KPM foi apoiado pela UE FP7 (RETICIRC).

1. Criação de peixes Os embriões foram mantidos e criados em condições normais (Marca 2002) e encenado acordo com o desenvolvimento em dias pós fertilização (dpf). Adultos e larvas a 5 dpf, foram utilizados para as medições. 2. Procedimento experimental <ol><li> Preparação do instrumento </li></ol> Larvas: larvas de peixes foram embebidas em 3% pré-aquecido (28 ° C) de metilcelulose a evitar os movimentos do corpo. Os embriões foram colocados lado dorsal para cima no VisioTracker, de frente para a tela de projecção. Peixes adultos: Os peixes foram anestesiados brevemente em 300 mg / l MS-222, montado no dispositivo de imobilização e colocado no VisioTracker. Antes medições foram iniciadas, foram deixados a recuperar durante 1-2 min. <ol start="2"><li> Geração de padrões de estímulo </li></ol> Padrões de estímulos que consistem em verticais em preto-e-branco de onda sinusoidal grades que giram em torno do peixe foram criadosusando o pacote de software proprietário. Podiam ser modulada por meio do pacote de software de acordo com a forma de onda, o contraste, a intensidade, a velocidade angular ea frequência espacial. Padrões foram projetadas na tela usando um projetor digital de luz contida dentro da VisioTracker. A distância aproximada entre o olho do peixe e da tela foi de 4,5 cm, eo tamanho de projeção em tela foi de 360 ​​graus na horizontal e 55 ° na vertical. Para larvas de peixes, direção de estimulação foi alterada com uma freqüência de 0,33 Hz para reduzir a frequência dos movimentos sacádicos. Peixes adultos foram estimuladas unidireccional e apenas o olho estimulada em tempo-para-nasal direcção foi considerada, desde nasal-to-temporal do olho de velocidade, em geral, é significativamente mais baixa e quase constante (ver Mueller e Neuhauß, 2010). <ol start="3"><li> Registro dos movimentos oculares </li></ol> A imagem de campo brilhante da cabeça do peixe foi alimentado a uma câmara de vídeo de infravermelhos. Iluminação infravermelha de peixes foi feita from abaixo. A câmera gravou imagens a uma taxa de 5 quadros / segundo (larvas) ou 12,5 frames / segundo (adultos), respectivamente. As imagens são automaticamente processadas, corrigidas e alisou para a forma dos olhos. Orientação do olho, em relação ao eixo horizontal foi então determinada automaticamente e velocidade do olho foi calculado com o pacote de software proprietário. Pequenos movimentos dos peixes foram corrigidas automaticamente pelo software. Toda a gravação ea análise foi realizada em tempo real. 3. Pós-processamento de dados experimentais <ol><li> Medições de velocidades olho-primas foram filtrados para sacadas, a fim de extrair lenta fase de velocidade. </li><li> Curvas de velocidade Sacada-filtradas dos olhos foram suavizadas por uma média de execução com uma janela deslizante de 7 frames. </li><li> Velocidade de olho foi em média mais de quadros com condições de estímulo idênticos. </li><li> Para larvas de peixes, a velocidade média foi de olho sobre ambos os olhos. </li></ol> 4. Os resultados representativos: <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A fim de avaliar as capacidades do VisioTracker para larvas de peixes e adultos, foram realizados experimentos com larvas do peixe em 5 dpf, e peixe-zebra adulto. Para Zebrafish larval, o mutante pára-choques foi o escolhido. Nesta lente, mutante células epiteliais hyperproliferate, levando a lente tamanho reduzido e localização ectópica da lente. Estas alterações morfológicas são reflectidas por uma redução significativa