Agradecemos ao Dr. Yuriy M. Usachev por sua ajuda na padronização inicial de microscopia confocal / imagem de imunocoloração do mouse plantar biópsia com punch, e Dr. Donna L. Hammond por sua ajuda contínua e críticas construtivas a este trabalho. Este trabalho foi financiado por concessões do NINDS / NIH (NS069898), e um Idea Award Grant Desenvolvimento do Departamento de Defesa Programa de Pesquisa em Câncer de Próstata (DoD-PCRP-101096) ao DPM

1. Perfusão animais Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo são aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade de Iowa, e seguir as orientações do NIH para o uso de animais em pesquisa. <ol><li> No dia antes da perfusão, preparar 1 L de tampão fosfato (0,2 M PB em dobro destilada H 2 O, pH 7,4), e armazenar a 4 ° C. Isso será usado para os processos de perfusão e pós-fixação. </li><li> No dia da perfusão, preparar 500 ml de paraformaldeído 4,0% em 0,1 M PB (PFA, pH 7,4) solução fixadora, um volume suficiente para a perfusão de 2 ratos: microondas de 200 ml de DDH 2 O em um copo de vidro por 30 segundos ou até que se aproxima de ebulição. Adicionar 20 g de paraformaldeído granular (PFA) para o copo com agitação constante sob uma coifa. Adicionar 5 ml de 5 N NaOH gota a gota, e mexa até que a solução limpa. Quando a PFA é completamente dissolvido, esfriar a solução à temperatura ambiente (RT). Slowly adicionar 250 ml de 0,2 M PB agitando continuamente. Usando soluções progressivamente mais fraco HCl (6 a 1 N N para 0,1 N), ajustar o pH para 7,4. Ajustar o volume final de 500 ml e chill no gelo. Também preparar 400 ml de 0,1 M PB de 0,2 M de ações, diluindo 1:1 em DDH 2 O e frio no gelo. </li><li> Anestesiar o rato por injeção intraperitonial de uma overdose de anestésico (pentobarbital sódico, 80 mg / kg, administrado com uma agulha de 27G). </li><li> Durante a perfusão, 50 ml de 0,1 M PB (diluir 0,2 M PB estoque 1:1 com DDH 2 O) e 150 ml de PFA serão passados ​​seqüencialmente para a circulação mouse. Configurar a bomba peristáltica preenchendo o tubo com PB e fixação de um 23 1 / 2 agulha borboleta G em uma extremidade. Mergulhe a outra extremidade do tubo no copo contendo 0,1 M PB. Definir a velocidade da bomba peristáltica a 10 ml / min, e uma bomba através de uma quantidade suficiente de solução para garantir que não há bolhas de ar na tubulação. </li><li> Aguarde até que a umanesthetized do mouse já não mostra qualquer atividade reflexa, como tep / tail pinch e reflexo de pestanejo. Coloque o animal em uma bandeja de dissecação lado ventral para cima dentro de um extractor de fumo e segura as patas com fita adesiva. Pulverizar a pele com álcool 70%. Faça uma incisão através da pele ao longo da linha média para expor a caixa torácica e do bairro mais alto da parede abdominal. Em seguida, corte através da parede abdominal na base da caixa torácica. Depois de fazer essa incisão, o diafragma e extremidade inferior do esterno deve ser visível. Cuidadosamente cortada da esquerda para a direita através da margem do diafragma, e ao longo do comprimento total do esterno, tendo cuidado para não danificar os pulmões. Alguns pequenos sangramentos do esterno nesta fase é normal e não vai comprometer a perfusão. Uma vez que a incisão ao longo do esterno tem sido feito eo corte do diafragma, que deve ser possível para levantar cada metade da caixa torácica para cima e para fora, de modo que o coração está exposto. Afastar os pulmões, se necessário. Ambas as metades da caixa torácica podeser mantido nessa posição com o uso de grampos hemostáticos. Inserir a agulha borboleta (23 1 / 2 G) anexado ao milímetro bomba peristáltica 3-4 para o ventrículo esquerdo, paralela ao longo eixo do animal. Este posicionamento minimiza o risco de a agulha ficar deslocada. Faça uma pequena incisão no átrio direito para permitir a circulação de retorno a fluir para fora do coração. </li><li> Começar a perfusão com 0,1 M PB, 10 ml / min para min 4-5. Se ainda há uma quantidade significativa de sangue que emana do átrio direito, neste ponto, continue até que o fluxo é clara. </li><li> Interromper o fluxo de PB e mudar a entrada na bomba peristáltica para a solução PFA 4%. Reduzir a taxa de fluxo de 5 ml / min e retomar a PFA bombeamento solução por 20-25 min. Como o PFA entra na circulação, os músculos entram em espasmo e, após alguns minutos, o animal deve ser literalmente &quot;fixo&quot; na posição. Esta rigidez pode ser testado por gentilmente empurrando contra a patas traseiras, tomando cuidado para não mover o animal umand desalojar a cânula. Boa perfusão impedirá o membro de flexão em resposta. Uma vez que a perfusão com PFA está