KPM è stato supportato da EU FP7 (RETICIRC).

1. Allevamento di pesci Gli embrioni sono stati tenuti e allevati in condizioni standard (Marca 2002) e messo in scena in base allo sviluppo in post fecondazione giorni (dpf). Adulti e larve al 5 dpf sono stati utilizzati per le misurazioni. 2. Procedura sperimentale <ol><li> Preparazione dello strumento </li></ol> Larve: le larve di pesci sono stati incorporati nel 3% pre-riscaldato (28 ° C) metilcellulosa per impedire i movimenti del corpo. Gli embrioni sono stati collocati nella parte dorsale del VisioTracker, di fronte allo schermo di proiezione. Pesci adulti: pesce erano anestetizzati brevemente in 300 mg / l MS-222, inserito nel dispositivo di immobilizzazione e posto nel VisioTracker. Prima che le misurazioni sono state avviate, sono stati lasciati a riposo per 1-2 min. <ol start="2"><li> Generazione di pattern di stimolo </li></ol> Modelli di stimolo costituiti da verticali e nero-bianco sinusoidali griglie rotanti intorno al pesce sono stati creatiutilizzando il pacchetto software proprietario. Potrebbero essere modulata attraverso il pacchetto software in base alla forma d&#39;onda, contrasto, intensità, velocità angolare e la frequenza spaziale. Patterns sono state proiettate sullo schermo con un proiettore digitale di luce contenuta all&#39;interno del VisioTracker. La distanza approssimativa tra l&#39;occhio del pesce e lo schermo è stato di 4,5 cm, e la dimensione di proiezione su schermo era 360 gradi in orizzontale e 55 gradi in verticale. Per larve, direzione di stimolazione è stato modificato con una frequenza di 0,33 Hz per ridurre la frequenza saccade. I pesci adulti sono stati stimolati unidirezionalmente e solo l&#39;occhio stimolata temporale-to-nasale direzione è stato considerato, dal naso-a-temporale della velocità degli occhi in generale è notevolmente inferiore e meno costante (vedi Mueller e Neuhauß, 2010). <ol start="3"><li> La registrazione dei movimenti oculari </li></ol> Un campo chiaro immagine della testa del pesce è stato alimentato ad una telecamera a infrarossi. Illuminazione a infrarossi di pesce è stata effettuata from seguito. La fotocamera registra le immagini a una velocità di 5 fotogrammi / secondo (larve) o 12,5 fotogrammi / secondo (adulti), rispettivamente. Le immagini vengono automaticamente elaborati, corretti e lisciato per la forma degli occhi. Orientamento dell&#39;occhio rispetto all&#39;asse orizzontale è stata quindi determinata automaticamente e velocità occhio è stato calcolato dal pacchetto software proprietario. Piccoli movimenti del pesce venivano corretti automaticamente dal software. Tutto registrazione e analisi è stato ottenuto in tempo reale. 3. Post-elaborazione dei dati sperimentali <ol><li> Prime misurazioni di velocità oculari sono stati filtrati per saccadi per estrarre lenta velocità di fase. </li><li> Saccade-filtrati curve di velocità degli occhi sono state levigate da una media di esecuzione con una finestra scorrevole di 7 fotogrammi. </li><li> La velocità degli occhi è stato in media su telai con identiche condizioni di stimolo. </li><li> Per le larve dei pesci, la velocità occhio era una media di oltre entrambi gli occhi. