This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Ética nacionais e institucionais apropriadas devem ser obtidas antes de realizar experimentos com animais. 1 Remoção de EDL músculos e nervos <ol><li> Pesar e profundamente anestesiar um rato adulto com isoflurano inalado utilizando um vaporizador com 5% de isofluorano mais uma taxa de fluxo de 1,5 L / min de oxigénio ou uma campânula com isofluorano algodão embebida na parte inferior. </li><li> Certifique-se de que o mouse é profundamente anestesiado e não responde a uma pitada dedo do pé. Decapitar rapidamente usando grandes, tesouras afiadas ou uma guilhotina. </li><li> Fazer um corte na linha média ventral, através das nervuras com uma tesoura e remover os órgãos internos. </li><li> Pele do animal, segurando a pele da área do pescoço e puxá-lo passado os pés. </li><li> Retirar as pernas cortando acima dos quadris e colocar os pés de pele num prato com refrigerada (4 ° C), carbogenated (95% de O2, 5% de CO 2) baixo teor de cálcio, bicarbonato de magnésio elevado contai solução salina tamponadaning em mM: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0,85 de CaCl2, 6,5 MgSO4, e 10 de glucose (pH 7,4 ± 0,05) 16. A baixa de cálcio, solução de alto magnésio inibe a transmissão sináptica durante a dissecção. </li><li> Coloque as pernas lado dorsal up no prato e prender as pernas e os quadris para baixo, usando agulhas ou pinos de insetos para que o joelho e tornozelo estão em um ângulo de 90 °. Coloque um alfinete em cada ponta dos pés e um pino em cada uma das anteriores e posteriores das coxas para segurar o tecido no lugar. </li><li> Com uma tesoura primavera Castroviejo, levante a camada superior do músculo nas coxas e fazer uma linha média cortada para expor o nervo ciático logo abaixo. O nervo ciático está localizada logo abaixo da camada muscular superior e corre acima do fêmur de sua saída perto dos quadris até que se ramifica para o fibular comum e nervo tibial pouco antes da articulação do joelho. </li><li> Remover o músculo acima do nervo ciático até ao point em que as profundas ramo do nervo fibular mergulha no músculo flexor longo do hálux (FLH) é visível. </li><li> Usando # 55 fórceps, dissecar o tecido conjuntivo ao redor do ramo fibular para libertá-la dos músculos gastrocnêmio e sóleo, que estão no lado medial da tíbia. Corte os tendões dos músculos gastrocnêmio e sóleo e removê-los cuidadosamente debaixo do nervo. </li><li> Retire o músculo superficial na face lateral da tíbia, para expor três pacotes distintos de tendão no tornozelo joint-de medial para lateral: FHL, EDL e tibial anterior (TA), com o EDL escondido debaixo da TA. </li><li> Cortar o tendão TA na articulação do tornozelo, levante o TA-se e longe da EDL, e cortar o músculo perto do joelho para removê-lo. </li><li> Cortar o tendão FHL no tornozelo e levantá-lo de volta para chegar à área onde o nervo entra no FHL. Corte logo abaixo desse ponto e remover ~ 2/3 do músculo FHL. </li><li> Corte o nervo ciático o mais próximo da articulação do quadril como possável e tira suavemente todos os ramos do nervo, exceto para o ramo fibular profundo. </li><li> Corte os tendões EDL em ambos os tornozelos e joelhos usando grandes tesoura primavera. </li><li> Utilizando uma tesoura afiada, remover o EDL, o restante FHL e nervo a partir do tecido circundante através do corte através do osso da tíbia no joelho e a meio da coxa. Corte o osso da tíbia remanescente de modo que apenas o EDL, parte da FHL e nervo permanecem. </li></ol> 2 montagem do músculo EDL e nervo no banho de tecidos (Figura 1A) <ol><li> Antes do início da experiência, se preparar o banho de tecido. Constantemente perfundir o banho oxigenado com (100% de O 2) do fluido intersticial sintético (SIF), contendo (em mM) 123 de NaCl, 3,5 de KCl, 0,7 MgSO4, 1,7 de NaH 2 PO 4, 2,0 de CaCl2, 9,5 de NaC 6 H 11 O ( gluconato de sódio), glucose 5,5, 7,5 sacarose, e 10 N-2-N hydroxyethylpiperazine- &#39;-2-etácido hanesulfonic (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Uma taxa de fluxo de 15-30 ml / min, é recomendado. É mostrado um banho disponível comercialmente, de 25 ml de capacidade, com dois eléctrodos estimulantes fixos ao fundo do banho, de um posto de tecido montada e uma montagem para um controlador de força e duração (dimensões aproximadas de banho 8,5 centímetros x 3 cm x 1 cm, para especificações consulte a Tabela de Materiais / Equipamentos). </li><li> Use o tecido FHL restante para lidar com o isolado músculo-nervo e colocá-lo no banho de tecido. Coloque um pequeno pedaço de Sylgard na parte inferior do prato