Os autores gostariam de agradecer à Vida Freimann Science Center e Center for Research Zebrafish pessoal para seu cuidado e manutenção do peixe-zebra.

1. Ressuspender Morfolino <ol><li> Diluir 300 nM de fluoresceína-etiquetados com morfolino em 100 uL de nuclease livre de água para fazer uma solução a cerca de 3 mM. A solução é morfolino aliquotadas em vários tubos de microcentrífuga de parafina-selados e armazenados à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. </li><li> Para determinar a concentração exacta morfolino, diluir 5 uL de solução de morfolino (ou água como um branco) em 95 ul de 0,1 N de HCl. Definir uma linha de base num espectrofotómetro a 265 nm com o ensaio em branco de água e, então, determinar a leitura da solução diluída morfolino. Multiplicar a absorvância morfolino por sua constante determinada e pelo factor de diluição para determinar a concentração em ng / uL. A constante morfolino é calculada como: Morfolino constante = peso molecular da absorvância morfolino 1000/molar X. O peso molecular ea absorvância molar para o morfolino pode ser encontrada no &quot;Oligo Propriedades folha &quot;fornecido com o produto. Dividir a concentração morfolino, em ng / ul, pelo peso molecular para determinar a concentração em mM. Diluir o morfolino, se necessário, para uma concentração de trabalho, tipicamente 1,2 mM. </li></ol> 2. Amputação Fin <ol><li> Anestesiar peixe-zebra adulto em qualquer tricaina ou 2-fenoxietanol a 1,0 mg / ml em água do tanque. </li><li> Amputar a nadadeira utilizando uma lâmina de bisturi estéril ou navalha proximal ao ponto lepidotrichial primeira ramificação. Isto deve ser feito no local proximal / distal mesmo em cada animal (por exemplo, 7 segmentos ósseos distais do cinto fin). Importante: certificar-se para cortar perfeitamente perpendicular ao plano anterior / posterior do animal. Cortes inclinados irá resultar em excrescência fin desigual das metades dorsal e ventral da barbatana. </li><li> Retornar o peixe para um tanque. Nós tipicamente manter o peixe a 33 ° C para aumentar a taxa de regeneração. Dependendo do desenho experimental, wait 0-2 dias após a amputação (dpa) para a regeneração da nadadeira para começar antes de introduzir o morfolino. Abordagens alternativas são discutidos na discussão, abaixo. </li></ol> 3. Morfolino Injeção <ol><li> No dia anterior à injecção do morfolino, fazer uma placa de injecção (Figura 2). Assegure-se para cortar um entalhe a uma extremidade do poço, que ajuda a estabilizar o peixe para o procedimento de microinjecção. </li><li> Às 2 DPA, preparar o aparelho de injecção de micro-e uma solução de morfolino. </li><li> Dilui-se a fluoresceína morfolino-etiquetados com a concentração adequada (recomendam começando com 1,2 mM) e colocar num banho de água 65 ° C, durante 5 minutos. </li><li> Puxar a agulha de vidro para a injecção de micro-utilizando um extractor de agulha. </li><li> Coloque a agulha com a morfolino (nota: dependendo se você back-preenchimento ou front-carregar a agulha irá determinar se você carregar a primeira agulha, ou cortar a primeira dica). </li><li> Corte a ponta fora a agulha em umângulo n. </li><li> Siga as instruções do seu sistema de injeção de micro-injetar uma bolha aproximadamente 5 nl de morfolino por injeção. Volumes maiores de morfolino poderia interromper o tecido. </li><li> Anestesiar o peixe e coloque na placa de injeção. Remover o excesso de líquido e orientar a agulha para o local apropriado, tal distai ao raio óssea (Figura 3). Usando um microscópio e aparelho apropriado para microinjecção morfolino injecções (ver Tabela de reagentes específicos), injectar a morfolino na aleta de anterior para posterior, como mostrado na Figura 3. A injeção de posterior para anterior faz com que o tecido fin de arregaçar durante a injeção e é muito difícil. </li><li> Inserir a agulha suavemente o tecido regenerativo, apenas distal para cada raio ósseo (marcado com &quot;1&quot; na Figura 3) e empurre distalmente até localizado no blastema (marcado &quot;2&quot; na Figura 3). Tenha cuidado para não empurrar a agulha através da enfin de pneus. Quando a agulha estiver corretamente localizada, injetar