel hidráulico. Incubar por pelo menos 30 minutos para que o hidrogel contendo as células padrão possa se ligar à subposição de hidrogel, resultando na incorporação completa das células padrão.
Remova a célula de fluxo e mergulhe-a completamente na mídia. Empurre suavemente a célula de fluxo usando fórceps curvas até que ela apareça e flutue para a mídia, em seguida, descarte-a. A quantificação da adesão da mancha de DNA às células rotuladas pelo CMO, que aumenta.
em função da concentração de CMO é representado como o desvio médio e padrão de três experimentos. Os padrões de DNA são mostrados em magenta e as células rotuladas de CMO em ciano em diferentes concentrações de CMO. Uma comparação de huvecs rotulados cmo e huvecs rotulados LMO aderidos a um padrão de DNA linear é mostrado aqui.
Um único padrão MDCKs VSC MOD pack, e transferido para o gel maitre foram capazes de proliferar e polarizar após cinco dias de cultura. Agregados multicelulares multicamadas foram criados por camadas alternadas de células rotuladas com CMOs complementares. Várias populações celulares únicas podem ser padronizadas juntamente com alta precisão e sem contaminação cruzada.
Ao tentar este protocolo, é fundamental ter uma suspensão celular densa enquanto adiciona as células ao slide, a fim de maximizar as oportunidades para as células se ater a pontos de DNA.