completa, a cânula e grampos hemostáticos pode ser desconectado e o cadáver preparado para dissecção do tecido. A abordagem dissecção usado depende do tecido específico. </li><li> Prepare 4% PFA / 5% (v / v) de ácido pícrico (PA; para a cobrança e pós-fixação de socos plantar somente) pela adição de solução saturada de ácido pícrico a PFA 4%. Inclusão de PA melhora significativamente a detecção de antígeno em tecidos periféricos neuronal 1 </li><li> Prepare osso / cartilagem solução tecido descalcificação / crioprotetor - EDTA 10% em 0,1 M PB com glicerol 0,07% e sacarose 15%. EDTA soluções baseadas descalcificar tecido preservando epítopos 2. </li><li> Prepare a solução crioprotetor - 30% de sacarose em 0,1 M PB. </li></ol> 2. Dissecção do tecido / Remoção, Pós-fixação e secção <ol><li> Soco Plantar Coloque a perfusãolado sed animais ventral para baixo sobre um tapete de corte ou superfície resistente outros. Segurando a plantar pé de superfície-up, pressione firmemente com a biópsia com punch ferramenta (3 mm de diâmetro; Harris micro-punch, Ted Pella, Inc.) para o meio do pé. Desativar a ferramenta biópsia frente e para trás através de 180 graus para confirmar a ferramenta biópsia cortou a totalidade da pata posterior. Remover suavemente a ferramenta de biópsia de pé e retirar o tecido em tubo estéril 2 ml com tampa, contendo 1 ml de 4% PFA / 5% de solução PA. </li><li> Ossos do membro (ex. fêmur) Faça uma incisão lateral ao longo do dorso do animal ao nível da pelve, continuando para baixo ao longo dos dois membros posteriores. Corte na pelve e músculo ao redor para separar o fêmur da pélvis, deixando a cabeça do fêmur proximal intacta. Corte em tíbia / fíbula para deixar a cabeça intacta distal, a remoção do músculo ao redor / periósteo do eixo ósseo. Coloque o fêmur em um tubo de 2 ml contendo 1 ml de 4% PFA /5% solução PA. </li><li> Pós-fix as amostras de tecido em 4% PFA / 5% da solução de PA, com a mistura suave de um roqueiro para 16-18 h, a 4 ° C </li><li> Descalcificar o tecido da seguinte forma: Para plantar soco lugar (a descalcificação dos ossos pequenos do pé) o soco em um tubo de tecido ml estéril com tampa 2, contendo 1,5 ml da solução de EDTA 10% em 0,1 M PB com glicerol 0,07% e 15 % de sacarose. Colocar o tubo em um roqueiro com mistura leve de 16-18 horas a 4 ° C. Para ossos dos membros coloque o tecido em um tubo estéril 2 ml com tampa, contendo 1,5 ml da solução de EDTA 10% em 0,1 M PB com glicerol 0,07% e 15% de sacarose. Colocar o tubo em um roqueiro com mistura leve de 6-7 dias a 4 ° C. A solução descalcificação deve ser trocado a cada 24 horas eo tecido monitorado para a perda de rigidez com um par de fórceps. </li><li> Transferir o tecido em um tubo estéril 2 ml com tampa com 1,5 ml de solução de crioprotetor (30% de sacarose em 0,1 M PB), e colocar o tubo em um w rockerom mistura leve de 16-18 horas a 4 ° C. </li><li> Prepare tecido para corte: volume lugar uma cama de temperatura de corte ideal (OCT) composto (Sakura Finetek EUA Inc.) em um bloco de tecido criostato de montagem e permitir a congelar na câmara de criostato (tipicamente mantida a -20 ° C). Um aerossol criogênico (Cyto-freeze, Control Co. EUA) também pode ser pulverizado sobre o OCT para acelerar o processo de congelamento. Amostra de tecido lugar nesta cama de outubro e cubra com uma camada adicional fina de outubro Suavemente com spray de outubro deste aerosol criogênicos até que tenha endurecido e os tecidos dentro congelou. Espécime lugar para a cabeça de corte na câmara de criostato e permitir que o bloco de amostra de tecido para equilibrar a temperatura de corte - pelo menos 1 hora. Tentando seção quando o composto é a incorporação de resultados ainda muito frio em seções frágil e dano tecidual. </li><li> Uma vez que o tecido tenha alcançado a temperatura de corte ideal, começar a cortar a amostra e gerar 40 seções mM. </li><li&gt; Para soco plantar recolher o criosecções em 12-lamelas de cultura de tecidos contendo 0,1 M PB com 10 mM de azida de sódio. Certifique-se que as seções permanecem submersos nessa solução a 4 ° C. Seções podem ser armazenados desta forma por até 4-6 meses para fins de imunocoloração. Alternativamente, de livre flutuação seções podem ser armazenados indefinidamente em solução crioprotetora a -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g de sacarose, 10 g PVP40, 300 ml de etilenoglicol). Ajustar o volume final de 1L com água destilada) 3. Para recolher os ossos dos membros criosecções diretamente sobre a gelatina pré-revestidas slides (ou Superfrost Slides Plus, Fisher Scientific) e deixar secar durante 1 h, antes de armazenar a -20 ° C. Seções