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Al fine di valutare le capacità del VisioTracker per le larve dei pesci e degli adulti, gli esperimenti sono stati effettuati con le larve di zebrafish a 5 dpf, e zebrafish adulto. Per Zebrafish larvale, il mutante paraurti è stato scelto. In questo mutante, le cellule epiteliali lente hyperproliferate, portando a dimensioni ridotte e lente posizione ectopica della lente. Queste alterazioni morfologiche sono riflessi da una significativa riduzione della sensibilità al contrasto e l&#39;acuità visiva (Schönthaler et al., 2010). La Figura 1 mostra la differenza di sensibilità al contrasto di mutanti paraurti contro wild-type fratelli. Mutanti paraurti sempre più non riescono a regolare la velocità occhio al diminuire di contrasto dello stimolo. Per analogia, quando la frequenza spaziale è aumentato stimolo, cioè la larghezza di banda stimolo è diminuita, mutanti paraurti inoltre evidente riduzione dell&#39;acuità visiva (Fig. 2) La dipendenza degli adulti Zebrafish Visual prestazioni alle condizioni ambientali è stato studiato sottoponendo il pesce per diverse concentrazioni di alcol nel serbatoio di acqua per 30 minuti e successivamente la misurazione della risposta optokinetic in condizioni variabili di stimolo. Zebrafish adulti mostrano una marcata riduzione della sensibilità al contrasto quando mantenuti in concentrazioni crescenti di alcool (Fig. 3). Una simile riduzione dose-dipendente della velocità complessiva occhio in un ampio intervallo di frequenze spaziali potrebbe essere osservata quando il pesce sono state trattate con concentrazioni crescenti di alcool (Fig. 4). Trattamento di alcol, inoltre, dose-dipendente riduce le prestazioni oculomotore a compiti più impegnativi come esemplificato dalla velocità di stimoli maggiori (Fig. 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig1.jpg" /> Figura 1. Velocità occhio Zebrafish larvale dipende dal contrasto stimolo. 10 mutanti paraurti e 10 fratelli wild-type sono stati analizzati a 5 dpf in varie s<html> timulus striscia di contrasto condizioni. Il grafico mostra la velocità media occhio ± 1 SEM. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig2.jpg" /> Figura 2. Velocità occhio Zebrafish larvale dipende dalla frequenza spaziale. 10 mutanti paraurti e 10 di tipo selvatico fratelli sono stati sottoposti a diverse larghezze banda stimolo a 5 dpf e analizzati come descritto. Il grafico mostra la velocità media occhio ± 1 SEM. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig3.jpg" /> Figura 3. Zebrafish adulto mostra la concentrazione di alcol-dipendente riduzione della sensibilità al contrasto. Adulto Zebrafish sono stati mantenuti in concentrazioni variabili alcol come indicato per 30 minuti e analizzati in condizioni di banda variabili stimolo contrasto. Il grafico mostra la media temporale-to-nasale velocità occhio ± 1 SEM di 9 pesci per gruppo (eccetto gruppo di controllo: n = 11). e 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Zebrafish adulto alcool mostrano concentrazione-dipendente riduzione complessiva movimento dell&#39;occhio in un ampio intervallo di larghezza di banda stimolo. Adulto Zebrafish sono stati mantenuti in concentrazioni variabili alcol come indicato per 30 minuti e analizzati in condizioni di banda variabili stimolo larghezza. Il grafico mostra la media temporale-to-nasale velocità occhio ± 1 SEM di 9 pesci per gruppo (eccetto gruppo di controllo: n = 11). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig5.jpg" /> Figura 5. Adult mostra Zebrafish alcol concentrazione-dipendente riduzione complessiva movimento dell&#39;occhio in un ampio intervallo di velocità di stimolo. Adulto Zebrafish sono stati mantenuti in concentrazioni variabili alcol come indicato per 30 minuti ed analizzati in diverse condizioni di velocità di stimolo. Il grafico mostra la media temporale-to-nasale velocità occhio ± 1 SEM di 9 pesci per gruppo (gruppo di controllo ad eccezione di:n = 11).