o morfolino (ou seja, clique uma vez). No 1,2 mM, a fluoresceína-etiquetados com solução morfolino aparece amarelo-verde, mesmo em condições normais de luz. Com cada injecção, um &quot;puff&quot; amarelo da solução de morfolino podem ser visualizados, o que ajuda a localizar a injecção para o blastema. Cerca de 75 nl (10-15 cliques) de solução morfolino deve ser injetado por raios ósseos. Pausa ~ 1 seg entre os cliques. Nós só injetar o lado dorsal, usando o ventral como eletroporação somente controle. Alternativamente, pode-se repetir este procedimento inteiro usando um morfolino controlo sobre a meia ventral da barbatana. </li></ol> 4. Electroporação do morfolino <ol><li> Imediatamente após a injecção da morfolino, remover a placa de injecção a partir do aparelho de injecção de micro-. Encher a placa de injecção bem com a solução de anestesia até que o peixe é submerso. A electroporação é realizada sob a linha de água. </li> &lt;li&gt; A 3 mm de diâmetro platina eléctrodo pinça placa (cuy 650-P3 Pinças, Protech International) localiza os pulsos para aproximadamente metade da barbatana. Tenha cuidado para não tocar nos eletrodos no tecido fin. Para garantir que os eletrodos não tocam o tecido fin, gire o peixe de lado dorsal e olhar diretamente para baixo da linha mediana para a eletroporação. </li><li> Electroporate tanto o dorsal e ventral (para controlar por alguns efeitos não específicos electroporação) nos lados da barbatana, utilizando um CUY21 quadrado de onda Electroporator (Protech International, Inc.). Limpe os eletrodos com uma Kimwipe úmido após cada eletroporação para remover quaisquer bolhas que possam ter formado. Se eles não são removidos, um mini-carga se acumula, o que irá atrair o tecido na direção do eletrodo. Os parâmetros de eletroporação deve ser ajustado para 10 consecutivo 50 ms pulsos, a 15 V com uma pausa de 1 seg entre os pulsos. </li><li> Coloque o peixe sobre uma lâmina de vidro ou placas de Petri e rapidamente a imagem da barbatana, certificando-se de nota a orientação dorsal / ventral. Esta imagem vai ser utilizado para a análise de recrescimento no dia seguinte. Retornar o peixe para o tanque. </li></ol> 5. Análise <ol><li> Se a proteína alvo que foi batido para baixo na expressão é necessária para a regeneração da barbatana adequada, uma diferença dramática entre as metades dorsal e ventral da barbatana deve ser evidente um dia pós electroporação-(Figura 5B). </li><li> Às 3 da dpa, tirar outra foto da barbatana de cada peixe e igualar-se esta imagem com a imagem 2 correspondente dpa (Figura 5B). A variação natural no padrão de pigmentação fin entre os animais lhe permitirá identificar corretamente peixe. </li><li> Usando NIH Image, traçar as 2 e 3 DPA DPA áreas de ambas as metades dorsal e ventral (Figura 5B). </li><li> Para determinar a área% da utilização dorsal contra ventral a seguinte fórmula: (dorsais 3dpa - dorsais 2dpa) / (Ventral 3dpa -<html> 2dpa ventral) X 100 =% de área </li></ol> 6. Os resultados representativos <ol><li> Nós sempre ensaio de crescimento fin de 3 HPE dpa, ou 24 (horas eletroporação post). Neste momento, o morfolino fluoresceína-etiquetados deve estar presente na metade dorsal da barbatana (Suplementar Figura 1 e Figura 6A). É normal ver alguns de fuga para baixo para o nível da amputação. </li><li> Não deve haver diferença entre os lados dorsais e ventrais da barbatana injectado e electroporado com o morpholinos controle (Figura 6B). </li><li> Se o morfolino experimental visa uma proteína essencial para a excrescência da aleta, uma diferença dramática entre os lados dorsais e ventrais devem ser observados (Figura 6C). </li><li> Se o eletrodo tocou a fin durante a eletroporação, o tecido vai aparecer marrom (quase queimada na aparência) e necróticas. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquemática dos vários eventos que ocorrem durante a regeneração da barbatana. Os tempos de subjacente para cada evento são dadas em horas pós-amputação (HPA) e correspondem a uma temperatura do tanque de 33 ° C. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> Figura 2. A. Esquemática da placa de injecção, que é feita a partir de agarose e contém um pequeno poço para segurar o peixe durante microinjecção do morfolino. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> Figura 3. Esquemática da microinjeção morfolino. A. Coloque o peixe no prato com a cabeça do peixe no entalhe corte fora do poço, o que ajudará o peixe ficar estável. B. Já no pequeno aumento, mandar a agulha para que que está perto do tecido de regeneração da barbatana. C. </strong&gt; No maior ampliação, injetar o morfolino distal a cada raio da nadadeira óssea (ou seja, em cada blastema). A agulha deve entrar no tecido distai à raios óssea (1), e, em seguida, passe para a localização do blastema (2). Nota: os círculos verdes na esquemática são apenas para mostrar o local da injecção. O morfolino podem brevemente ser visualizado como um verde / amarelo &quot;puff&quot; após cada injecção, no entanto, isso não persistem como mostrado no esquema. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> Figura 4. Esquemática da eletroporação fin. A. Após a microinjeção, coloque o peixe em um prato de Petri cheia de anestesia e electroporate ambas as metades dorsal e ventral. B. Certifique-se de não tocar no tecido fin. Os eléctrodos devem ser colocados ~ 1 mm a partir do tecido. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; Figura 5. Esquemática dos métodos utilizados para calcular a inibição conseqüência fin. A. Tire uma foto da barbatana de cada peixe em 2 dpa, a injeção de morfolino ou imediatamente antes ou depois e eletroporação. Trace o tecido regenerativo de ambos dorsal do (verde) e ventral (azul) metades do fin usando NIH Image, (preto linhas tracejadas). B. Aos 3 dpa, tirar outra foto de cada aleta e novamente traçar as áreas dorsal e ventral de rebrota utilizando imagem NIH. C. Subtrair da área de rebrota de 2 dpa da rebrota total em 3 dpa tanto para os ricos dorsal e ventral. A área por cento de dorsal contra ventral re-crescimento pode ser calculada utilizando a fórmula: ((D 3dpa - D 2 DPA) / (V 3dpa - V 2dpa)) X 100. A percentagem de inibição = 100 - Área percentual. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> A Figura 6. Exemplos de esperadoresultados. A. imagem fluorescente mostrando uma fluoresceína marcados controle morfolino na metade dorsal da nadadeira, 24 horas após a eletroporação (HPE). B. Brightfield imagem de uma barbatana que foi injetado e com uma electroporados morfolino controle na metade dorsal . A imagem mostra recrescimento igual de ambos os metades dorsal e ventral de uma aleta, 24 HPE. C. imagem Brightfield de uma aleta que foi injectado e electroporado com um morfolino experimental na metade dorsal. A imagem mostra a inibição da rebrota no lado dorsal / injetado. A linha mostra a quantidade de recrescimento em 2 DPA, imediatamente antes da injecção morfolino e electroporação. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> Figura 7. Esquemático de uma injecção alternativo e procedimento de electroporação para proteínas alvo envolvido na cicatrização de feridas e formação de blastema. A. Injectar a morfolinoentre cada raio fin ósseo na metade dorsal da barbatana. B. Electroporate o morfolino como por normal. C. amputar a fin imediatamente proximal (~ 1 segmento ósseo) para o local de injecção. D. A fluoresceína-etiquetados com morfolino pode ser observado no epitélio da ferida e blastema em 24 HPE. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> Figura 8. Usando a técnica para atingir o epitélio da ferida e formação blastema. A. Brightfield imagem de uma barbatana de 24 hpa que foi injetado e com uma electroporados morfolino controle imediatamente antes da amputação. Imagem B. fluorescente de fin mostrado no painel Nota A. que a meia injectado dorsal da barbatana mostra boa captação do morfolino no tecido regenerativo. C - C &quot;ampliação Superior da metade dorsal da nadadeira mostrado nos painéis A e B. Os locais de injecção são muitas vezes ainda visível (setas)., Mas muitas células-alvo ter migrado para participar no epitélio da ferida e formação blastema (seta). <img alt="A Figura 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> A Figura 9. Utilizando a técnica para direccionar