Os autores reconhecem o financiamento do Australian Research Council e National Health and Medical Research Council da Austrália, e também gostaria de agradecer a Australian instalação de fabricação nacional para o SU-8 mestre para a impressão microcontact. SHN é apoiado pelo Ministério do Ensino Superior Malásia e Sains Universiti Malaysia.

1. Passivação de lamínulas com PLL-PEG-biotina Este passo é projetado para passivar a superfície para que as células aderem e migram para regiões específicas na lamela de vidro que são criados com a impressão microcontract (Passo 2-3a) ou mergulho litografia caneta (Passo 3b). Para a passivação, um co-polímero de poli-L-lisina (PLL) e polietileno glicol (PEG) é usado em que 20% das moléculas de PEG são enxertados com biotina (PLL-PEG-biotina). <ol><li> Para limpar lamelas de vidro (18 mm x 18 mm), submergindo-os em uma cremalheira em etanol a 100% e colocar o suporte de um banho de sonicação durante 30 min. Secam-se as lamelas de vidro em ar ou sob uma corrente de azoto. </li><li> Em seguida, sonicar as lamelas de vidro durante 30 min em 1 M NaOH. Depois enxaguar as superfícies de vidro por imersão cuidadosamente o suporte em um recipiente cheio com 1,5 L Milli-Q H 2 O. Repetir o processo de lavagem três vezes com água Milli-Q fresco H 2 O a cada vez. Secam-se as lamelas de vidro emnum forno a 60 ° C. </li><li> Coloque metade o vidro limpo Lamelas individualmente numa câmara húmida, a qual é feita de uma placa de 24 cavidades parcialmente cheio com H 2 O. Gota 15 ul de PEG-PLL-biotina (1 mg / ml) em PBS em cada lamela de vidro. Levar a outra metade dos restantes lamelas de vidro limpo e cuidadosamente sanduíche a solução PEG. Deixar as lamelas durante 1 hora na câmara húmida. Deslize suavemente as lamelas ensanduichada longe um do outro sem raspar a superfície de PEG-revestido e lavá-los com água Milli-Q H 2 O. A água deve deslizar facilmente sobre o lado PEG-tratada. Se necessário, o ar de secagem as lamelas de vidro sobre uma toalha de papel com a superfície tratada para cima. Armazenar as lamelas de vidro num exsicador de vácuo até à sua utilização. </li></ol> 2. Fabricação de carimbos para impressão microcontact Descrevemos dois processos para faixas estreptavidina padrão para as lamínulas passivadas. O primeiro, microcontact impressão, tipicamente requer a fabricação de um mestre de silício a partir do qual um carimbo de PDMS é moldado. No nosso caso, o padrão sobre o selo PDMS são 100 mm de largura, as linhas que estão espaçados 290 uM de centro-a-centro, com uma altura característica de 25 um. Abaixo, descrevemos resumidamente como fabricar um mestre silício adequado (Passo 2,1-2,3) e PDMS selo (Passo 2.4). No entanto, existem vários protocolos para a impressão microcontact descritos na literatura 19-23, que são adequados para a impressão de padrões de proteínas sobre lamelas de vidro. Mestres também podem ser feitas sob encomenda e adquirido a partir de fontes comerciais. <ol><li> Em primeiro lugar, limpar a bolacha de silício (4 &quot;de diâmetro) através da incubação em solução piranha (3:1 v: v de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio a 30%). Durante 20 minutos Lavar cuidadosamente a bolacha 10 vezes com H 2 O. MilliQ Seca-se a bolacha em um forno a 150 ° CO / N. </li><li> Enxaguar a bolacha de silício limpo e seco com acetona a 100%, seguido de 100% de álcool isopropílico. Próximospin-coat-2 ml de GM1070 SU-8 fotoresistente (Gersteltec Sarl) sobre a bolacha em 3100 rpm durante 40 segundos para criar uma camada de 25 ^ M de espessura. A amostra é depois cozido numa placa quente a 65 ° C durante 5 minutos seguido por mais 5 min a 95 ° C. </li><li> Expor o material fotoresistivo SU-8 à luz UV durante 60 segundos sob uma fotomáscara com o padrão desejado (por exemplo, usando uma máscara alinhador Quintel Q6000) e repetir o processo de cozimento descrever em 2.2. Em seguida, a amostra é desenvolvido por imersão da bolacha em SU-8 revelador (Gersteltec Sarl) durante 4 minutos, lavadas em 100% de álcool isopropílico e secou-se sob um fluxo de azoto. A área do fotorresiste SU-8, que não foi exposta à luz UV é assim removido, criando o padrão inverso do carimbo de PDMS. </li><li> O próximo passo é para lançar um selo PDMS do mestre de silício. Em primeiro lugar, misturar 1 parte (w / w) do agente de cura com 10 partes de pré-polímero de elastómero (Sylgard 184). Para remover