da sensibilidade ao contraste e acuidade visual (Schonthaler et al., 2010). A Figura 1 demonstra a diferença de sensibilidade de contraste de mutantes contra carros de tipo selvagem siblings. Mutantes carros cada vez falha em ajustar a velocidade do olho como as diminuições de contraste de estímulo. Por analogia, quando a frequência de estímulo espacial é aumentada, isto é, a largura de banda é reduzida estímulo, os mutantes para carros igualmente demonstram diminuição da acuidade visual (Fig. 2) A dependência do adulto Zebrafish visual de desempenho em condições ambientais foi investigada sujeitando o peixe a variação das concentrações de álcool no tanque de água durante 30 minutos e, subsequentemente, medindo a resposta optocinético sob condições de estímulo variados. Peixe-zebra adultos mostram uma redução na sensibilidade de contraste, quando mantidos em concentrações crescentes de álcool (Fig. 3). A redução dependente da dose semelhante de velocidade global do olho ao longo de um vasto leque de frequências espaciais pode ser observado quando os peixes foram tratadas com concentrações crescentes de álcool (Fig. 4). Tratamento do álcool, além disso, dependente da dose, reduz o desempenho oculomotor em tarefas mais exigentes, como exemplificado por velocidades de estímulo aumentados (Fig. 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig1.jpg" /> Figura 1. Zebrafish velocidade olho larval depende de contraste estímulo. 10 mutantes para carros e 10 do tipo selvagem irmãos foram analisadas em cinco dpf sob diferentes s<html> contraste timulus condições de distribuição. Gráfico mostra a velocidade média olho ± 1 SEM. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig2.jpg" /> Figura 2. Zebrafish velocidade olho larval é dependente de freqüência espacial. 10 e 10 para carros mutantes do tipo selvagem irmãos foram submetidas a diferentes larguras de banda de estímulo a 5 dpf e analisados ​​como descrito. Gráfico mostra a velocidade média olho ± 1 SEM. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig3.jpg" /> Figura 3. Adulto Zebrafish álcool mostram redução dependente da concentração na sensibilidade ao contraste. Adulto Zebrafish foram mantidas em diferentes concentrações de álcool, tal como indicado, durante 30 minutos e analisadas sob variadas condições de contraste de estímulo de banda. O gráfico mostra a velocidade média temporal de olho-de-nasal ± 1 SEM, de 9 de peixe por grupo (com excepção do grupo de controlo: n = 11). e 4 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg / &quot;/&gt; Figura 4. Adulto Zebrafish álcool mostram redução dependente da concentração nos movimentos oculares geral sobre uma vasta gama de largura de faixa do estímulo. Adulto Zebrafish foram mantidas em diferentes concentrações de álcool, tal como indicado, durante 30 minutos e analisadas sob variadas condições de estímulo de largura de banda. O gráfico mostra a velocidade média temporal de olho-de-nasal ± 1 SEM, de 9 de peixe por grupo (com excepção do grupo de controlo: n = 11). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig5.jpg" /> Figura 5. Adulto Zebrafish mostra álcool redução dependente da concentração nos movimentos dos olhos em geral sobre uma ampla gama de velocidades de estímulo. Adulto Zebrafish foram mantidas em diferentes concentrações de álcool, tal como indicado, durante 30 minutos e analisados ​​sob condições variáveis ​​de velocidade do estímulo. Gráfico mostra a velocidade média temporal de olho-de-nasal ± 1 SEM de 9 de peixes por grupo (exceto grupo controle:n = 11).