células que migram para formar o blastema. A. fluorescente e as imagens de campo claro inset mostrando uma barbatana injectado e electroporado com morfolino em ambas as metades dorsal e ventral. A aleta foi então amputado em dois planos. A metade dorsal foi cortado imediatamente distal aos locais de injeção, enquanto que a metade ventral foi cortado 9-10 segmentos ósseos distais aos locais de injecção. B. Aos 24 hpa, as imagens fluorescentes e brightfield inset mostram que morfolino migrou para o dorsal regenerar (1), mas não o regenerado ventral (2), indicando que apenas a célula imediatamente proximal ao local de corte participam na formação blastema. Os dois conjuntos de pontas de seta brancas mostram o nível de cada amputaçãoavião. Painéis marcado 1 e 2 mais à direita da imagem mostram uma vista maior ampliação das metades dorsal e ventral da barbatana, respectivamente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">Suplementar Figura 1.</a> Um vídeo de um confocal z pilha de uma região correspondente à localização de um blastema em uma aleta injectado e electroporado com um morfolino controlo. A imagem foi tirada em 24 de HPE. Uma vez que uma molécula de fluoresceína único não pode ser visualizada, nem todo o morfolino pode ser visualizado ou quantificado. No entanto, essas imagens dão uma idéia dos diferentes graus de absorção que podem ser visualizados em células individuais, a partir de pontos puntiformes, para células inteiras cheias de morfolino fluorescente. Na imagem ainda, a orientação é mostrado. Barra de escala: 25 microns.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Aqui, descrevemos uma abordagem perda de função poderosa para proteínas condicionalmente knockdown de interesse durante a regeneração da nadadeira em zebrafish adulto. Esta técnica tem sido utilizada para estudar os genes junções, sinalizando receptores, fatores de transcrição e microRNAs durante conseqüência fin regenerativo 16, 20-22. Prevemos que esta técnica pode também ser usado para estudar genes necessários para a cicatrização de feridas e formação blastema através da adaptação da técnica. Por exemplo, podemos injectar e electroporado um morfolino controlo no espaço entre os raios da aleta ósseas na metade dorsal da barbatana antes da amputação (Figura 7). Em seguida, amputado da barbatana imediatamente distal ao plano de injecção. 24 hPa, observou-se que as células morfolino-alvo tinham migrado distalmente para formar tanto epitélio da ferida e blastema (Figura 8), indicando que as células durante estas fases iniciais de regeneração pode também ser Targeted. A técnica tem algumas limitações notáveis. Por exemplo, a fluorescência a partir da marca de fluoresceína não persiste a seguir fixação e de processamento para imuno-histoquímica, o que torna impossível para correlacionar um fenótipo celular particular (isto é, proliferação celular) com a quantidade de morfolino presente numa célula. Além disso, têm sido incapazes de atingir o consistentemente electroporação de plasmídeos para a barbatana da cauda de regeneração, embora um grupo anterior fez relatam a electroporação bem sucedida de DNA em fin tecido 23. Finalmente, observamos que o morfolino só é eficaz para ~ 48 horas de eletroporação pós 21, que proíbe o uso desta técnica na sua forma actual para testar genes envolvidos na diferenciação de tipos de células novas. Testes adicionais e modificação do procedimento pode ultrapassar estas limitações actuais. Além disso, é possível que esta técnica pode ser utilizadapara testar proteínas envolvidas na migração de células do tecido subjacente ao blastema. Por exemplo, podemos injectar e electroporado um controlo morfolino em ambos os lados da barbatana (como descrito na Figura 7) antes da amputação. Em seguida, amputada na metade dorsal da nadadeira imediatamente distal ao plano de injecção e que amputar a nadadeira ventral muito mais distal. Aos 24 hPa, as células morfolino-positivos no lado dorsal tinha migrado a partir do local de injecção para o epitélio da ferida sobrejacente e blastema. No entanto, esse não era o caso no lado ventral (Figura 9). Isso apóia a idéia de que apenas as células que