Agradecemos ao Dr. Grant Sumida para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por um Investigator Award Beckman Young (SY), uma família Hellman Award Faculdade Novo (SY), um EUREKA NIH, da Universidade da Califórnia Cancer Research Comissão Coordenadora.

1. Geração de linha celular estável (por exemplo, células MDCK) <ol><li> Células em placas a 80-90% confluência em um prato de p35. Não deixe que as células formam 100% monocamada confluente, que irá reduzir a eficiência de transfecção. </li><li> Transfecção as células com o plasmídeo de interesse usando Lipofectamine 2000. Otimizar as condições de transfecção usando o protocolo do fabricante. </li><li> No dia seguinte passagem, as células em duas p150 placas de Petri. O grande prato é recomendada para permitir o espaçamento suficiente entre as colônias estáveis. </li><li> No dia seguinte, altere a mídia e adicionar 500 mg / ml de G418 para cada prato. A concentração de G418 deve ser otimizado para linhagens de células individuais. </li><li> Alterar mídia todos os dias por aproximadamente duas semanas. Após 2 semanas, G418 colônias resistentes deve começar a se formar, e será visível a olho nu. </li><li> Usando um microscópio invertido fluorescentes, identificar colônias GFP positivas. Mark essas colônias na chapa usando uma caneta Sharpie. </li><li> Para seletivamente trypsinize as colônias da placa de cultura de tecidos, aspirar a mídia, e lavar as células duas vezes com PBS ou solução de tripsina. Na segunda lavagem, não aspire para fora toda a solução. Deixe uma fina camada de líquido no fundo do prato para evitar que as células de secagem. </li><li> Para cada colônia marcada: use um cotonete esterilizado para eliminar o mais próximo possível ao redor da borda da colônia. Isto irá criar uma ilha de área molhada contendo a colônia de células. Pipetar 10 mL de tripsina para a colônia. Repita para cada colônia, e proceder rapidamente para evitar a secagem. Um investigador experiente pode pegar normalmente ~ 12 colônias por placa p150. </li><li> Incubar placa a 37 ° C por 5-10 minutos até retirar as células da placa e aparecem rodada. </li><li> Para cada colônia: Pipetar 10 ml de tripsina para a colônia, e pipetar cima e para baixo algumas vezes para retirar as células da placa. Então pipeta todas as células da colônia em um único poço em um prato de 24 também. </li> &lt;li&gt; Depois de colônias estáveis ​​têm crescido, a expressão da proteína de cada colônia é analisada usando western blot padrão e de imunofluorescência. Expandir essas linhas de células para análise posterior. </li></ol> 2. Modificação da superfície do prato fundo de vidro para a ligação de colágeno ideal (Opcional) <ol><li> Para o vidro silanizadas, pipetar 300 mL de solução de 2% 3-Aminopropyltrimethoxysilane sobre a parcela de vidro de cada prato p35 com uma abertura 10 mm. Veja a Figura 1 para a silanização e cross-linking esquemático. 3-Aminopropyltrimethoxysilane é diluído em água filtrada. </li><li> Incubar por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Aspirar a solução de 3-Aminopropyltrimethoxysilane e lavar com água filtrada três vezes durante 10 minutos cada. </li><li> Aspirar a pratos de água e coloque na chapa quente ajustada para 50 ° C por 1,5 horas. Tops lugar de pratos um pouco fora do prato, para que a umidade no prato pode escapar. </li><li> Retire os pratos do fogo e deixe a cool. </li><li> Pipetar 300 mL da solução de glutaraldeído a 2% sobre a parcela de vidro de cada prato. O glutaraldeído é diluído em PBS. </li><li> Incubar por 1 hora. </li><li> Aspirar a solução de glutaraldeído e lavar pratos com PBS três vezes durante 10 minutos cada. </li><li> Esterilizar os pratos com a exposição à luz UV durante 1 hora. Os pratos silanizadas podem ser armazenados em temperatura ambiente. </li></ol> 3. Preparação de gel de colágeno 3D com partículas de traçador <ol><li> Lavar partículas traçador fluorescente para baixo, girando 100 l de partículas de ações marcador (10 10 partículas / ml) em uma