osso em slides armazenados dessa forma podem ser utilizados para fins imunocoloração dentro de 2-3 meses. </li></ol> 3. Imunocoloração das secções de tecido de fibras nervosas sensoriais 3.1. Plantar socoseções - coloração seção flutuante <ol><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar 6-7 mm a partir do final de uma micropipeta uma dica ml. Pré-condição dentro da ponta de aspiração de 1% de soro fetal bovino (FBS) em 0,1 vezes M várias PB (isto inibe a degola das seções de tecido para as paredes da ponta). Transferência de seções soco plantar a ser manchado para uma placa de cultura de 24 poços de tecido. Normalmente 80-10 seções devem ser coradas por poço para garantir várias seções de alta qualidade são gerados por imunocoloração. </li><li> Lavar seções soco plantar com 500 mL de 0,1 M por poço PB por 5 min com vigorosa mistura em um balancim no RT. Repita mais 2 vezes. </li><li> Descartar a solução de lavagem e incubar as seções soco plantar em solução de bloqueio, consistindo de soro de cabra 10% e 0,3% Triton X-100 em 0,1 M PB (500 mL de solução de bloqueio por poço), com a mistura suave de um roqueiro por 1 h a 4 ° C. </li><li> Descartar a solução de bloqueio e incubar os cortes de tecidos em Antibo principaldy / anticorpos diluídos em 250 mL de solução de bloqueio para 18-24 h, com a mistura suave de um roqueiro, a 4 ° C. Com base nos requisitos experimental investigador, imunomarcação única (com um anticorpo primário contra uma proteína específica ou marcador de fibras nervosas), ou imunomarcação duplo (com dois anticorpos primários contra duas proteínas ou marcadores de fibras nervosas) pode ser realizada na mesma seção. Durante a realização imunomarcação dupla é importante para verificar que os dois anticorpos primários utilizados são criados em diferentes espécies hospedeiras (por exemplo, um mouse e cresceu em uma levantada no coelho) ou, alternativamente, purificada de anticorpos monoclonais diferentes imunoglobulina G (IgG) isotipos (por exemplo, uma IgG1 e IgG2a um) pode ser usado. É aconselhável selar a placa com Parafilm para incubações durante a noite para evitar a evaporação excessiva. , A fim de manchar o periférico as fibras nervosas sensoriais, vários anticorpos específicos podem ser usados. Anticorpos contra a proteína neurofilamento 200 (NF200, Sigma) label large diâmetro de fibras, enquanto que a calcitonina peptídeo relacionado ao gene (CGRP; Sigma) e receptor transiente peptidérgicas potencial vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) rótulo, de pequeno diâmetro fibras sensoriais periféricas. Todas as fibras do nervo periférico também podem ser marcadas com anticorpos contra β3-tubulina. Na pele, o colágeno IV (Abcam) é usado para delinear a membrana basal que separa a epiderme da derme. Como regra geral, os anticorpos precisam ser 5-10 vezes mais concentrado do que para a cultura de células baseado em imunofluorescência, normalmente a uma concentração de trabalho de 50-10 mcg / ml. </li><li> Lavar as secções de tecido com 500 ml de solução de bloqueio (com Triton X-100) por poço por 5 min com mistura vigorosa em um balancim no RT. Repita 3 vezes mais. </li><li> Descartar a solução de lavagem e cortes de tecidos em incubar apropriado fluoróforo conjugado com anticorpos secundários (normalmente diluído 1:1000 em solução de bloqueio, a 500 mL) com a mistura suave de um roqueiro, a 4 ° C. A placa de must ser embrulhados em papel alumínio para evitar a fotodegradação dos fluoróforos. </li><li> Lavar as secções de tecido com 500 ml de solução de bloqueio por poço por 10 min com mistura vigorosa em um balancim no RT. Em seguida, lave com 500 mL de 0,1 M PB com vigorosa mistura por 10 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, lave com 500 mL de 0,05 M PB com vigorosa mistura por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Usando uma micropipeta de 1 ml com uma ponta FBS-tratados (corte 6-7 mm a partir do final), aspirar as seções da placa de cultura de tecidos e transferência para SuperFrost Além de lâminas de microscópio. Organizar as seções e absorver tampão de lavagem em excesso com um pincel fino. Evite a exposição prolongada à luz. Incubar as lâminas em temperatura ambiente, de modo a permitir seções para secar seções em slide (50-30 min). </li><li> Aplique várias gotas de meio de montagem (ProLongGold, Vectashield ou similar), lentamente lugar uma lamela de vidro sobre seções. Permitir que os slides para sentar-se na escuridão por 5 min, e depois selar as bordas da lamínula com unhas transparentepolonês. Permitir que o ar de secagem para 15-20 minutos. Os slides podem ser visualizados ou armazenados a -20 ° C durante vários anos sem qualquer perda significativa de fluorescência. </li></ol> 3.2. Seções do osso do membro - Coloração em slide- <ol><li> Permitir que os slides para retornar à RT de armazenamento de -20 ° C. Usando uma caneta barreira hidrofóbica (Pen Líquido Super Pap bloqueio, Ted Pella Inc.) circunscrever a região no slide contendo as seções do osso de ser marcadas com uma generosa camada de solução. Deixar secar ao ar por 10-15 min. </li><li> Lavar as seções do osso com 250 mL de 0,1 M PB por slide por 5 min e repita para mais 2 vezes. </li><li> Descartar a solução de lavagem e incubar as seções ósseas em solução de bloqueio, consistindo de soro de cabra 10% e 0,3% Triton X-100 em 0,1 M PB (250 mL de solução de bloqueio por lâmina) por 1 hora a 4 ° C. </li><li> Descartar a solução de bloqueio e incubar as seções óssea em anticorpo primário (ou combinação de anticorpos primários, no caso dede dupla imunomarcação mencionadas no 3.1.4) diluída em 250 mL de solução de bloqueio para 18-24 h, a 4 ° C. É muito importante notar que os slides devem ser colocados em câmara úmida com uma tampa selada, para evitar a secagem da solução de anticorpo primário. , A fim de manchar o periférico as fibras nervosas sensoriais, os supramencionados conjunto de anticorpos (ver secção 3.1.4) pode ser usado com as mesmas concentrações de trabalho. </li><li> Lavar as secções de tecido com 250 ml de solução de bloqueio (com Triton X-100) por lâmina por 15 min à temperatura ambiente e repetir 3 vezes mais. </li><li> Descartar a solução de lavagem e incubar óssea em seções apropriadas fluoróforo conjugado com anticorpos secundários (normalmente diluído 1:1000 em solução de bloqueio, 250 mL) a 4 ° C. A câmara de coloração devem ser embrulhados em papel alumínio para evitar a fotodegradação dos fluoróforos. Por conveniência, é aconselhável a utilização de câmaras de cor escura coloração (por exemplo, caixa de incubação Deslize bandeja /, Corp RPI). </li><li> Wash as seções do osso com 250 mL de solução de bloqueio por slide durante 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, lave com 500 mL de 0,1 M PB por 15 min a RT. Finalmente, lave com 500 mL de 0,05 M PB por 15 minutos em temperatura ambiente. Dip brevemente em DDH 2 O para enxaguar slides e, em seguida incubar a RT, a fim de permitir que as seções do osso para o ar (50-30 min) seca. Evite a exposição prolongada à luz. </li><li> Aplique várias gotas de meio de montagem (ProLongGold ou similar) e lentamente lugar uma lamela de vidro em seções. Deixe os slides estão em trevas por 5 min, e depois selar as bordas da lamínula com unhas polonês transparente. Permitir a secagem por 15-20 min. Slides podem ser armazenadas a -20 ° C durante vários anos sem perda de fluorescência. </li></ol> 4. Resultados representante 4.1. Plantar seções soco Secções de tecido plantar soco podem ser visualizados em microscópio de epifluorescência, ou sob um microscópio confocal com um objetivo, 10X 40X 63X ou. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig1.jpg" /> Figura 1. Mostram AD coloração com Colágeno IV anticorpos (verde) na membrana basal, na junção dermo-epidérmica e na cartilagem e músculo. Numerosas fibras CGRP (AB, vermelho) e NF200-positivos (CD, vermelho) são distribuídos por toda a pele do rato na região plantar (setas). β3-tubulina é um marcador pan-neuronal (E, vermelha), ao passo que a coloração TRPV1 (F; vermelho) limita-se principalmente ao pequeno diâmetro das fibras que também são CGRP-positivo (verde, pontas de seta). A e C são imagens de epifluorescência, tirada com uma objetiva de 10X (barra de escala -500 mm); B, D, E e F são compostos de imagem confocal gerados a partir de uma imagem 11-z-stack tomadas em incrementos de 2 mM sob um objetivo 60X (escala bar - 50 mm). 4.2. Osso seções membro Seções membro tecido ósseo também pode ser visualizado sob microscópio de epifluorescência, ou sob uma Microscop confocale com um objetivo, 10X 40X 63X ou. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig2.jpg" /> . A Figura 2 mostra imunocoloração com anti-CGRP (AB, vermelho; setas), anti-NF200 (CD, vermelho, setas), anti-β3-tubulina (E; vermelho) e anti-TRPV1 (F; vermelho) co-manchadas com anticorpos anti-CGRP (verde, setas). Estas imagens mostram subtipos de fibras nervosas sensoriais distribuídos por toda a matriz óssea na região da cabeça do fêmur esponjoso mouse. A e C são imagens de epifluorescência, tirada com uma objetiva de 10X (barra de escala -500 mm); B, D, E e F são compostos de imagem confocal gerados a partir de uma imagem 11-z-stack tomadas em incrementos de 2 mM sob um objetivo 60X (escala bar - 50 mm).

