Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
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This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Ética nacionais e institucionais apropriadas devem ser obtidas antes de realizar experimentos com animais. 1 Remoção de EDL músculos e nervos <ol><li> Pesar e profundamente anestesiar um rato adulto com isoflurano inalado utilizando um vaporizador com 5% de isofluorano mais uma taxa de fluxo de 1,5 L / min de oxigénio ou uma campânula com isofluorano algodão embebida na parte inferior. </li><li> Certifique-se de que o mouse é profundamente anestesiado e não responde a uma pitada dedo do pé. Decapitar rapidamente usando grandes, tesouras afiadas ou uma guilhotina. </li><li> Fazer um corte na linha média ventral, através das nervuras com uma tesoura e remover os órgãos internos. </li><li> Pele do animal, segurando a pele da área do pescoço e puxá-lo passado os pés. </li><li> Retirar as pernas cortando acima dos quadris e colocar os pés de pele num prato com refrigerada (4 ° C), carbogenated (95% de O2, 5% de CO 2) baixo teor de cálcio, bicarbonato de magnésio elevado contai solução salina tamponadaning em mM: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0,85 de CaCl2, 6,5 MgSO4, e 10 de glucose (pH 7,4 ± 0,05) 16. A baixa de cálcio, solução de alto magnésio inibe a transmissão sináptica durante a dissecção. </li><li> Coloque as pernas lado dorsal up no prato e prender as pernas e os quadris para baixo, usando agulhas ou pinos de insetos para que o joelho e tornozelo estão em um ângulo de 90 °. Coloque um alfinete em cada ponta dos pés e um pino em cada uma das anteriores e posteriores das coxas para segurar o tecido no lugar. </li><li> Com uma tesoura primavera Castroviejo, levante a camada superior do músculo nas coxas e fazer uma linha média cortada para expor o nervo ciático logo abaixo. O nervo ciático está localizada logo abaixo da camada muscular superior e corre acima do fêmur de sua saída perto dos quadris até que se ramifica para o fibular comum e nervo tibial pouco antes da articulação do joelho. </li><li> Remover o músculo acima do nervo ciático até ao point em que as profundas ramo do nervo fibular mergulha no músculo flexor longo do hálux (FLH) é visível. </li><li> Usando # 55 fórceps, dissecar o tecido conjuntivo ao redor do ramo fibular para libertá-la dos músculos gastrocnêmio e sóleo, que estão no lado medial da tíbia. Corte os tendões dos músculos gastrocnêmio e sóleo e removê-los cuidadosamente debaixo do nervo. </li><li> Retire o músculo superficial na face lateral da tíbia, para expor três pacotes distintos de tendão no tornozelo joint-de medial para lateral: FHL, EDL e tibial anterior (TA), com o EDL escondido debaixo da TA. </li><li> Cortar o tendão TA na articulação do tornozelo, levante o TA-se e longe da EDL, e cortar o músculo perto do joelho para removê-lo. </li><li> Cortar o tendão FHL no tornozelo e levantá-lo de volta para chegar à área onde o nervo entra no FHL. Corte logo abaixo desse ponto e remover ~ 2/3 do músculo FHL. </li><li> Corte o nervo ciático o mais próximo da articulação do quadril como possável e tira suavemente todos os ramos do nervo, exceto para o ramo fibular profundo. </li><li> Corte os tendões EDL em ambos os tornozelos e joelhos usando grandes tesoura primavera. </li><li> Utilizando uma tesoura afiada, remover o EDL, o restante FHL e nervo a partir do tecido circundante através do corte através do osso da tíbia no joelho e a meio da coxa. Corte o osso da tíbia remanescente de modo que apenas o EDL, parte da FHL e nervo permanecem. </li></ol> 2 montagem do músculo EDL e nervo no banho de tecidos (Figura 1A) <ol><li> Antes do início da experiência, se preparar o banho de tecido. Constantemente perfundir o banho oxigenado com (100% de O 2) do fluido intersticial sintético (SIF), contendo (em mM) 123 de NaCl, 3,5 de KCl, 0,7 MgSO4, 1,7 de NaH 2 PO 4, 2,0 de CaCl2, 9,5 de NaC 6 H 11 O ( gluconato de sódio), glucose 5,5, 7,5 sacarose, e 10 N-2-N hydroxyethylpiperazine- &#39;-2-etácido hanesulfonic (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Uma taxa de fluxo de 15-30 ml / min, é recomendado. É mostrado um banho disponível comercialmente, de 25 ml de capacidade, com dois eléctrodos estimulantes fixos ao fundo do banho, de um posto de tecido montada e uma montagem para um controlador de força e duração (dimensões aproximadas de banho 8,5 centímetros x 3 cm x 1 cm, para especificações consulte a Tabela de Materiais / Equipamentos). </li><li> Use o tecido FHL restante para lidar com o isolado músculo-nervo e colocá-lo no banho de tecido. Coloque