e utilizar um pino de insectos através do tecido FHL restante para estabilizar o músculo. </li><li> Use 6-0 seda para amarrar os dois tendões e apor um final para o cargo de tecidos e outra para o braço de alavanca da força e controlador de comprimento (ver Tabela de Materiais / Equipamentos para especificações). Usar a menor comprimento de sutura que é prático. Retire o pino de insetos e Sylgard depois de ter amarrado os tendões. NOTA: Para facilitar a fácilligação ao braço de alavanca um pequeno pedaço de fio podem ser dobradas em forma de &quot;J&quot; e em forma de gancho fixado ao braço da alavanca com epóxi. A sutura pode ser amarrado ao fio em vez de rosca no pequeno orifício no braço de alavanca. </li><li> Faça eletrodos de sucção de SA 16 vidro usando primeiro um puxador de micropipeta de vidro (Heat = 286, Pull = 0, velocidade = 150, Time = 200); quebrar a ponta para trás e moê-lo manualmente sobre uma pedra de afiar, até há cerca de um cone de 3 mm. Derreta a ponta usando um microforge eo diâmetro interno do bico desejado de entre 10 - 100 mM, dependendo da área do nervo que se deseja amostrar (ver Figuras 1B-1C para eletrodo de esquemático e Tabela de Materiais / Equipamentos para informações sobre o produto). </li><li> Encha um eletrodo de sucção de vidro premade para o fio de prata interior com SIF. </li><li> Sucção do corte final do nervo para o eletrodo e conectar à porta positivo de um amplificador diferencial. Enrole o eletrodo com uma prata cloradafio que conecta a porta negativo do andar de entrada. Aterrar o banho SIF executando um segundo fio de prata clorada do banho de porta chão do headstage. Também aterrar o sistema de perfusão para a gaiola de Faraday em vários pontos para atenuar o ruído elétrico introduzido através das bombas de perfusão. </li><li> Estimular o músculo através dos eléctrodos montados em ambos os lados do músculo no banho de tecidos para induzir uma contracção de contração. Alternativamente colocar um eléctrodo estimulante sobre a extremidade cortada do nervo. Aumentar a tensão de estimulação, até que seja observado um pico de força contráctil e, então, aumentar a tensão por um adicional de 15% para alcançar a tensão supramáxima (0,5 mseg de largura de pulso). Continuar as contracções contração na voltagem supramáxima, com 10 seg de repouso no meio, mas pode variar o comprimento do músculo até que uma força contrátil do pico é atingido para encontrar o comprimento óptimo (L o) do músculo. Todas as rampas de comprimento e vibrações vão começar com o músculo neste Compº. </li><li> Permitir que a preparação do músculo do nervo para permanecer no banho durante pelo menos 1 hora antes da recolha de dados subsequente para permitir que o tecido para atingir a temperatura do banho e para a transmissão sináptica normal recuperar após dissecação numa solução de baixo teor de cálcio. </li><li> Para a recolha de dados a uma temperatura diferente da temperatura ambiente, colocar uma sonda de temperatura no banho de tecido perto do músculo. Lentamente trazer o banho até à temperatura de bombagem de água aquecida através da placa de base de tecido de banho. Enrole argila almofadas de aquecimento no forno em torno do reservatório SIF para ajudar a manter uma temperatura constante. </li></ol> 3 Coleta de Dados <ol><li> Para identificar um aferentes como aferentes do fuso, registrar a atividade neuronal durante as contrações de contração repetidos produzidos por um estímulo de tensão 0,5 supramaximal ms entregue uma vez a cada segundo. NOTA: aferentes do fuso muscular deve fazer uma pausa durante a 18,19 contração contração (Figura 2). </li><li> Use dasoftware de aquisição ta para aplicar as mudanças de comprimento em diferentes velocidades e em diferentes comprimentos. Use um script personalizado para automatizar esta tarefa (veja informações complementares para uma imagem do roteiro e orientações sobre como personalizar os trechos indicados). Aplicar trechos ramp-and-hold de 4 segundos em comprimentos de estiramento de 2,5%, 5% e 7,5% L o e velocidades de estiramento de 20, 40, ou 60% L o / sec 15. NOTA: Consulte o manual do usuário para a força específica e controlador de comprimento para fator de conversão necessário tensão-milímetro. </li><li> No final do experimento, determinar a saúde muscular a 24 ° C usando contrações tetânicas isométricas máximas (500 ms de trem, 120 Hz de frequência de comboios, 0,5 de largura de pulso ms, tensão supramaximal). Comparar a força de contração de pico para valores reportados anteriormente (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