quaisquer bolhas de ar, desgaseifica-se a mistura num exsicador ligado a uma linha de vácuodurante 1 h. Em seguida, despejar o elastómero PDMS sobre o mestre de silicone dentro de uma placa de Petri com cerca de 1 cm de altura e curar a mistura principal e PDMS, em um forno a 70 ° C durante 1 h. Finalmente, o selo PDMS é removido do mestre de silício e cortadas à medida. </li></ol> 3. Estreptavidina padronização ou Cues adesivas em lamínulas PASSIVATED Depois de passivação lamínulas, padrões de proteínas são impressos com impressão microcontact (3a Etapa) ou dip-pen litografia (Passo 3b). No nosso caso, a estreptavidina é impresso como linhas, que formam a base para gradientes de RGD (Passo 4). O mesmo procedimento pode também ser utilizado para a impressão de proteínas da matriz para criar padrões de adesivo. Um método alternativo para a impressão microcontact para a modelação de biomoléculas sobre superfícies é dip litografia caneta. Na litografia dip caneta, um cantilever é usado para transferir um pequeno volume de solução sobre a superfície. O tamanho das consolas, viscosidade da solução, o tempo de contacto do cantilever sobre a superfície, a hidrofobicidade da superfície, e a humidade na câmara de impressão determinar o tamanho dos elementos impressos. A vantagem deste método é que os padrões diferentes podem ser impressos, para cada experiência, como não há necessidade de fabricar mestres e selos. A desvantagem é que demora mais tempo para imprimir um determinado padrão e que a litografia de imersão pena requer um instrumento especializado que pode não estar disponível em muitos laboratórios. O mergulho instrumento litografia caneta que usamos foi o NanoeNabler de Bioforce Nanociência. Aqui, é impresso pequenos pontos que eram &lt;10 um de diâmetro, para o qual foi utilizado Spt10 consolas. 3a. Microcontact Técnica de impressão (μCP) <ol><li> Para limpar e fazer o selo PDMS mais hidrofílica, o tratamento do lado modelado dos selos PDMS numa UV e ozono (por exemplo, a partir de Procleaner Ozone UV Bioforce Nanociência) durante 1,5 h. Em alternativa, utilizar um plasmaproduto de limpeza para um tempo mais curto para o mesmo fim. Este processo cria uma superfície oxidada PDMS 24, o que melhora o processo de impressão. </li><li> Imediatamente após o tratamento com ozono ou plasma, o lugar e espalhar 10 uL de estreptavidina (1 mg / ml em PBS) para os carimbos de PDMS e deixar durante 1 hora numa câmara húmida (tal como um parcialmente cheio placa de 6 poços, ver Passo 1.3) . Se as faixas devem ser visíveis ao microscópio de fluorescência, utilizar estreptavidina que é conjugado com um fluoróforo tal como estreptavidina-AlexaFluor350. </li><li> Remover o excesso de estreptavidina o selo com papel de seda e secar o selo durante aproximadamente 1 min. Pressionar ligeiramente o selo para a lamela de vidro PLL-PEG-biotina-revestido. </li><li> Se fluorescente estreptavidina foi usado em 3.a2 etapa, examine o padrão utilizando sob um microscópio de epifluorescência. Armazenar as superfícies impressas em um dessecador. </li></ol> 3b. Dip litografia da pena <ol><li> Em primeiro lugar, misturar 1 parte de 1 mg / ml de estreptavidina ou streptavidin-AlexaFluor350 com 10 partes de glicerol (v / v) e 5 ul de carregar a mistura para o cantilever. Em seguida, começa o processo de impressão, tal como descrito no manual de instruções do instrumento de litografia dip caneta. Para reduzir o tamanho da mancha de cerca de 5 um, ajustar a velocidade de impressão, o tempo de contacto do cantilever com a distância da superfície ou vertical do cantilever para a superfície. No exemplo mostrado na Figura 2c, os pontos foram impressos numa linha com linha e coluna de separação definida para 10-15 ^ m. Esta distância é suficiente para impedir que os pontos de fusão em si, mas permite a visualização de pontos múltiplos num único campo de visão do microscópio, com a maioria das configurações. </li><li> Armazenar as superfícies impressas em um dessecador. </li></ol> 4. Criando Gradientes adesivo na Estreptavidina padrão-Superfícies Nós criar gradientes adesivas de biotina-RGD em lamelas de vidro que são revestidas com estreptavidina (Figura 3) ou copadrões ntain estreptavidina sobre lamelas de vidro passivado (Figura 5). Para criar um gradiente de superfície, foi utilizado um dispositivo comercialmente disponível de microfluidos (chamado pegajoso Slide-A quimiotaxia