um pequeno pedaço de Sylgard na parte inferior do prato e utilizar um pino de insectos através do tecido FHL restante para estabilizar o músculo. </li><li> Use 6-0 seda para amarrar os dois tendões e apor um final para o cargo de tecidos e outra para o braço de alavanca da força e controlador de comprimento (ver Tabela de Materiais / Equipamentos para especificações). Usar a menor comprimento de sutura que é prático. Retire o pino de insetos e Sylgard depois de ter amarrado os tendões. NOTA: Para facilitar a fácilligação ao braço de alavanca um pequeno pedaço de fio podem ser dobradas em forma de &quot;J&quot; e em forma de gancho fixado ao braço da alavanca com epóxi. A sutura pode ser amarrado ao fio em vez de rosca no pequeno orifício no braço de alavanca. </li><li> Faça eletrodos de sucção de SA 16 vidro usando primeiro um puxador de micropipeta de vidro (Heat = 286, Pull = 0, velocidade = 150, Time = 200); quebrar a ponta para trás e moê-lo manualmente sobre uma pedra de afiar, até há cerca de um cone de 3 mm. Derreta a ponta usando um microforge eo diâmetro interno do bico desejado de entre 10 - 100 mM, dependendo da área do nervo que se deseja amostrar (ver Figuras 1B-1C para eletrodo de esquemático e Tabela de Materiais / Equipamentos para informações sobre o produto). </li><li> Encha um eletrodo de sucção de vidro premade para o fio de prata interior com SIF. </li><li> Sucção do corte final do nervo para o eletrodo e conectar à porta positivo de um amplificador diferencial. Enrole o eletrodo com uma prata cloradafio que conecta a porta negativo do andar de entrada. Aterrar o banho SIF executando um segundo fio de prata clorada do banho de porta chão do headstage. Também aterrar o sistema de perfusão para a gaiola de Faraday em vários pontos para atenuar o ruído elétrico introduzido através das bombas de perfusão. </li><li> Estimular o músculo através dos eléctrodos montados em ambos os lados do músculo no banho de tecidos para induzir uma contracção de contração. Alternativamente colocar um eléctrodo estimulante sobre a extremidade cortada do nervo. Aumentar a tensão de estimulação, até que seja observado um pico de força contráctil e, então, aumentar a tensão por um adicional de 15% para alcançar a tensão supramáxima (0,5 mseg de largura de pulso). Continuar as contracções contração na voltagem supramáxima, com 10 seg de repouso no meio, mas pode variar o comprimento do músculo até que uma força contrátil do pico é atingido para encontrar o comprimento óptimo (L o) do músculo. Todas as rampas de comprimento e vibrações vão começar com o músculo neste Compº. </li><li> Permitir que a preparação do músculo do nervo para permanecer no banho durante pelo menos 1 hora antes da recolha de dados subsequente para permitir que o tecido para atingir a temperatura do banho e para a transmissão sináptica normal recuperar após dissecação numa solução de baixo teor de cálcio. </li><li> Para a recolha de dados a uma temperatura diferente da temperatura ambiente, colocar uma sonda de temperatura no banho de tecido perto do músculo. Lentamente trazer o banho até à temperatura de bombagem de água aquecida através da placa de base de tecido de banho. Enrole argila almofadas de aquecimento no forno em torno do reservatório SIF para ajudar a manter uma temperatura constante. </li></ol> 3 Coleta de Dados <ol><li> Para identificar um aferentes como aferentes do fuso, registrar a atividade neuronal durante as contrações de contração repetidos produzidos por um estímulo de tensão 0,5 supramaximal ms entregue uma vez a cada segundo. NOTA: aferentes do fuso muscular deve fazer uma pausa durante a 18,19 contração contração (Figura 2). </li><li> Use dasoftware de aquisição ta para aplicar as mudanças de comprimento em diferentes velocidades e em diferentes comprimentos. Use um script personalizado para automatizar esta tarefa (veja informações complementares para uma imagem do roteiro e orientações sobre como personalizar os trechos indicados). Aplicar trechos ramp-and-hold de 4 segundos em comprimentos de estiramento de 2,5%, 5% e 7,5% L o e velocidades de estiramento de 20, 40, ou 60% L o / sec 15. NOTA: Consulte o manual do usuário para a força específica e controlador de comprimento para fator de conversão necessário tensão-milímetro. </li><li> No final do experimento, determinar a saúde muscular a 24 ° C usando contrações tetânicas isométricas máximas (500 ms de trem, 120 Hz de frequência de comboios, 0,5 de largura de pulso ms, tensão supramaximal). Comparar a força de contração de pico para valores reportados anteriormente (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

