O método é baseado em software livre para avaliar sistematicamente as atividades motoras locais para o comportamento de rastreamento de moscas adultas e larvas a partir de vídeo gravado. Este método requer integração de dispositivos de baixo custo para registrar e analisar o comportamento, tornando-se uma abordagem acessível e eficaz para o rastreamento da locomoção de moscas. Essa tecnologia é empregada para identificar modificação comportamental em um modelo de mosca de doença humana com comprometimento de movimento local, mas não é adequada para o tratamento de doenças, deficiências ou dificuldades.
É essencial limpar a janela de vídeo relevante durante o processo de análise, ou seja, a janela de vídeo original e a janela de processamento de vídeo. Para começar, misture o reagente A e o reagente B do kit de sílica na proporção de um para 10, de acordo com as instruções do fabricante, para preparar a arena de campo aberto para o rastreamento da locomoção da drosófila. Em seguida, ajuste a câmera HD em um tripé, ajustando-a para que a lente da câmera fique perpendicular à superfície da arena de sílica.
Em seguida, abra o vídeo com Fiji. Arraste a barra de progresso para o quadro inicial e aprove tacitamente. Escolha todo o corpo da mosca usando a ferramenta de seleção à mão livre.
Clique na imagem, ajuste e brilho e contraste para ajustar o balanço de branco até que o valor de cinza da área selecionada se aproxime do plano de fundo amplo. Transfira a mosca anestesiada para a arena de campo aberto. Assim que a mosca se recuperar da anestesia, coloque o prato de arena com a mosca sob a câmera e agite-o rapidamente de um lado para o outro para garantir que a mosca esteja em movimento quando a gravação começar.
Pressione o botão de gravação no aplicativo da câmera para iniciar a gravação de vídeo. Após a conclusão da gravação, pressione o botão de parada para encerrar a gravação de vídeo. Converta os vídeos gravados em formato AVI com codificação pagã M-J para que possam ser abertos e analisados usando Fiji.
Também defina os quadros por segundo do vídeo para 15 fps para moscas adultas e 12 fps para larvas. Para abrir o vídeo com Fiji, selecione as duas opções, use a pilha virtual e converta para escala de cinza, na janela pop-up. Obtenha uma janela de processamento usando a ferramenta de configuração de imagem ativa do plug-in de rastreador de animais e crie uma área de rastreamento que circunda a arena na janela de vídeo original, usando a ferramenta oval.
Defina os filtros e os parâmetros dos dois filtros para o primeiro quadro em branco na janela de processamento. Em seguida, selecione o próximo quadro na janela de vídeo original e escolha a superfície filtrada da janela de processamento. Depois que uma janela de processamento filtrada for selecionada, use a ferramenta definir limite para girar o trato com um perfil vermelho, coberto na janela de processamento.
Em seguida, use o detector de blob definido para permitir que o computador reconheça a mosca com um perfil vermelho, coberto na janela de processamento. Defina o último quadro para a mosca adulta ou larvas, conforme descrito no manuscrito do texto. Use a ferramenta mostrar blobs para apresentar um retângulo de rastreamento na janela de vídeo original.
Inicie o rastreamento e exporte o arquivo de rastreamento após a conclusão do monitoramento. Carregue os arquivos de trilha e zona usando o plugin rastreador de animais e analisador de rastreamento. Selecione o índice desejado usando as configurações de zona e altere as configurações de parâmetro.
Calcule o tempo do intervalo de quadros usando a taxa de quadros. Produzir os gráficos de análise quantitativa utilizando software de planilha eletrônica e prisma de gráfico pad, após serem analisados no analisador de rastreamento. Abra o arquivo de faixa.
Copie todas as coordenadas para o Microsoft Office Excel e divida as células usando a tecla de espaço. Para calcular o tempo de imobilidade por intervalo de quadros, selecione todos os resultados calculados e insira um gráfico de colunas para exibir visualmente o tempo de imobilidade pela margem de todo o gráfico de colunas. Para ilustrar as mudanças no ângulo de direção, selecione todos os resultados calculados e insira um diagrama de dispersão.
Moscas adultas e larvas de terceiro ínstar, tratadas com rotenona, apresentaram déficits locomotores significativos em comparação com moscas controle, alimentadas com solvente DMSO. A análise quantitativa do tratamento com rotenona em moscas adultas mostrou uma diminuição significativa na distância percorrida e na velocidade média. E um aumento significativo no tempo de imobilidade.
Gráficos representativos mostraram menos picos para a velocidade de movimento por intervalo de quadros em moscas alimentadas com Rotenone em comparação com aquelas no controle, indicando a severidade do déficit de atividade locomotora. A coluna de imobilidade institucional de pixels movidos por quadro também mostrou movimento significativamente menor dentro de um minuto para moscas alimentadas com rotenona em comparação com moscas controle. Gráficos representativos ilustrando as mudanças de direção do ângulo de movimento em animais alimentados com rotenona e controle também revelaram alterações na direção escolhida pelas moscas.
Resultados semelhantes foram observados para as larvas do terceiro ínstar. Os resultados revelaram que o movimento comportamental das larvas rastreadoras alimentadas com rotenona foi significativamente prejudicado em relação ao controle. A etapa mais crucial no processo de análise é formar o primeiro quadro em branco, pois evidencia se o software pode verificar de forma eficaz.
Essa tecnologia pode permitir que os pesquisadores se aprofundem no mecanismo subjacente de múltiplos defeitos, como lesões nervosas ou musculares.