de Ibidi 3D) que cria um gradiente de solução estável por difusão passiva. Para competir por sítios de ligação de estreptavidina, foram empregados dois gradientes opostos de biotina-RGD e biotina que não foi conjugada com RGD (ver Figura 1). <ol><li> Respeite as lamelas de vidro revestidas com estreptavidina ou com estampas para o lado adesivo do dispositivo Quimiotaxia Slide-pegajoso 3D. Para assegurar que não haja qualquer perda durante várias horas, as extremidades do dispositivo são selados com uma camada fina de vaselina aquecido e com uma segunda camada de uma mistura de 1 parte de vaselina para 1 parte de cera de parafina (w / w). </li><li> Encher o canal do dispositivo com 6 ul de PBS no canal. Em seguida, encher os dois reservatórios com 70 ul de 0,03 ug / uL biotina-4-fluoresceína em PBS e 70 &amp; mu, l de 0,03 ug / uL biotina-RGD em PBS, respectivamente. Incubar as amostras à temperatura ambiente no escuro durante 1 hora. </li><li> Remover a solução de biotina e lavar cuidadosamente a superfície, enquanto ainda está ligado ao dispositivo de microfluidos por duas vezes com PBS. Marcar o sentido do gradiente de adesivo e, se necessário, o dispositivo de armazenamento cheio com PBS a 4 ° C para assegurar que, mas o dispositivo não seque. Se necessário, analisam o gradiente de adesivo com um microscópio fluorescente. </li></ol> 5. Rotulagem de células com fluoróforos para imagens de células vivas As células são marcadas com corantes fluorescentes que auxiliam rastreamento de células sob um microscópio fluorescente. Sondas comuns são marcadores fluorescentes organelas, tais Syto 64 Vermelha, que rotula o núcleo da célula. Para fazer isso, as células são em primeiro lugar lavou-se três vezes com PBS, depois incubadas com 1 uM Syto Red 64 em meios de cultura durante 45 min e, finalmente, lavada mais três vezes com PBS. Por favor, note que as células não deve sermantidas em PBS por períodos de tempo longos. Corantes alternativos para rastreamento de celular são séries CellTracker que manchar o citoplasma e são mantidas durante a migração e divisão celular. A transfecção de células com a proteína de fusão fluorescente é particularmente útil para registar a distribuição subcelular de uma proteína de interesse, durante a migração. No entanto, as proteínas fluorescentes tipicamente foto-branqueamento mais rápidos do que os corantes orgânicos de modo que as observações a longo prazo pode não ser possível. 6. Carregamento de células com um Gradiente solúvel no dispositivo Microf <ol><li> Contar células marcadas por fluorescência e dividida em dois tubos de números de células iguais. Lavar e ressuspender um tubo de células com meio contendo a chemoattractant, tais como a modificação de Dulbecco, glicose baixa Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Lavar e ressuspender o outro tubo de células em meio sem o quimioatractor, isto é DMEM com 0% de FBS. A concentração finalde células de cada tubo deve ser de 5 x 10 5 células / ml. </li><li> Remova todas as soluções do dispositivo micro (do passo 4.3) e colocá-lo no palco microscópio (veja Passo 7). Carregar 70 uL de células (5 x 10 5 células / ml em DMEM FBS 0%) em um reservatório e de 70 ul de células HeLa (5 x 10 5 células / ml em DMEM 10% FBS) no outro. Frouxamente colocar uma fita sobre os reservatórios, para evitar evaporação. Se as células na superfície são pré-incubados antes da imagiologia, é aconselhável que as células são carregadas no dispositivo de meio de crescimento sem o gradiente. O dispositivo é então colocado sobre a platina do microscópio e os meios de comunicação substituído com gradiente meios ie DMEM sem FBS em um reservatório e DMEM com FBS a 10% na outra. </li></ol> 7. Viver imagens de células e Análise de Dados <ol><li> Ligue o microscópio (Nikon Ti-E) e aquecer a fase de pelo menos 1 hora antes de começar a experiência. </li><li> Certifique-se de que o canal do microfluidic dispositivo está no campo de visão e as células estão no foco. Selecione o parâmetro de aquisição de imagem, tais como o tempo de exposição e filtros fluorescentes, seqüência de imagem de campo claro e fluorescência que captura células e faixas, bem como pontos de tempo e tempo de gravação (por exemplo, a cada 15 minutos para 16 horas). </li><li> Analisar os dados com softwares apropriados, como ImageJ manual de Rastreamento ou Quimiotaxia Ibidi e ferramenta de migração. </li></ol>