O objetivo deste artigo foi descrever um método para gravar a partir de aferentes do fuso muscular em uma preparação do mouse músculo-nervo isolado. Descobrimos que aferentes do fuso rato responder de forma semelhante para esticar como aqueles a partir de ratos, gatos e seres humanos 15, e outros laboratórios têm usado ratinhos como organismos-modelo para estudar os neurónios sensoriais, tanto no músculo e a pele, in vitro (por exemplo 3,13) . Fibras aferentes sensoriais pode ser registada, pelo menos, 6-8 horas a tanto 24 ° C e 34 ° C. Para minimizar o manuseamento EDL e nervo, utilizar a parte restante do FHL para tratar o tecido sempre que possível. Após a dissecção, espere pelo menos uma hora para começar a coleta de dados para permitir que o tecido para equilibrar a temperatura do banho e para a transmissão sináptica normal, para se recuperar. Anteriormente, a saúde muscular foi verificada em um subconjunto de músculos usados ​​nesta preparação, determinando que o máximo tetânica contractile força gerada pelos músculos é similar ao relatado por outros no início e no fim da experiência 15. Aferentes do fuso de músculo foram identificados funcionalmente nesta preparação, procurando uma pausa na característica de disparo em resposta a contorcer contracção (Figura 2), bem como o aumento da frequência instantânea esperadas em resposta a alterações de comprimento (Figura 3). Em nossa experiência, a maioria dos aferentes que o fogo em condições de controle são aferentes do fuso muscular. O comprimento do nervo mantida nesta preparação (~ 7 mm, no máximo) não é suficientemente longo para utilizar as diferenças de velocidade de condução aferentes para identificar subtipos aferentes muscular 13. Além disso, ao contrário de gatos e seres humanos, as medidas de sensibilidade dinâmica não foram capazes de diferenciar claramente Grupo Ia e aferentes II em camundongos (para uma discussão mais aprofundada ver Wilkinson et al. 15). Outros subtipos de aferentes (por exemplo,. Grupo III e IV) podem ser identificados utilizando testes funcionais adicionais nesta preparação, por exemplo, por adição de substâncias, tais como a capsaicina, o ATP, ou a bradicinina, a diminuição do pH do banho, para expor o músculo isquemia, etc 3,13,21-23 Usando eletrodos de sucção permite que a atividade de múltiplos neurônios sensoriais a ser gravado de uma só vez, o que aumenta a quantidade de dados que podem ser coletados a partir de um único músculo. Esta preparação pode ser utilizada para avaliar o efeito global de uma perturbação nas respostas da população de neurónios sensoriais ou as respostas de aferentes identificados. Se as formas de pico são únicos o suficiente, até 4 neurônios sensoriais pode ser discriminado por software (ambos Spike2 (Cambridge Electronic Design) e LabChart Pro (AD Instruments) realizaram semelhante). Nos casos em que os neurônios não podem ser discriminados, mudança de posicionamento do eletrodo ou diâmetro da ponta pode ser facilmente implementado. Em resumo, o nervo-músculo do rato em vitro preparção é um método experimental simples que pode ser utilizada para investigar as propriedades de resposta de fibras aferentes sensoriais para vários modelos de perturbação, lesões e doenças físico-químicas. Além disso, esta preparação é ideal para aproveitar as poderosas ferramentas genéticas disponíveis em ratinhos transgénicos, incluindo animais e ferramentas optogenetic.