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Não há conflitos de interesses declarados.

Aqui temos detalhados os métodos para a preparação da pele do rato e seções de tecido ósseo para a imunocoloração e detecção de periféricos fibras nervosas sensoriais. As seções produzido a partir de biópsias plantar soco conter a pele glabra e cabeludo, o que significa que o protocolo pode ser usado em qualquer tipo de pele. Essas técnicas também podem ser empregadas para corar outros tipos de células nesses tecidos (por exemplo leucócitos, endotélio vascular, músculo liso entre outros). Esses méto...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> No. de catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Harris 3 milímetros Micro-Punch </td><td> Material </td><td> Ted Pella </td><td> 15094 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de perfusão </td><td> Material </td><td> VWR International </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido pícrico </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239801 </td><td></td></tr><tr><td> Outubro composto Embedding </td><td> Reagente </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cito-Freeze criogênicos aerossol </td><td>Material </td><td> Empresa de controle </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> O soro de cabra </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> Bandeja de incubação e tampa para imunocoloração (Large) </td><td> Material </td><td> RPI Corp </td><td> 248270 (bandeja) 248270-A (tampa) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge caneta barreira hidrofóbica </td><td> Material </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Camelo escovas de cabelo (# espessura 1) </td><td> Material </td><td> Ted Pella </td><td> 11859 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Long Ouro de montagem médio </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