<ol>
	<li>Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fade+out+mutant+is+a+novel+genetic+model+for+Hermansky-Pudlak+syndrome.">The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome.</a> Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).</li><li>Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instrumentation+for+measuring+oculomotor+performance+and+plasticity+in+larval+organisms.">Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms.</a> Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).</li><li>Brand, M. G. M., N&#252;sslein-Vollhard, C., N&#252;sslein-Vollhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+Zebrafish.">Keeping and raising Zebrafish.</a> Zebrafish, Practical Approach Series. , 7-37 (2002).</li><li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+vision+in+the+zebrafish+(Danio+rerio).">The development of vision in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).</li><li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+eye+movements+in+the+zebrafish+(Danio+rerio).">The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).</li><li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+in+zebrafish:+behavior+and+histology.">Visual acuity in zebrafish: behavior and histology.</a> Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).</li><li>Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optokinetic+response+in+zebrafish+and+its+applications.">The optokinetic response in zebrafish and its applications.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).</li><li>Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+tuning+by+visual+feedback+of+the+stability+of+a+neural+integrator.">Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).</li><li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurements+of+the+optokinetic+response+in+adult+fish.">Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish.</a> J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).</li><li>Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+vision+revealed+by+a+behavioral+screen+of+400+essential+loci+in+zebrafish.">Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish.</a> J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).</li><li>Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+asymmetries+in+the+optokinetic+response+of+larval+zebrafish.">Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish.</a> Zebrafish. 2, 189-196 (2005).</li><li>Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+arrestin+confers+cone+vision+of+high+temporal+resolution+in+zebrafish+larvae.">Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).</li><li>Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optokinetic+behavior+is+reversed+in+achiasmatic+mutant+zebrafish+larvae.">Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae.</a> Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).</li><li>Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+sensitivity,+spatial+and+temporal+tuning+of+the+larval+zebrafish+optokinetic+response.">Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 .</li><li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+cone+specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone-response+recovery+and+delayed+dark+adaptation.">Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li><li>Roeser, T., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visuomotor+behaviors+in+larval+zebrafish+after+GFP-guided+laser+ablation+of+the+optic+tectum.">Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum.</a> J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).</li><li>Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+mutant+leberkn+del/vam6+resembles+human+multi-systemic+disorders+caused+by+aberrant+trafficking+of+endosomal+vesicles.">The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles.</a> Development. 135, 387-399 (2008).</li><li>Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+mutant+bumper+shows+a+hyperproliferation+of+lens+epithelial+cells+and+fibre+cell+degeneration+leading+to+functional+blindness.">The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness.</a> Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).</li><li>Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. v. o. n., Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+the+pmel17+gene+leads+to+defects+in+melanosome+biogenesis+and+alterations+the+visual+system+in+the+zebrafish+mutant+fading+vision.">A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision.</a> Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).</li></ol>