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The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

O objetivo deste artigo foi descrever um método para gravar a partir de aferentes do fuso muscular em uma preparação do mouse músculo-nervo isolado. Descobrimos que aferentes do fuso rato responder de forma semelhante para esticar como aqueles a partir de ratos, gatos e seres humanos 15, e outros laboratórios têm usado ratinhos como organismos-modelo para estudar os neurónios sensoriais, tanto no músculo e a pele, in vitro (por exemplo 3,13) . Fibras aferentes sensoriais pode ser registada, pelo menos, 6-8 horas a tanto 24 ° C e 34 ° C. Para minimizar o manuseamento EDL e nervo, utilizar a parte restante do FHL para tratar o tecido sempre que possível. Após a dissecção, espere pelo menos uma hora para começar a coleta de dados para permitir que o tecido para equilibrar a temperatura do banho e para a transmissão sináptica normal, para se recuperar. Anteriormente, a saúde muscular foi verificada em um subconjunto de músculos usados ​​nesta preparação, determinando que o máximo tetânica contractile força gerada pelos músculos é similar ao relatado por outros no início e no fim da experiência 15. Aferentes do fuso de músculo foram identificados funcionalmente nesta preparação, procurando uma pausa na característica de disparo em resposta a contorcer contracção (Figura 2), bem como o aumento da frequência instantânea esperadas em resposta a alterações de comprimento (Figura 3). Em nossa experiência, a maioria dos aferentes que o fogo em condições de controle são aferentes do fuso muscular. O comprimento do nervo mantida nesta preparação (~ 7 mm, no máximo) não é suficientemente longo para utilizar as diferenças de velocidade de condução aferentes para identificar subtipos aferentes muscular 13. Além disso, ao contrário de gatos e seres humanos, as medidas de sensibilidade dinâmica não foram capazes de diferenciar claramente Grupo Ia e aferentes II em camundongos (para uma discussão mais aprofundada ver Wilkinson et al. 15). Outros subtipos de aferentes (por exemplo,. Grupo III e IV) podem ser identificados utilizando testes funcionais adicionais nesta preparação, por exemplo, por adição de substâncias, tais como a capsaicina, o ATP, ou a bradicinina, a diminuição do pH do banho, para expor o músculo isquemia, etc 3,13,21-23 Usando eletrodos de sucção permite que a atividade de múltiplos neurônios sensoriais a ser gravado de uma só vez, o que aumenta a quantidade de dados que podem ser coletados a partir de um único músculo. Esta preparação pode ser utilizada para avaliar o efeito global de uma perturbação nas respostas da população de neurónios sensoriais ou as respostas de aferentes identificados. Se as formas de pico são únicos o suficiente, até 4 neurônios sensoriais pode ser discriminado por software (ambos Spike2 (Cambridge Electronic Design) e LabChart Pro (AD Instruments) realizaram semelhante). Nos casos em que os neurônios não podem ser discriminados, mudança de posicionamento do eletrodo ou diâmetro da ponta pode ser facilmente implementado. Em resumo, o nervo-músculo do rato em vitro preparção é um método experimental simples que pode ser utilizada para investigar as propriedades de resposta de fibras aferentes sensoriais para vários modelos de perturbação, lesões e doenças físico-químicas. Além disso, esta preparação é ideal para aproveitar as poderosas ferramentas genéticas disponíveis em ratinhos transgénicos, incluindo animais e ferramentas optogenetic.