Os músculos esqueléticos são inervados por neurônios sensoriais que fornecem o sistema nervoso central, com informações importantes sobre o meio ambiente muscular. Os fusos musculares são altamente especializados estruturas encapsulados, constituído por fibras musculares intrafusais que estão localizados em paralelo com as fibras musculares extrahusales. Eixos são inervados pelo Grupo Ia e II aferentes que codificam mudanças no comprimento muscular e tom fibra intrafusal é regulada de forma dinâmica por inervação gama neurônios motores 1. Grupo aferentes Ib estão posicionadas entre as fibras musculares e suas inserções dos tendões e são sensíveis a mudanças na força muscular, por exemplo, durante a contração muscular 2. O Grupo Ia, Ib e II aferentes fornecer feedback proprioceptivo que auxilia no controle motor adequado. Populações adicionais de aferentes musculares localizados ao longo do músculo (Grupo III e IV) serve para sinalizar a acumulação do metabolito, na presença de estímulos nociceptivos, e a temperatura muscular <sup&gt; 3. Esta informação sensorial muscular é fundamental para manter a homeostase, evitando danos musculares e modulando movimento. Aferentes musculares podem alterar os seus padrões de disparo com base na experiência anterior 4. A ativação dos nociceptores pode levar à indução de estados de dor crônica 5 e sinalização aberrante dos proprioceptores musculares pode levar a problemas de equilíbrio ou movimento 6. Usamos um isolado músculo-nervo em preparação vitro para estudar a resposta do músculo terminações receptoras neurônio sensorial de camundongos adultos de ambos os sexos (mostrados são respostas 2-4 meses de idade C57BL / 6). O rato é a espécie genética modelo para estudos em mamíferos. Esta preparação requer o isolamento do ramo profundo fibular do nervo ciático e o músculo extensor digitorum longus (EDL), um musculares rápidas do grupo fibular encontrado na parte lateral da parte inferior da perna. A EDL é frequentemente usado para estudar as propriedades contráteis do músculo 7-9, tem tendons que são fáceis de isolar e é pequeno o suficiente para permitir o fornecimento de oxigénio por difusão adequada em repouso e com razoáveis ​​ciclos de contração 10. Outros músculos nesta área (por exemplo, sóleo e tibial anterior) são de tamanho semelhante e esta preparação pode ser facilmente modificado para gravar a partir de aferentes destes músculos. Um eléctrodo de sucção é colocado sobre a extremidade cortada do nervo para o músculo gravar sensorial aferente disparo. Neurônios individuais podem ser identificadas e analisadas quanto a sua forma spike spike usando software de classificação. Eléctrodos de estimulação no banho ou no nervo pode ser utilizado para evocar a contracção muscular. Comprimento do músculo e força pode ser controlada e medida usando sistemas disponíveis comercialmente. Similar preparações in vitro têm sido utilizados em roedores para estudar músculos aferentes do grupo III e IV no rato EDL 11, Grupo IA e II aferentes do fuso muscular no quarto dedo do pé lumbrical rato 12 e Grupo III e IV musculares aferentes em tele muscular rato plantar 13. Um sistema in vitro, tem as vantagens de acessibilidade farmacológico e um controlo directo de variáveis ​​de perfusão e físico-químicas, como a temperatura e pH. Uma abordagem in vitro elimina o potencial in vivo confunde de anestesia e muscular estado de perfusão. Embora a preparação do músculo-nervo permite o estudo da resposta directa de uma perturbação nos aferentes, a capacidade para estudar gama eferente modulação da sensibilidade do fuso e outras respostas integradas, que é possível com 14 in vivo ou ex vivo três preparações são sacrificados como não existem corpos celulares neuronais em esta preparação. Esta preparação foi previamente usada para caracterizar a resposta de aferentes do fuso muscular do rato a uma bateria de rampa e mantenha alongamentos e vibrações e foi determinado que respons aferentes do fuso ratoes foram semelhantes aos relatados em outras espécies, como ratos, gatos e seres humanos. Rato respostas aferentes fuso foram encontrados para ser semelhante em ambos os 24 ° C e 34 ° C temperatura do banho, embora a 34 ° C as taxas de queima absoluto foram mais rápidas e os aferentes eram mais capazes de responder mais rapidamente a alterações de comprimento 15. Descrevemos abaixo como esta preparação pode ser usado para identificar e estudar os aferentes do fuso muscular. Além disso, esta preparação pode ser facilmente modificado para estudar a resposta de outros subtipos aferentes músculo 13, para comparar as propriedades de aferentes sensoriais em resposta a um estado de doença ou de drogas ou de outras variáveis ​​variados (por exemplo, idade, sexo, knockout de genes).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muscle neurônios sensoriais que inervam os fusos musculares e os órgãos tendinosos de Golgi codificar mudanças essenciais para a propriocepção comprimento e força. Fibras aferentes adicionais monitorizar outras características do ambiente muscular, incluindo a acumulação do metabolito, a temperatura e os estímulos nociceptivos. No geral, a ativação anormal dos neurônios sensoriais pode levar a perturbações do movimento ou síndromes de dor crônica. Descreve-se o isolamento do extensor digitorum longus (EDL) do nervo do músculo e para estudo in vitro de respostas evocadas por estiramento aferentes no rato adulto. Actividade sensorial é gravado a partir do nervo com um eléctrodo de sucção e aferentes individuais podem ser analisados ​​usando software de ponto de triagem. Preparações in vitro para permitir estudos bem controlados em aferentes sensoriais, sem os potenciais confunde de anestesia ou perfusão muscular alterados. Aqui nós descrevemos um protocolo para identificar e testar a resposta de aferentes do fuso muscular para esticar. É importante ressaltar queesta preparação também suporta o estudo de outros subtipos de aferentes musculares, propriedades de resposta após a aplicação de drogas e a incorporação de abordagens genéticas potentes e modelos de doença em ratinhos.