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Nós não temos interesses comerciais para divulgar.

Neste protocolo, foi utilizado um dispositivo disponível comercialmente microfluídicos (sticky Slide-Quimiotaxia 3D a partir de Ibidi) para estudar os efeitos de superfícies quimicamente modificados e gradientes quimioatratantes sobre a migração celular. Esta instalação não requer microfluídico porque o gradiente de fluxo é estabelecido por difusão ao longo do comprimento do canal. Isto é importante porque o fluxo poderia afectar diferencialmente células migram lentamente, tais como fibroblastos,...

Migração dirigida de células é uma propriedade fundamental de muitas células e é um aspecto-chave de muitos processos fisiológicos normais, incluindo o desenvolvimento embrionário, a defesa contra a infecção e cicatrização de feridas. Além disso, a migração de células também desempenha um papel importante em várias doenças tais como a doença vascular, metástase de células tumorais e de 1,2 a inflamação crónica. Embora os estados clássicos da migração das células - polarização, extensão saliência, a formação de aderência, a geração de forças de retracção e de trás - são geralmente aceites 3,4, a elucidação dos mecanismos de espaço-temporais, que por integração do sinal é coordenado tem sido mais difícil. A matriz extracelular (ECM), que serve como um substrato para a adesão celular, e através de química inerente 5 e 6 diversidade física, fornece indicações direccionais para navegação célula 7,8. Além destas pistas adesivas 9, factores solúveis 10-12 &lt;/ Sup&gt;, como quimiocinas e fatores de crescimento pode induzir a migração de células por meio de receptores dirigido quimioatratantes e sua sinalização a jusante motogenic. Actualmente, não se sabe se o acoplamento e a sinalização através de receptores de adesão (integrinas, por exemplo) ou de receptores quimiotáticas, tais como receptor da tirosina quinase (RTK), são dominantes. Também não é conhecido se as hierarquias de sistemas receptores são específicos do tipo de célula. Microscopia de células vivas dá uma riqueza de informações que não é acessível em ensaios a granel e pode ser combinado com dispositivos microfluídicos para gerar gradientes de imobilizados pistas 13,14 e solúvel 15 16. O método descrito aqui utiliza uma série de passos simples e bem estabelecida para a modificação de superfície em conjunto com uma câmara comercialmente disponível microfluídico para criar uma imagem de ensaio para a migração de células que podem ser facilmente implementados em um laboratório de biologia das células (Figura 1). O montadodispositivo micro tem qualidades ópticas que são comparáveis ​​aos do vidro 17 e os gradientes de moléculas difusíveis são estáveis ​​durante pelo menos 16 horas. O sistema pode ser usado para as técnicas de microscopia de epifluorescência e avançado. Ao contrário de outras configurações de quimiotaxia 18, este sistema é adequado para a gravação lentamente migram, as células aderentes. É importante notar que o sistema é modular e facilmente permite a introdução de adesivo alternativa ou pistas de migração solúveis e análise de vários tipos de células.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverglass staining outfits</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>8542 E40</td>
 <td>Coverslip rack</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oven</td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td>ED 53 series</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon wafer</td>
 <td>Silicon Quest</td>
 <td>708-007</td>
 <td>Boron doped &lt;100&gt; wafer, 4" diameter, 500 &mu;m, single side polished</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM1070 SU-8 photoresist</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 developer</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 curing agent</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 elastomer prepolymer</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLL-PEG-biotin (20%)</td>