Os músculos esqueléticos são inervados por neurônios sensoriais que fornecem o sistema nervoso central, com informações importantes sobre o meio ambiente muscular. Os fusos musculares são altamente especializados estruturas encapsulados, constituído por fibras musculares intrafusais que estão localizados em paralelo com as fibras musculares extrahusales. Eixos são inervados pelo Grupo Ia e II aferentes que codificam mudanças no comprimento muscular e tom fibra intrafusal é regulada de forma dinâmica por inervação gama neurônios motores 1. Grupo aferentes Ib estão posicionadas entre as fibras musculares e suas inserções dos tendões e são sensíveis a mudanças na força muscular, por exemplo, durante a contração muscular 2. O Grupo Ia, Ib e II aferentes fornecer feedback proprioceptivo que auxilia no controle motor adequado. Populações adicionais de aferentes musculares localizados ao longo do músculo (Grupo III e IV) serve para sinalizar a acumulação do metabolito, na presença de estímulos nociceptivos, e a temperatura muscular <sup&gt; 3. Esta informação sensorial muscular é fundamental para manter a homeostase, evitando danos musculares e modulando movimento. Aferentes musculares podem alterar os seus padrões de disparo com base na experiência anterior 4. A ativação dos nociceptores pode levar à indução de estados de dor crônica 5 e sinalização aberrante dos proprioceptores musculares pode levar a problemas de equilíbrio ou movimento 6. Usamos um isolado músculo-nervo em preparação vitro para estudar a resposta do músculo terminações receptoras neurônio sensorial de camundongos adultos de ambos os sexos (mostrados são respostas 2-4 meses de idade C57BL / 6). O rato é a espécie genética modelo para estudos em mamíferos. Esta preparação requer o isolamento do ramo profundo fibular do nervo ciático e o músculo extensor digitorum longus (EDL), um musculares rápidas do grupo fibular encontrado na parte lateral da parte inferior da perna. A EDL é frequentemente usado para estudar as propriedades contráteis do músculo 7-9, tem tendons que são fáceis de isolar e é pequeno o suficiente para permitir o fornecimento de oxigénio por difusão adequada em repouso e com razoáveis ​​ciclos de contração 10. Outros músculos nesta área (por exemplo, sóleo e tibial anterior) são de tamanho semelhante e esta preparação pode ser facilmente modificado para gravar a partir de aferentes destes músculos. Um eléctrodo de sucção é colocado sobre a extremidade cortada do nervo para o músculo gravar sensorial aferente disparo. Neurônios individuais podem ser identificadas e analisadas quanto a sua forma spike spike usando software de classificação. Eléctrodos de estimulação no banho ou no nervo pode ser utilizado para evocar a contracção muscular. Comprimento do músculo e força pode ser controlada e medida usando sistemas disponíveis comercialmente. Similar preparações in vitro têm sido utilizados em roedores para estudar músculos aferentes do grupo III e IV no rato EDL 11, Grupo IA e II aferentes do fuso muscular no quarto dedo do pé lumbrical rato 12 e Grupo III e IV musculares aferentes em tele muscular rato plantar 13. Um sistema in vitro, tem as vantagens de acessibilidade farmacológico e um controlo directo de variáveis ​​de perfusão e físico-químicas, como a temperatura e pH. Uma abordagem in vitro elimina o potencial in vivo confunde de anestesia e muscular estado de perfusão. Embora a preparação do músculo-nervo permite o estudo da resposta directa de uma perturbação nos aferentes, a capacidade para estudar gama eferente modulação da sensibilidade do fuso e outras respostas integradas, que é possível com 14 in vivo ou ex vivo três preparações são sacrificados como não existem corpos celulares neuronais em esta preparação. Esta preparação foi previamente usada para caracterizar a resposta de aferentes do fuso muscular do rato a uma bateria de rampa e mantenha alongamentos e vibrações e foi determinado que respons aferentes do fuso ratoes foram semelhantes aos relatados em outras espécies, como ratos, gatos e seres humanos. Rato respostas aferentes fuso foram encontrados para ser semelhante em ambos os 24 ° C e 34 ° C temperatura do banho, embora a 34 ° C as taxas de queima absoluto foram mais rápidas e os aferentes eram mais capazes de responder mais rapidamente a alterações de comprimento 15. Descrevemos abaixo como esta preparação pode ser usado para identificar e estudar os aferentes do fuso muscular. Além disso, esta preparação pode ser facilmente modificado para estudar a resposta de outros subtipos aferentes músculo 13, para comparar as propriedades de aferentes sensoriais em resposta a um estado de doença ou de drogas ou de outras variáveis ​​variados (por exemplo, idade, sexo, knockout de genes).