<ol>
	<li>Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fade+out+mutant+is+a+novel+genetic+model+for+Hermansky-Pudlak+syndrome.">The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome.</a> Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).</li><li>Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instrumentation+for+measuring+oculomotor+performance+and+plasticity+in+larval+organisms.">Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms.</a> Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).</li><li>Brand, M. G. M., N&#252;sslein-Vollhard, C., N&#252;sslein-Vollhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+Zebrafish.">Keeping and raising Zebrafish.</a> Zebrafish, Practical Approach Series. , 7-37 (2002).</li><li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+vision+in+the+zebrafish+(Danio+rerio).">The development of vision in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).</li><li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+eye+movements+in+the+zebrafish+(Danio+rerio).">The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).</li><li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+in+zebrafish:+behavior+and+histology.">Visual acuity in zebrafish: behavior and histology.</a> Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).</li><li>Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optokinetic+response+in+zebrafish+and+its+applications.">The optokinetic response in zebrafish and its applications.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).</li><li>Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+tuning+by+visual+feedback+of+the+stability+of+a+neural+integrator.">Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).</li><li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurements+of+the+optokinetic+response+in+adult+fish.">Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish.</a> J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).</li><li>Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+vision+revealed+by+a+behavioral+screen+of+400+essential+loci+in+zebrafish.">Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish.</a> J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).</li><li>Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+asymmetries+in+the+optokinetic+response+of+larval+zebrafish.">Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish.</a> Zebrafish. 2, 189-196 (2005).</li><li>Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+arrestin+confers+cone+vision+of+high+temporal+resolution+in+zebrafish+larvae.">Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).</li><li>Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optokinetic+behavior+is+reversed+in+achiasmatic+mutant+zebrafish+larvae.">Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae.</a> Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).</li><li>Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+sensitivity,+spatial+and+temporal+tuning+of+the+larval+zebrafish+optokinetic+response.">Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 .</li><li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+cone+specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone-response+recovery+and+delayed+dark+adaptation.">Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li><li>Roeser, T., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visuomotor+behaviors+in+larval+zebrafish+after+GFP-guided+laser+ablation+of+the+optic+tectum.">Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum.</a> J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).</li><li>Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+mutant+leberkn+del/vam6+resembles+human+multi-systemic+disorders+caused+by+aberrant+trafficking+of+endosomal+vesicles.">The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles.</a> Development. 135, 387-399 (2008).</li><li>Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+mutant+bumper+shows+a+hyperproliferation+of+lens+epithelial+cells+and+fibre+cell+degeneration+leading+to+functional+blindness.">The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness.</a> Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).</li><li>Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. v. o. n., Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+the+pmel17+gene+leads+to+defects+in+melanosome+biogenesis+and+alterations+the+visual+system+in+the+zebrafish+mutant+fading+vision.">A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision.</a> Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).</li></ol>