centrífuga a 15.000 rpm por 5 minutos, aspirar líquido para fora, e adicionar 500 mL de mídia. Repita 5 vezes. Depois última lavagem, as partículas de ressuspender em 30 mL de mídia. </li><li> Trypsinize células GFP expressar como de costume. </li><li> Ressuspender pellet celular a aproximadamente 2 x 10 6 células / ml. </li><li> Pipetar 240 mL de meio de crescimento em um tubo eppendorf. </li><li> Adicionar 12,6 mL de Hepes 1M, 20 l de água filtrada, 50 ml de solução de células, então 10 ml de partículas fluorescentes. </li><li> Por fim, adicionar 167 mL de colágeno da derme bovina Eu solução (para obter uma concentração de trabalho de 1 mg / ml). </li><li> Misturar a solução completa, então pipeta 80 mL da solução para a parte de vidro do prato de vidro silanizadas fundo. </li><li> Prato coloque em incubadora e permitir que o gel para polimerizar a 37 ° C por 30 minutos. Figura 1A para ver gel de colágeno típica em um prato fundo de vidro p35. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de crescimento com cuidado para cada prato. </li></ol> 4. Procedimento para lapso de tempo de aquisição de imagem <ol><li> Ligue o controle de temperatura do recinto microscópio e deixar a câmara de escopo atingir a uma temperatura em estado estacionário, 37 ° C. Veja a Figura 2 para um exemplo de live-célula do sistema de imagem. </li><li> Mudança de mídia para a nova mídia suplementado com 25 mM Hepes para manter um pH neutro. ParaDIC de imagens, troca a parte superior do prato com um que tem um tampo de vidro. Usando uma fina tira de parafilme, cobrir o lado do prato para evitar a evaporação da mídia. </li><li> Para um objetivo de imersão em óleo, coloque uma gota de fluido de imersão sobre o objectivo. </li><li> Coloque o gel de colágeno contendo prato no palco microscópio, e certifique-se o prato faz contato com o líquido de imersão. </li><li> O foco da amostra e busca de células de interesse para a imagem. Para minimizar oscilações estágio, permita prato que se contentar com cerca de 45 minutos antes de iniciar uma captura muito tempo. </li><li> Especificar os parâmetros de aquisição de imagem. Minimizar a exposição a laser, o que poderia danificar as células, pelo poder do laser modulando o, tempo de exposição, freqüência e duração do tempo de captura. Os parâmetros reais podem variar com o sistema de microscópio e tipo de célula. </li><li> Durante a aquisição de lapso de tempo, um inibidor pode ser adicionado. Para o experimento além inibidor, não selar o prato com parafilme. <ol><li> Preparaçãosão complementados Hepes mídia com droga em uma concentração de trabalho desejada. </li><li> Quando estiver pronto para adicionar drogas para a mídia, fazer uma pausa na captura de imagem, e remova cuidadosamente o topo prato sem perturbar o prato. </li><li> Aspirar a mídia no prato, e pipetar a droga contendo mídia no prato. Então, substitua cuidadosamente a parte superior do prato. </li><li> A amostra pode estar fora de foco devido à adição de novas mídias, reajustar o foco. </li><li> Reiniciar a captura, em seguida, monitorar a captura para os próximos 30 minutos, e reajustar o foco, se necessário. Veja a Figura 4 para um exemplo de experimento além de drogas. </li></ol></li></ol> 5. Procedimento FRAP e análise <ol><li> A configuração FRAP varia entre os sistemas, siga as instruções do fabricante. </li><li> Configurar parâmetros para live-célula de imagem. </li><li> Configurar parâmetros para fotobranqueamento. Use a potência do laser suficiente para photobleach o sinal fluorescente sem danificar a célula. Testar essas partro diâmetros em células prática. </li><li> Iniciar a captura de imagem, e permitir que pelo menos 5 quadros de captura de imagem antes de fotodegradação da região de interesse. </li><li> Continue a captura, e tempo de recuperação deve ser suficiente para capturar a recuperação completa de fluorescência. Ver Figura 5 para um exemplo de experimento FRAP. </li><li> Analisar a recuperação de fluorescência através da medição da intensidade