<table><tbody><tr><td>Force and Length Controller &amp;amp; Tissue Bath</td><td>Aurora Scientific, Inc.</td><td>300C-LR &amp;amp; 809B-IV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &amp;amp; Easy Load II Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07523-80 &amp;amp; EW-77200-60</td><td></td></tr><tr><td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &amp;amp; Headstage Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 1800; 700000 &amp;amp; 700500</td><td></td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; Aurora Scientific, Inc.</td><td>S88&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; 701 C</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Swift</td><td>892070</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Source</td><td>Fiberlite</td><td>Model 190</td><td></td></tr><tr><td>Analog to Digital Board</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>AD Instruments</td><td>LabChart Pro 7</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>A-M Systems</td><td>672445</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Glass</td><td>Dagan</td><td>SA16</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td></td></tr><tr><td>Isoflourane</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>18627</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Surgical Tools&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Large Dissecting Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14014-17</td><td></td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Large Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>#55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharp Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk Suture</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF&lt;br/&gt; (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium gluconate</td><td>Sigma</td><td>S2054-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S8282-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muscle neurônios sensoriais que inervam os fusos musculares e os órgãos tendinosos de Golgi codificar mudanças essenciais para a propriocepção comprimento e força. Fibras aferentes adicionais monitorizar outras características do ambiente muscular, incluindo a acumulação do metabolito, a temperatura e os estímulos nociceptivos. No geral, a ativação anormal dos neurônios sensoriais pode levar a perturbações do movimento ou síndromes de dor crônica. Descreve-se o isolamento do extensor digitorum longus (EDL) do nervo do músculo e para estudo in vitro de respostas evocadas por estiramento aferentes no rato adulto. Actividade sensorial é gravado a partir do nervo com um eléctrodo de sucção e aferentes individuais podem ser analisados ​​usando software de ponto de triagem. Preparações in vitro para permitir estudos bem controlados em aferentes sensoriais, sem os potenciais confunde de anestesia ou perfusão muscular alterados. Aqui nós descrevemos um protocolo para identificar e testar a resposta de aferentes do fuso muscular para esticar. É importante ressaltar queesta preparação também suporta o estudo de outros subtipos de aferentes musculares, propriedades de resposta após a aplicação de drogas e a incorporação de abordagens genéticas potentes e modelos de doença em ratinhos.