A resposta de aferentes musculares podem ser gravados na sequência de uma variedade de perturbações, dependendo de qual o subtipo aferente está a ser estudado. Respostas representativas de aferentes do fuso muscular para a contração muscular e rampa e mantenha trecho são mostrados aqui. Para identificar um aferente como um fuso aferentes, twitch contracções são dadas uma vez em cada segundo (0,5 mseg de largura de impulso), para ver se há uma pausa na queima durante a contracção 18,19. Figura 2 mostra um traçado representativo da actividade neuronal e na tensão do músculo durante essas contrações de contração. Nenhuma atividade neuronal é observado durante as contrações de contração, como esperado para aferentes do fuso. Se o aferentes registrado foi um aferentes órgão tendinoso de Golgi Grupo Ib, um aumento na taxa de disparo durante a contração seria de se esperar. Em condições de controle mais aferentes com um padrão de disparo normal (~ 12 impulsos / seg a 24 ° C e ~ 32 impulsos / seg a 34 ° C) São aferentes do fuso muscular. Um subconjunto de aferentes do fuso será apenas fogo durante o estiramento (nas nossas mãos ~ 11% de aferentes do fuso) 15. Figura 3A mostra um traçado representativo de duas matérias-aferentes do fuso muscular de responder a uma rampa e segurar estiramento produzido pelo controlador de força e duração. A característica de pico do histograma LabChart é utilizado para identificar e analisar a frequência de disparo instantâneo dos dois neurónios individuais separadamente (figuras 3B-3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 isolado músculo Preparação A) O longus extensor longo dos dedos (EDL) e inervação do nervo ciático são montados em um banho de tecido isolado perfundido com oxigenado sintético líquido intersticial (SIF). Um amplificador extracelular ligado a uma suctiem eletrodo registra a atividade neural. A dupla força e comprimento controlador com software de controles e medidas adequadas a força muscular e comprimento. Os eletrodos de banho tecido entregar estímulos para produzir contração muscular ou contrações tetânicas. Bombeamento de água aquecida através de canais de placas banho internos controla a temperatura do banho de tecido. B) Puxado eletrodo de sucção de vidro com ~ 3 milímetros ponta afilada. C) Magnified representação da forma da ponta ideal para o eletrodo de sucção que é produzido usando uma microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Spindle Aferente Response to Twitch contração. Activit Neuronaly (traço superior) e da tensão muscular (traço inferior) de 30 contrações de contração são sobrepostos com alto traço de sobreposição em preto. Atividade aferente faz uma pausa durante o aumento da tensão induzida pela contração, que é uma resposta característica de aferentes do fuso muscular. Suporte e flecha acima do topo traço denotar o tempo durante a contração quando a atividade é interrompida. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3 Spindle Aferente Resposta a rampa e Segure Trecho A) atividade neural Raw de dois aferentes (top Trace) durante uma rampa e mantenha trecho aplicado à EDL (comprimento do músculo mostrado em traço inferior). B) freqüência de disparo instantâneo (Inst. Fr., impulsos por segundo) da unidade de actividade em L o de A exibindo (em azul). C) Instantanéfreqüência de disparo ous da unidade mais pequena que só é acionado durante o alongamento (mostrado em laranja). Ambas as unidades apresentam a adaptação de freqüência de pico durante o trecho que é característica de aferentes do fuso muscular 1.

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An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento.

Um<em&gt; In Vitro</emPreparação Muscle-nervo&gt; Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.9K visualizações.  San José State University.  Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento. 

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Neurociência

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Preparação para divulgação e gravação de programas de alimentação do motor com movimentos fisiológicos em<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Um<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In Vitro Caracterização das propriedades eletrofisiológicas das fibras aferentes do cólon em ratos

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

In Vitro Ensaio para estudar a agregação da proteína Tau e rastreio de drogas

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Methods Article

Um