Oliver DR Schnaedelbach e Holger D. Russig são funcionários do TSE Systems GmbH, que produz o sistema de rastreamento visual de desempenho utilizado neste artigo. A produção deste artigo foi patrocinado pelo TSE Systems GmbH. Stephan CF Neuhuass é funcionário da Universidade de Zurique, que recebe uma remuneração por sistemas TSE para cada sistema vendido.

A importância da OKR para o estudo da função visual foi reconhecido na comunidade científica por um longo tempo (Páscoa e Nicola 1996, 1997), e as tentativas de realmente quantificar o paradigma começaram bem mais de uma década atrás. Páscoa e Nicola (1996) desenvolveu um sistema motorizado com tambores rotativos listradas, onde a gravação de vídeo de movimento dos olhos foi analisada manualmente. Este sistema sofreu da falta de imobilização do embrião de peixe, que é exigido manual do reposicionamento frequente, e podem detectar os movimentos de rastreamento de olhos apenas com grande dificuldade. Um passo foi a utilização de um tambor de vídeo-listrado projectada para permitir a apresentação do estímulo mais variáveis ​​geradas por computador (Roeser &amp; Baier, 2003;. Rinner et al, 2005a). A maior parte manual, análise do quadro-a-quadro de gravação em vídeo tem provado ser extremamente laborioso, e até um certo grau dificultada pelo observador viés (Beck et al.,2004). Análise automatizada em tempo real foi sugerido para permitir a utilização de mecanismos de feedback comportamentais de aprendizagem (Major et al., 2004). O uso de iluminação infravermelha e frequência controlada estímulos rotativas foi iniciada por Beck et al. (2004). No entanto, o sistema descrito não só tem sido utilizado para as larvas, e a análise foi realizada off-line. Além disso, o VisioTracker permite o controlo completo sobre a estímulos, incluindo alterar o estímulo durante a experiência, permitindo assim uma maior flexibilidade e espontânea influência sobre o curso da experiência. Além disso, a criação de estímulo digital utilizado pelo VisioTracker superaram os problemas mencionados anteriormente com a aceleração da massa inerte de um tambor de estímulo listrado (Beck et al., 2004). Restrição larvas por metilcelulose não interfere significativamente com o movimento dos olhos e não tem quaisquer efeitos de longo prazo sobre zebrafish bem-estar. Larvas de peixes foram sucessomantida incorporado em metilcelulose durante vários dias, até que o fornecimento de oxigénio através da pele torna-se insuficiente para a procura com o aumento da idade (Qian et al., 2005). O adulto método de restrição de peixe é igualmente fácil sobre o animal. A curta duração da experiência, em conjunto com a opção de trocar rapidamente o animal de teste para uma diferente, aumenta ainda mais os aspectos positivos do bem-estar dos animais do sistema. Uma vez que as brânquias são continuamente lavado com água, é conveniente a espiga da água com os produtos químicos de escolha para estudar o seu efeito sobre os movimentos dos olhos e do desempenho visual. Da mesma forma um experimento de wash-out podem ser adicionados sem a necessidade de manusear o animal entre as experiências. Ruído pixel da imagem de vídeo foi minimizado pelo alisamento algoritmos do software VisioTracker proprietário, permitindo medições altamente precisas da posição do olho e velocidade angular. Além disso, para facilitar a estatísticaanálise, o software filtrados movimentos sacádicos que ocorrem em velocidade fixa e não contribuem para a afirmação experimental. Uma média de curvas de velocidade mais de 7 quadros de vídeo facilitou a análise posterior. O VisioTracker abre uma nova dimensão para muitas áreas de pesquisa variadas. O sistema e os seus antecessores já foram utilizados com sucesso para quantificar o desempenho visual em larvas do peixe, usando parâmetros como acuidade visual, sensibilidade ao contraste e adaptação à luz (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), de análise funcional do fotorreceptores cone após a manipulação dos membros da cascata de transdução visual (por exemplo, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), ou a análise dos defeitos visuais em larvas do peixe mutante (por exemplo, Schonthaler et al, 2005, 2008,. Bahadori et al., 2006). A interdependência de maturação morfológica e funcional do sistema visualfoi estudado através de medições okr para mostrar que a acuidade visual é principalmente, mas não completamente limitada por espaçamento de fotorreceptores em estágios larvais (Haug et al., 2010). O VisioTracker é igualmente adequado para analisar a função visual em zebrafish adultos e outras semelhantes espécies de peixes de tamanho (Mueller e Neuhauß (2010), este relatório). Também é concebível utilizar o sistema em áreas de pesquisa, tais como a farmacologia toxicologia ou em que as substâncias a serem investigadas podem ser adicionados ao fluxo de água em torno das guelras dos peixes adultos. Além disso, a versatilidade do VisioTracker permite análises mais completas, por exemplo, de ontogenéticas da função visual, a função do circuito neural e desenvolvimento, ou controle sensório-motor (ver revisão em Huang &amp; Neuhauß, 2008).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Metilcelulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> Etil-3-aminobenzoato metanossulfonato de (MS-222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> 35 prato de cultura de células milímetros </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Soro pipeta </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 612 361 </td></tr><tr><td> VisioTracker </td><td> TSE Sistemas </td><td> 302060 </td></tr></tbody></table>

visiotracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis

As investigações sobre o desenvolvimento do sistema visual e função exigir quantificáveis ​​modelos comportamentais de desempenho visual que são fáceis de obter, robusto e simples de manipular. Um modelo adequado foi encontrado na resposta optocinético (OKR), um comportamento reflexivo presente em todos os vertebrados, devido ao seu valor elevado de selecção. O OKR envolve lentos estímulo seguintes os movimentos dos olhos alternados com rápidos sacadas reajuste. A medição deste comportamento é facilmente realizado em larvas de peixe-zebra, devido ao seu início precoce e estável (plenamente desenvolvida após 96 horas pós-fertilização (hpf)), e beneficiando de o conhecimento completo sobre zebrafish genética, por décadas um do modelo preferido organismos nesta área. Enquanto isso, a análise de mecanismos similares em peixes adultos ganhou importância, principalmente para aplicações farmacológicas e toxicológicas. Aqui descrevemos VisioTracker, totalmente automatizada e de alta throughput sistema para análise quantitativa do desempenho visual. O sistema é baseado em pesquisas realizadas no grupo do Prof Stephan Neuhauß e foi re-desenhado por Sistemas TSE. Ele consiste de um dispositivo de imobilização para os peixes pequenos monitorado por uma câmera de vídeo de alta qualidade equipada com uma lente zoom de alta resolução. O recipiente de peixe está rodeado por uma grade do tambor rotativo, em que os padrões gerados por computador de incentivos pode ser projectada. Os movimentos dos olhos são registadas e analisadas automaticamente pelo pacote de software VisioTracker em tempo real. A análise dos dados permite o reconhecimento imediato de parâmetros tais como duração da fase de lenta e rápida, frequência do ciclo de movimento lento, em fase de ganho, acuidade visual e sensibilidade ao contraste. Os resultados típicos permitir, por exemplo, a rápida identificação de mutantes do sistema visual que mostram nenhuma alteração aparente na morfologia do tipo selvagem, ou na determinação dos efeitos quantitativos do farmacológicos ou tóxicos e mutagénicosagentes no desempenho do sistema visual.

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VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

O VisioTracker é um sistema automatizado para a análise quantitativa do desempenho visual de peixes adultos e larvas pequeno baseado no registro dos movimentos oculares. Ele possui total controle sobre propriedades de estímulo visual e análise em tempo real, permitindo alto rendimento de pesquisa em campos como o desenvolvimento do sistema visual e função, farmacologia, estudos de circuitos neurais e integração sensório-motora.

VisioTracker, uma abordagem inovadora Automatizada de Análise Oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

visiotracker-an-innovative-automated-approach-to-oculomotor-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K visualizações.  University of Zurich. O VisioTracker é um sistema automatizado para a análise quantitativa do desempenho visual de peixes adultos e larvas pequeno baseado no registro dos movimentos oculares. Ele possui total controle sobre propriedades de estímulo visual e análise em tempo real, permitindo alto rendimento de pesquisa em campos como o desenvolvimento do sistema visual e função, farmacologia, estudos de circuitos neurais e integração sensório-motora.

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Neurociência

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and dysfunctional brain.1 However, development of a platform to stimulate and store eye movements can require substantial programming, time and costs. Many systems do not offer the flexibility to program numerous stimuli for a variety of experimental needs. However, the VisualEyes System has a flexible architecture, allowing the operator to choose any background and foreground stimulus, program one or two screens for tandem or opposing eye movements and stimulate the left and right eye independently. This system can significantly reduce the programming development time needed to conduct an oculomotor study. The VisualEyes System will be discussed in three parts: 1) the oculomotor recording device to acquire eye movement responses, 2) the VisualEyes software written in LabView, to generate an array of stimuli and store responses as text files and 3) offline data analysis. Eye movements can be recorded by several types of instrumentation such as: a limbus tracking system, a sclera search coil, or a video image system. Typical eye movement stimuli such as saccadic steps, vergent ramps and vergent steps with the corresponding responses will be shown. In this video report, we demonstrate the flexibility of a system to create numerous visual stimuli and record eye movements that can be utilized by basic scientists and clinicians to study healthy as well as clinical populations.

Neural control and cognitive processes can be studied through eye movements. The VisualEyes software allows an operator to program stimuli on two computer screens independently using a simple, custom scripting language. The system can stimulate tandem eye movements (saccades and smooth pursuit) or opposing eye movements (vergence) or any combination.

VisualEyes: Um sistema de software modular para Experimentação Oculomotor

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Análise automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Usando CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Análise de marcha automatizados em ratos com lesão crônica de constrição

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...