A resposta de aferentes musculares podem ser gravados na sequência de uma variedade de perturbações, dependendo de qual o subtipo aferente está a ser estudado. Respostas representativas de aferentes do fuso muscular para a contração muscular e rampa e mantenha trecho são mostrados aqui. Para identificar um aferente como um fuso aferentes, twitch contracções são dadas uma vez em cada segundo (0,5 mseg de largura de impulso), para ver se há uma pausa na queima durante a contracção 18,19. Figura 2 mostra um traçado representativo da actividade neuronal e na tensão do músculo durante essas contrações de contração. Nenhuma atividade neuronal é observado durante as contrações de contração, como esperado para aferentes do fuso. Se o aferentes registrado foi um aferentes órgão tendinoso de Golgi Grupo Ib, um aumento na taxa de disparo durante a contração seria de se esperar. Em condições de controle mais aferentes com um padrão de disparo normal (~ 12 impulsos / seg a 24 ° C e ~ 32 impulsos / seg a 34 ° C) São aferentes do fuso muscular. Um subconjunto de aferentes do fuso será apenas fogo durante o estiramento (nas nossas mãos ~ 11% de aferentes do fuso) 15. Figura 3A mostra um traçado representativo de duas matérias-aferentes do fuso muscular de responder a uma rampa e segurar estiramento produzido pelo controlador de força e duração. A característica de pico do histograma LabChart é utilizado para identificar e analisar a frequência de disparo instantâneo dos dois neurónios individuais separadamente (figuras 3B-3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 isolado músculo Preparação A) O longus extensor longo dos dedos (EDL) e inervação do nervo ciático são montados em um banho de tecido isolado perfundido com oxigenado sintético líquido intersticial (SIF). Um amplificador extracelular ligado a uma suctiem eletrodo registra a atividade neural. A dupla força e comprimento controlador com software de controles e medidas adequadas a força muscular e comprimento. Os eletrodos de banho tecido entregar estímulos para produzir contração muscular ou contrações tetânicas. Bombeamento de água aquecida através de canais de placas banho internos controla a temperatura do banho de tecido. B) Puxado eletrodo de sucção de vidro com ~ 3 milímetros ponta afilada. C) Magnified representação da forma da ponta ideal para o eletrodo de sucção que é produzido usando uma microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Spindle Aferente Response to Twitch contração. Activit Neuronaly (traço superior) e da tensão muscular (traço inferior) de 30 contrações de contração são sobrepostos com alto traço de sobreposição em preto. Atividade aferente faz uma pausa durante o aumento da tensão induzida pela contração, que é uma resposta característica de aferentes do fuso muscular. Suporte e flecha acima do topo traço denotar o tempo durante a contração quando a atividade é interrompida. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3 Spindle Aferente Resposta a rampa e Segure Trecho A) atividade neural Raw de dois aferentes (top Trace) durante uma rampa e mantenha trecho aplicado à EDL (comprimento do músculo mostrado em traço inferior). B) freqüência de disparo instantâneo (Inst. Fr., impulsos por segundo) da unidade de actividade em L o de A exibindo (em azul). C) Instantanéfreqüência de disparo ous da unidade mais pequena que só é acionado durante o alongamento (mostrado em laranja). Ambas as unidades apresentam a adaptação de freqüência de pico durante o trecho que é característica de aferentes do fuso muscular 1.

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An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento.

Um<em&gt; In Vitro</emPreparação Muscle-nervo&gt; Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

17.0K visualizações.  San José State University.  Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento. 

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Neurociência

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

A Unidade Funcional Motor na placa de cultura: Co-cultivo de explantes da Medula Espinhal e as células musculares

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto<em&gt; Em vivo</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Um<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

In vitro caracterização funcional de Rato Colorretal Aferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Medicina

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative to understand the cellular and molecular changes involved in maintaining and repairing NMJs. For this purpose, we have developed a method to reliably and consistently examine regenerating NMJs in mice. This nerve injury method involves crushing the common fibular nerve as it passes over the lateral head of the gastrocnemius muscle tendon near the knee. Using 70 day old female mice, we demonstrate that motor axons begin to reinnervate previous postsynaptic targets within 7 days post-crush. They completely reoccupy their previous synaptic areas by 12 days. To determine the reliability of this injury method, we compared reinnervation rates between individual 70 day old female mice. We found that the number of reinnervated postsynaptic sites was similar between mice at 7, 9, and 12 days post-crush. To determine if this injury assay can also be used to compare molecular changes in muscles, we examined levels of the gamma-subunit of the muscle nicotinic receptor (gamma-AChR) and the muscle-specific kinase (MuSK). The gamma-AChR subunit and MuSK to are highly upregulated following denervation and return to normal levels following reinnervation of NMJs. We found a close relationship between transcript levels for these genes and innervation status of muscles. We believe that this method will accelerate our understanding of the cellular and molecular changes involved in repairing the NMJ and other synapses.

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

O nervo fibular método de lesão: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que o reparo Junções Neuromusculares

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

Na Vivo Eletrofisiológica medição do potencial de ação muscular composto de membros dianteiros em modelos de Mouse de degeneração do neurônio Motor

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

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