média de fluorescência da área de Foto-descoloração (antes e depois fotobranqueamento) ao longo do tempo. Usando um software de análise estatística (por exemplo, Excel), o traçado da curva de recuperação para a equação exponencial: I = I f (1-e-kt), onde I é a intensidade, eu f é a intensidade final, t é o tempo, e τ ½ é o tempo que leva para a intensidade para chegar a metade do valor final: ½ τ = ln (2) / k. O meio-tempo é uma medida da taxa de mobilidade da proteína. </li><li> Obter os parâmetros, metade do tempo e intensidade final da curva exponencial-fit. Calcule ªe fração móvel, tendo a razão entre o final de intensidades de fluorescência inicial. </li></ol> 6. Resultados representante Um exemplo da imagem ao vivo de células saudáveis ​​de células epiteliais dentro da matriz é mostrada na Figura 3. Células saudáveis ​​apresentam uma membrana lisa, contínua, e núcleo distinto, enquanto que as células saudáveis, muitas vezes têm uma membrana interrompido, e um número excessivo de vacúolos. Em uma matriz 3D, única células epiteliais migram 1, e ao longo de vários dias, as células epiteliais forma tridimensional, esférico, multi-celular cistos dentro da matriz 2. As células também são altamente dinâmicos e migrar dentro do cisto (Figura 3). A deformação da matriz, como resultado das forças de tração exercida pelas células de migrar é analisado através do deslocamento de partículas tracer incorporados na matriz circundante (Figura 4). Os movimentos das partículas tracer são exibidos como uma imagem de projeção máxima de diferentesrentes pontos de tempo, e cada momento é pseudo-coloridos para indicar o tempo (Figura 4B). Alternativamente, as imagens de uma partícula tracer individuais são exibidos como uma montagem para mostrar o movimento da partícula traçador ao longo do tempo (Figura 4C). Toda a análise de imagem foi feita usando ImageJ. Estas avaliações qualitativas da deformação da matriz e, portanto, as forças exercidas por células migratórias, são primeira aproximação útil de distribuição de força de tração. A estimativa quantitativa das forças de tração exercida pelas células migram em 3D está fora do âmbito deste protocolo e é descrito em outros lugares 3,4. A recuperação típica fluorescência após fotobranqueamento experimento é mostrado na Figura 5. A região de interesse deve ser Foto-descoloração usando as configurações de laser otimizado para que a intensidade de fluorescência está visivelmente diminuída em relação aos níveis de fundo (para maximizar a relação sinal-ruído), mantendo as células saudáveis ​​e sem danos. A configuração ideal deve be determinada empiricamente como cada configuração FRAP é diferente (por exemplo, FRAP sistema usando laser de varredura confocal). A exposição eo intervalo de tempo de pós-FRAP aquisição da imagem deve ser cuidadosamente controlada para evitar a fotodegradação de fundo. O uso de menor poder laser, curto tempo de exposição, bem como a utilização de câmera sensível e de alta óptica eficientes são essenciais para imagens de alta qualidade FRAP. Se a fluorescência de branqueamento durante a aquisição da imagem é significativa, esta sumindo de fundo devem ser quantificados e normalizados a partir da recuperação de intensidade de fluorescência observada. Devido à natureza do ambiente 3D, o z-componente de recuperação de intensidade de fluorescência pode se tornar significativo. Portanto, é importante definir um volume de Foto-descoloração tomando pré e pós-stack imagens 3D da região Foto-descoloração. Posterior análise e modelagem de recuperação de fluorescência é discutido em outros lugares 5,6. A combinação única de live-célula de imagem techniques: GFP para acompanhar a dinâmica das proteínas do citoesqueleto, vermelho partículas de fluorescência marcador para monitorar a deformação da matriz, e da adição de inibidores, podem ser usados ​​simultaneamente para a análise da dinâmica de proteínas, força de tração e vias moleculares. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> Figura 1. Preparação de gel de colágeno. A) matriz de colágeno polimerizado em um prato fundo de vidro. A cor rosa do gel é devido a partículas fluorescentes embutidas. B) Procedimento para tratar os pratos com fundo de vidro para crosslink o gel de colágeno para a superfície de vidro. Primeiro, o prato fundo de vidro é tratado com 3-Aminopropyltrimethoxysilane solução, então a solução de glutaraldeído que ligações cruzadas da matriz de colágeno para o vidro. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> Figura 2. Schematics de confocal / FRAP configuração microscópio. O confocalmicroscópio é baseado em uma AxioObserver Zeiss com uma HQ II CoolSnap câmera CCD e completamente automatizado por Slidebook software (Intelligent Innovations Imaging). A unidade é confocal personalizados e com base na Yokogawa unidade de disco giratório CSU10 e dois lasers de estado sólido (488 nm com 50 mW e 561 nm com 40 mW) com filtro acústico-óptico (AOTF) para permitir a comutação entre dois milissegundos lasers. Os filtros de emissão são nm 525/50 e 620/60 nm (# 118661 e # 118085, Tecnologia Chroma) e espelho dicróico é 488-568 banda BrightLine Dual (Semrock). Os objetivos são uma longa distância de trabalho objetivo C Apochromat-40x com NA 1.1 e distância de trabalho de 0,62 mm, e um objetivo Plano Apochromat-63x com NA 1.4 e uma distância de trabalho de 0,19 mm. O microscópio também inclui um sistema de fotoablação FRAP que consiste em uma fibra óptica de corante bombeado por laser, um computador posição feixe controlado e intensidade, e um tamanho de ponto de difração limitada. Além disso, o microscópio é equipado comxy um estágio motorizado que inclui 0,1 micron encoders lineares em cada eixo. Durante a criação de imagens de lapso de tempo, a temperatura ambiente é mantida por uma câmara de microscópio personalizados e um aquecedor com um controle de temperatura feedback. Para isolar qualquer ruído e vibração, o sistema de microscópio inteira está em uma vibração livre de mesa. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> Figura 3. Vivo imagens de células de células epiteliais expressando GFP-actina. Essas células formam um cisto após 4 dias de cultura em uma matriz de colágeno 3D. Algumas células se movem ao longo da superfície de cisto (seta amarela), enquanto outros migram no interior do cisto (seta vermelha). Barra de escala 10 mM, o tempo em horas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> Figura 4. O efeito de inibição da Rho-quinase na força de tração. A) imagem DIC de uma célula migrar MDCK expressar GFP tag marcador nuclear. A imagem foi tomada imediatamente antes do tratamento de Rho-quinase inibidor Y-27632. Barra de escala 10 mM. B) o deslocamento de partículas resultantes da adição de Y-27632. As posições das partículas em várias alturas (0 - 52 min) foram pseudo-colorido de acordo com a escala de intensidade, então projetada em uma única imagem. A região branca é o núcleo GFP positivos nas células migratórias. Barra de escala 10 mM. Tempo em minutos. C) O movimento de partículas no bordo de fuga da célula (ver seta em B). Asterisco representa o último frame capturado antes de Y-27632 adição. A partícula tracer se moveu em direção e para longe da borda posterior da célula migrar antes e após a adição de Y-27632, respectivamente. Barra de escala 1 mícron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> Figura 5. FRAP análise de GFP-actina expressando a migração de células em uma matriz tridimensional. A) imagens Timelapse do GFP-actina expressar célula de antes e depois da fotodegradação. Uma pequena região do GFP-actina acumulada na parte traseira de células foi Foto-descoloração (vermelho ponta de seta) em timepoint 0. Tempo em segundos, a escala de barras 5 mm. B) A intensidade média de fluorescência da região Foto-descoloração (linha cheia), eo ajuste exponencial da recuperação de fluorescência (círculos) desenhados ao longo do tempo. A intensidade de fluorescência foi normalizada para o valor inicial antes de fotodegradação.