Oliver DR Schnaedelbach e Holger D. Russig sono dipendenti di TSE Systems GmbH che produce il sistema di monitoraggio del rendimento visivo utilizzato in questo articolo. La produzione di questo articolo è stato sponsorizzato da TSE Systems GmbH. Stephan CF Neuhuass è un dipendente dell&#39;Università di Zurigo, che percepisce una retribuzione da Sistemi TSE per ogni sistema venduto.

L&#39;importanza della OKR per lo studio della funzione visiva è stata riconosciuta dalla comunità scientifica per un lungo periodo (Pasqua e Nicola 1996, 1997), e tenta di quantificare realmente il paradigma hanno iniziato oltre un decennio fa. Pasqua e Nicola (1996) ha sviluppato un sistema motorizzato tamburi rotanti a righe, in cui è stato analizzato il video del movimento degli occhi manualmente. Questo sistema ha sofferto la mancanza di immobilizzazione dell&#39;embrione pesce, che ha richiesto l&#39;uso frequente riposizionamento, e in grado di rilevare i movimenti di tracciamento degli occhi solo con grande difficoltà. Un passo in avanti è stato l&#39;uso di un video-proiettata tamburo a strisce per consentire una maggiore variabile presentazione dello stimolo generato dal computer (Roeser &amp; Baier, 2003. Rinner et al, 2005a). Il prevalentemente manuale, fotogramma per fotogramma analisi delle registrazioni videoregistrate ha dimostrato di essere estremamente laborioso, e in una certa misura ostacolato da osservatore polarizzazione (Beck et al.,2004). Analisi automatizzata in tempo reale è stato suggerito di consentire l&#39;utilizzo di meccanismi comportamentali di apprendimento di feedback (maggiore et al., 2004). L&#39;uso di illuminazione ad infrarossi e stimoli rotanti frequenza controllati è stato sperimentato da Beck et al. (2004). Tuttavia, il sistema descritto non è stato utilizzato solo per le larve, e l&#39;analisi è stata effettuata off-line. Inoltre, il VisioTracker permette il controllo completo stimoli, incluso cambiare lo stimolo durante l&#39;esperimento, consentendo una maggiore flessibilità e spontanea influenza sul corso dell&#39;esperimento. Inoltre, la creazione stimolo digitale utilizzato dal VisioTracker superato i problemi menzionati in precedenza con accelerazione della massa inerte di un tamburo stimolo strisce (Beck et al., 2004). Le larve di ritenuta da metilcellulosa non interferisce in modo significativo con il movimento degli occhi e non ha effetti a lungo termine sugli zebrafish benessere. Larve di pesci sono stati con successomantenuto incorporato in metilcellulosa per diversi giorni, fino ossigeno attraverso la pelle diventa insufficiente per la domanda con l&#39;aumentare dell&#39;età (Qian et al., 2005). I pesci adulti metodo di contenimento è altrettanto facile sull&#39;animale. La breve durata dell&#39;esperimento, accoppiata con la possibilità di scambiare rapidamente l&#39;animale prova per una diversa, aumenta ulteriormente gli aspetti positivi benessere degli animali del sistema. Poiché le branchie sono continuamente lavata con acqua, è conveniente spike l&#39;acqua con qualsiasi prodotto chimico di scelta per studiare l&#39;effetto sui movimenti oculari e prestazioni visive. Analogamente un wash-out esperimento può essere aggiunto senza la necessità di gestire l&#39;animale tra gli esperimenti. Rumore pixel nell&#39;immagine video è stato ridotto al minimo lisciando algoritmi del software VisioTracker proprietario, consentendo misurazioni estremamente precise di posizione degli occhi e la velocità angolare. Inoltre, per facilitare la statistical&#39;analisi, il software filtra i movimenti saccadici che si verificano a velocità fissa e non contribuiscono alla comunicazione sperimentale. Una media di curve di velocità più di 7 fotogrammi video facilitato analisi successive. Il VisioTracker apre una nuova dimensione per molte aree di ricerca diverse. Il sistema ei suoi predecessori sono già stati utilizzati con successo per quantificare la performance visiva in larve di zebrafish, utilizzando parametri come l&#39;acuità visiva, sensibilità al contrasto e adattamento alla luce (Rinner et al., 2005a, Schönthaler et al., 2010), di analisi funzionale del fotorecettori cono dopo la manipolazione dei membri della cascata di trasduzione visivo (ad esempio, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), o l&#39;analisi dei difetti visivi in larve di zebrafish mutanti (ad esempio Schönthaler et al, 2005, 2008;. Bahadori et al., 2006). L&#39;interdipendenza di maturazione morfologica e funzionale del sistema visivoè stato studiato da misurazioni okr per dimostrare che l&#39;acuità visiva è principalmente ma non completamente limitata dalla spaziatura fotorecettore stadi larvali (Haug et al., 2010). Il VisioTracker è ugualmente adatto per analizzare la funzione visiva in zebrafish adulti e altre specie di pesci di dimensioni simili (Mueller e Neuhauß (2010), la presente relazione). È anche concepibile utilizzare il sistema in aree di ricerca come tossicologia o farmacologia quale sostanze da esaminare possono essere aggiunti al flusso dell&#39;acqua che circonda le branchie dei pesci adulti. Inoltre, la versatilità di VisioTracker consente analisi più approfondite, ad esempio di ontogenetics della funzione visiva, la funzione del circuito neurale e lo sviluppo, o sensomotoria di controllo (vedere recensione è in Huang &amp; Neuhauß, 2008).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Metilcellulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> Ethyl 3-amminobenzoato metansolfonato (MS-222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> 35 millimetri piatto di coltura cellulare </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Siero pipetta </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 612 361 </td></tr><tr><td> VisioTracker </td><td> Sistemi di TSE </td><td> 302060 </td></tr></tbody></table>

visiotracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis

Indagini per lo sviluppo del sistema visivo e la funzione richiederà quantificabili modelli comportamentali di prestazioni visive che sono facili da suscitare, robusta e semplice da manipolare. Un modello adatto è stato trovato nella risposta optokinetic (OKR), un comportamento riflessivo presente in tutti i vertebrati dovute al valore di selezione elevato. Il OKR consiste in lenti stimolo-seguenti movimenti di occhi alternati a rapidi movimenti saccadici reset. La misurazione di questo comportamento può essere facilmente effettuata in larve di zebrafish, a causa della sua insorgenza precoce e stabile (pienamente sviluppata dopo 96 ore dopo la fecondazione (HPF)), e beneficia della conoscenza approfondita su zebrafish genetica, per decenni uno dei modelli favorita organismi in questo campo. Nel frattempo, l&#39;analisi dei meccanismi simili a pesci adulti ha acquisito importanza, in particolare per le applicazioni farmacologiche e tossicologiche. Qui descriviamo VisioTracker, completamente automatizzata, ad alta throughput sistema per l&#39;analisi quantitativa delle prestazioni visive. Il sistema è basato su una ricerca svolta nel gruppo del Prof. Stephan Neuhauß ed è stato ri-progettato da sistemi di TSE. Esso consiste in un dispositivo di immobilizzazione per piccoli pesci monitorata da una elevata qualità video camera dotata di un obiettivo ad alta risoluzione zoom. Il contenitore pesce è circondato da uno schermo tamburo, sul quale generate dal computer pattern stimolo può essere proiettata. Movimenti oculari vengono registrati e analizzati automaticamente dal pacchetto software VisioTracker in tempo reale. L&#39;analisi dei dati consente l&#39;immediato riconoscimento di parametri quali la durata fase di lento e veloce, ciclo di frequenze in movimento, lenta fase di guadagno, l&#39;acuità visiva e la sensibilità al contrasto. Risultati tipici permettono ad esempio la rapida identificazione di mutanti sistema visivo che non mostrano alcuna alterazione evidente nella morfologia di tipo selvatico, o la determinazione di effetti quantitativi delle farmacologica o tossici e mutageniagenti sulle prestazioni del sistema visivo.

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VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Il VisioTracker è un sistema automatizzato per l&#39;analisi quantitativa di prestazioni visive dei pesci adulti e larve piccole basa sulla registrazione dei movimenti oculari. È dotato di un controllo completo sulle proprietà stimolo visivo e analisi in tempo reale, consentendo di alto-rendimento di ricerca in settori quali lo sviluppo del sistema visivo e la funzione, farmacologia, studi di circuiti neurali e l&#39;integrazione senso-motoria.

VisioTracker, un approccio innovativo automatizzato di analisi oculomotoria

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

visiotracker-an-innovative-automated-approach-to-oculomotor-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Views.  University of Zurich. Il VisioTracker è un sistema automatizzato per l'analisi quantitativa di prestazioni visive dei pesci adulti e larve piccole basa sulla registrazione dei movimenti oculari. È dotato di un controllo completo sulle proprietà stimolo visivo e analisi in tempo reale, consentendo di alto-rendimento di ricerca in settori quali lo sviluppo del sistema visivo e la funzione, farmacologia, studi di circuiti neurali e l'integrazione senso-motoria.

Video: VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

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Neuroscienze

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and dysfunctional brain.1 However, development of a platform to stimulate and store eye movements can require substantial programming, time and costs. Many systems do not offer the flexibility to program numerous stimuli for a variety of experimental needs. However, the VisualEyes System has a flexible architecture, allowing the operator to choose any background and foreground stimulus, program one or two screens for tandem or opposing eye movements and stimulate the left and right eye independently. This system can significantly reduce the programming development time needed to conduct an oculomotor study. The VisualEyes System will be discussed in three parts: 1) the oculomotor recording device to acquire eye movement responses, 2) the VisualEyes software written in LabView, to generate an array of stimuli and store responses as text files and 3) offline data analysis. Eye movements can be recorded by several types of instrumentation such as: a limbus tracking system, a sclera search coil, or a video image system. Typical eye movement stimuli such as saccadic steps, vergent ramps and vergent steps with the corresponding responses will be shown. In this video report, we demonstrate the flexibility of a system to create numerous visual stimuli and record eye movements that can be utilized by basic scientists and clinicians to study healthy as well as clinical populations.

Neural control and cognitive processes can be studied through eye movements. The VisualEyes software allows an operator to program stimuli on two computer screens independently using a simple, custom scripting language. The system can stimulate tandem eye movements (saccades and smooth pursuit) or opposing eye movements (vergence) or any combination.

VisualEyes: un sistema software modulare per la Sperimentazione oculomotoria

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello sperimentale

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Analisi automatizzata di<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Utilizzando Celest Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Analisi automatizzata di andatura in topi con lesione da costrizione cronica

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Un approccio alternativo per studiare eventi primari nella neurodegenerazione utilizzando fettine di cervello di ratto Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...