tissue preparation and immunostaining of mouse sensory nerve fibers innervating skin and limb bones

Detecção e processamento primário de física, química e térmica por estímulos sensoriais periféricos fibras nervosas sensoriais é fundamental para a percepção sensorial em animais e humanos. Essas fibras nervosas sensoriais periféricas expressam um grande número de receptores e proteínas de canais iônicos que detectam e iniciar específicos estímulos sensoriais. Métodos estão disponíveis para caracterizar as propriedades elétricas do periférico as fibras nervosas sensoriais que inervam a pele, que também pode ser utilizado para identificar a expressão funcional de proteínas canal específico de íons nessas fibras. No entanto, similar métodos eletrofisiológicos não estão disponíveis (e também são difíceis de desenvolver) para a detecção da expressão funcional de receptores e proteínas de canais iônicos na periferia fibras nervosas sensoriais que inervam outros órgãos viscerais, incluindo os tecidos mais difíceis como o osso. Além disso, tais métodos eletrofisiológicos não pode ser utilizado para determinar a expressão de proteínas não-excitáveiss em fibras nervosas sensoriais periféricas. Portanto, imunocoloração de amostras de tecido periférico / visceral para Fivers nervosas sensoriais fornece a melhor maneira possível para determinar a expressão de proteínas específicas de interesse nestas fibras nervosas. Até agora, a maioria dos estudos de proteínas expressão em neurônios sensoriais têm utilizado imunocoloração procedimentos em gânglios sensoriais, onde a informação é limitada à expressão de proteínas específicas no corpo da célula de tipos específicos ou subconjuntos de neurônios sensoriais. Aqui relatamos métodos detalhados / protocolos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral para a imunocoloração de fibras nervosas sensoriais periféricas. Nós métodos especificamente detalhe para a preparação da pele ou biópsia plantar e osso (fêmur) seções de camundongos para a imunocoloração de fibras nervosas sensoriais periféricas. Estes métodos não são apenas a chave para a determinação qualitativa de expressão de proteínas em neurônios sensoriais periféricos, mas também fornecem um método quantitativo para ensaiodeterminar alterações nos níveis de proteína expressão em tipos específicos ou subconjuntos de fibras sensoriais, bem como para determinar as mudanças morfológicas e / ou anatômica no número e densidade de fibras sensoriais durante vários estados patológicos. Além disso, estes métodos não estão confinados à coloração de apenas fibras nervosas sensoriais, mas também pode ser usado para a coloração de todos os tipos de fibras nervosas na pele, ossos e tecido visceral outros.

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Identificação imunocitoquímica de periféricos subtipos de fibras nervosas sensoriais (e detecção da expressão da proteína nele) são fundamentais para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a sensação periférica. Aqui descrevemos métodos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral, tais como ossos, pele e nos membros, para a imunocoloração específico de fibras nervosas sensoriais periféricas.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

tissue-preparation-immunostaining-mouse-sensory-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.0K visualizações.  The University of Iowa. Identificação imunocitoquímica de periféricos subtipos de fibras nervosas sensoriais (e detecção da expressão da proteína nele) são fundamentais para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a sensação periférica. Aqui descrevemos métodos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral, tais como ossos, pele e nos membros, para a imunocoloração específico de fibras nervosas sensoriais periféricas.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Neurociência

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Uma preparação semi-intactas isolada do Rato Vestibular epitélio sensorial de Eletrofisiologia e de alta resolução Microscopia de dois fótons

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of these afferent neurons are located within the sensory ganglia. Sensory ganglia innervate a specific organ or portion of the body. For instance, the dorsal root ganglia (DRG) are located in the vertebral column and extend processes throughout the body and limbs. The trigeminal ganglia are located in the skull and innervate the face, and upper airways. Vagal afferents of the nodose ganglia extend throughout the gut, heart, and lungs. The nodose neurons control a diverse array of functions such as: respiratory rate, airway irritation, and cough reflexes. Thus, to understand and manipulate their function, it is critical to identify and isolate airway specific neuronal sub-populations. In the mouse, the airways are exposed to a fluorescent tracer dye, Fast Blue, for retrograde tracing of airway-specific nodose neurons. The nodose ganglia are dissociated and fluorescence activated cell (FAC) sorting is used to collect dye positive cells. Next, high quality ribonucleic acid (RNA) is extracted from dye positive cells for next generation sequencing. Using this method airway specific neuronal gene expression is determined.

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

Preparação fisiológica das células ciliadas do sáculo da Bullfrog americano (<em&gt; Catesbeiana de Rana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...