 <td>SuSos AG</td>
 <td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>46955</td>
 <td>1 mM in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-AlexaFluor350</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S-11249</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-4-fluorescein</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B-1370</td>
 <td>0.03 &mu;g/&mu;l in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-RGD</td>
 <td>GenScript</td>
 <td>SC1208</td>
 <td>0.03 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto 64 Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td> S-11346 </td>
 <td>1 &mu;M in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sticky slide chemotaxis 3D</td>
 <td>Ibidi</td>
 <td>80328</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l Greiner yellow bevelled tip</td>
 <td>Greiner Bio-One</td>
 <td>739261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaseline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>16415</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin wax, mp 55-57 &deg;C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>327204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nano eNabler 10 &mu;m cantilever </td>
 <td>BioForce</td>
 <td>SPT-S-C-10s</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J software</td>
 <td>National Institute of Health</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Tracking plugin</td>
 <td>Fabrice Cordeli&egrave;res</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis and Migration Tool</td>
 <td>Ibidi GmbH</td>
 <td></td>
 <td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy

As células podem detectar e migram para as concentrações mais elevadas de pistas adesivas, tais como as glicoproteínas da matriz extracelular e as pistas solúveis, tais como factores de crescimento. Aqui, descrevem um método para criar gradientes opostos de pistas adesivas e solúvel em uma câmara de microfluidos, que é compatível com imagens de células vivas. Um copolímero de ácido poli-L-lisina e o polietileno glicol (PEG-PLL) é empregada para passivar lamelas de vidro e prevenir a adsorção não especifica de biomoléculas e células. Microcontact impressão seguinte, ou litografia dip caneta são usados ​​para criar as faixas de estreptavidina nas superfícies passivadas para servir como pontos de fixação para o péptido biotinilado arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) como a pista adesiva. Um dispositivo de microfluidos é colocada sobre a superfície modificada e usados ​​para criar o gradiente de pistas adesivas (100% RGD a RGD 0%) nas faixas de estreptavidina. Finalmente, o mesmo dispositivo de microfluidos é usado para criar um gradiente de uma suc chemoattractanth como soro fetal bovino (FBS), como o cue solúvel na direcção oposta do gradiente de pistas adesivas.

Para compreender como a célula de integrar os sinais migratórios 25, foi desenvolvido um método para células de imagem com a microscopia de fluorescência, que migram em um ambiente com concorrentes gradientes adesivas e solúvel (Figura 1). Faixas adesivas que continham estreptavidina fluorescente e RGD biotinilado foram criados com faixas microcontact impressos e mergulho litografia caneta (Figura 2). Impressão microcontact sucesso é indicado pela linha de perfil de i...

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Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K visualizações.  The University of New South Wales. Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.

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Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

Inserção de Flexible Neural Sondas Usando Reforços rígidos anexados com Biodissolvable Adhesive

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Bioengenharia

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...