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	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui nós descrevemos um método para usar live-célula de imagem para estudar os mecanismos de migração celular em uma matriz tridimensional. O sucesso desta técnica depende da obtenção de &quot;bom&quot; clones estavelmente expressando proteínas GFP. O baixo nível de proteínas GFP requer uma exposição de excitação excessiva que compromete a saúde das células, enquanto o nível GFP muito alto vai ter efeitos colaterais indesejáveis ​​na célula. Assim, a escolha do vetor de transfecção genes em cé...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Colágeno, bovina, tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Estoque é cerca de 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Diluída em água </td></tr><tr><td> glutaraldeído </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Diluir em PBS </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Poliestireno Fluospheres microesferas 1 mícron, fluorescência vermelha (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Componentes da cultura da mídia: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Canamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Tradicionalmente, a migração celular foi estudada em duas dimensões, superfícies de plástico duro. No entanto, durante processos biológicos importantes, tais como a cicatrização da ferida, regeneração de tecidos, e metástase de câncer, as células devem navegar através de complexas, tecido tridimensional extracelular. Para compreender melhor os mecanismos por trás desses processos biológicos, é importante examinar os papéis das proteínas responsáveis ​​por dirigir a migração celular. Aqui, descrevemos um protocolo para estudar os mecanismos de migração celular usando a linha de células epiteliais (MDCK), e uma imagem tridimensional, fibroso, matriz auto-polimerização como um sistema modelo. Esta matriz extracelular opticamente clara se adequa facilmente aos estudos em células vivas, de imagem e melhor imita o fisiológico, meio ambiente dos tecidos moles. Este relatório demonstra uma técnica para a visualização direta localização de proteínas e dinâmica, e deformação das imediações matriz tridimensional. Exameminação da localização de proteínas e dinâmica durante processos celulares fornece uma visão fundamental em funções da proteína. Geneticamente codificado marcas fluorescentes fornecem um método único para a observação de localização de proteínas e dinâmica. Usando esta técnica, podemos analisar o acúmulo subcelulares de-chave, a força de geração de componentes do citoesqueleto em tempo real como as manobras de células através da matriz. Além disso, utilizando várias marcas fluorescentes com diferentes comprimentos de onda, podemos examinar a localização de proteínas simultaneamente, permitindo-nos testar, por exemplo, se diferentes proteínas têm funções semelhantes ou divergentes. Além disso, a dinâmica das proteínas fluorescentes marcados pode ser quantificada usando a Recuperação Após Fotodegradação Fluorescente (FRAP) análise. Esta ensaios de medição da mobilidade de proteínas e como forma estável as proteínas são vinculados à rede do citoesqueleto. Ao combinar live-célula de imagem com o tratamento dos inibidores da função da proteína,podemos examinar em tempo real as mudanças na distribuição de proteínas e morfologia das células migrando. Além disso, nós também combinar live-célula de imagem com o uso de partículas fluorescentes tracer incorporados dentro da matriz para visualizar a deformação da matriz durante a migração celular. Assim, podemos visualizar como uma célula migrar distribui força de geração de proteínas, e onde as forças de tração são exercidos com a matriz circundante. Através destas técnicas, podemos obter informações valiosas sobre os papéis de proteínas específicas e suas contribuições para os mecanismos de migração celular.

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Processos celulares, tais como a migração das células têm sido tradicionalmente estudados em duas dimensões, superfícies de plástico duro. Este relatório descreve uma técnica para a visualização direta localização de proteínas e análise dinâmica de proteínas em células migrando de uma forma mais fisiologicamente relevantes, matriz tridimensional.

Em células vivas, imagens de células que expressam proteínas fluorescentes Migrando-marcado em uma matriz tridimensional

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K visualizações.  University of California, Davis. Processos celulares, tais como a migração das células têm sido tradicionalmente estudados em duas dimensões, superfícies de plástico duro. Este relatório descreve uma técnica para a visualização direta localização de proteínas e análise dinâmica de proteínas em células migrando de uma forma mais fisiologicamente relevantes, matriz tridimensional.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bioengenharia

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impressão de planar e tridimensional de tintas condutoras

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal de mão tridimensional Optoacoustic imagem Sonda para Deep Tissue Angiografia Humano e Estudos pré-clínicos funcionais em Tempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...