sustentam o plano de amputação participam da resposta regenerativa. Estes dados também sugerem que as proteínas hipótese de ser necessário para a migração de células pode ser testada usando esta técnica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT ou CUY21-SC onda quadrada electroporator </td><td> Protech Internacional </td><td> CUY21EDIT ou CUY21SC </td><td> Ambas as unidades funcionam para este protocolo </td></tr><tr><td> 3 mm de remo eletrodos de diâmetro </td><td> Protech Internacional </td><td> Cuy 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morfolino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morfolino devem ser projetados para a sua proteína de interesse </td></tr><tr><td> 2-fenoxietanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anestesia; diluído 1:1000 em água do sistema de peixe para o procedimento, 1:500 para eutanásia </td></tr><tr><td> Micro-injectina bomba </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> PV830 pneumático PicoPump </td><td> Muitos sistemas de microinjecção diferentes poderia ser usado </td></tr><tr><td> Micro-manipulador </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> MMJR </td><td> Destro (MMJL para canhotos) </td></tr><tr><td> A micro-injecção agulhas, 1,0 mm de diâmetro externo </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 1B100F-4 </td><td> Estes são de borossilicato capilares de vidro, puxado para dentro de uma agulha </td></tr><tr><td> Suporte de agulha </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 5430-ALL </td><td> Kit Pico do Bico, certifique-se de inserir a 1,0 milímetros pipeta junta </td></tr><tr><td> Agulha extrator </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td> Outros micropipeta / agulha puxadores também deve funcionar </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Leica, Nikon, Zeiss </td><td> Número varia dependendo do fabricante </td><td> Qualquer estereomicroscópio com 20X óptica ea capacidade de trabalhar com micromanipuladores </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

Certas espécies de peixes teleósteos urodeles e pode regenerar seus tecidos. Zebrafish tornaram-se um modelo largamente utilizado para estudar a regeneração espontânea de tecidos adultos, tais como o coração 1, 2 retina, a espinal medula 3, 4 nervo óptico, as células pilosas sensitivas 5, e as aletas 6. A barbatana peixe-zebra é um apêndice relativamente simples, que é facilmente manipulado para estudar múltiplos estágios na regeneração epimórfica. Classicamente, a regeneração da nadadeira foi caracterizada por três fases distintas: cicatrização, a formação do blastema e conseqüência fin. Após amputando parte da barbatana, o epitélio circundante prolifera e migra sobre a ferida. A 33 ° C, este processo ocorre dentro de seis horas após a amputação-(hPa, Figura 1B) 6,7. Em seguida, as células subjacentes a partir de diferentes linhagens (ex. óssea, sangue, células gliais, fibroblastos) voltar a entrar no ciclo celular para formar uma blastema proliferativa, wnquanto a epiderme sobrejacente continua a proliferar (Figura 1D) 8. Excrescência ocorre como células proximais ao blastema re-se diferenciar em suas linhagens respectivas para formar novo tecido (Figura 1E) 8. Dependendo do nível da amputação, a regeneração completa é completada em uma semana a um mês. A expressão de um grande número de famílias de genes, incluindo Wnt, hox, FGF, MSX, ácido retinóico, shh, entalhe, BMP, e activina A-beta genes, é sobre-regulada durante fases específicas do fin regeneração 9-16. No entanto, os papéis de esses genes e suas proteínas codificadas durante a regeneração tem sido difícil de avaliar, a menos que um inibidor específico para a proteína existe 13, um mutante sensível à temperatura existe ou um animal transgénico (quer superexpressão da proteína do tipo selvagem ou um dominante -negativa de proteína) foi gerado 7,12. Nós desenped uma técnica genética reversa de forma rápida e facilmente testar a função de qualquer gene durante a regeneração fin. Oligonucleotídeos morfolino são amplamente utilizados para estudar a perda de proteínas específicas durante o peixe-zebra, Xenopus, pintinho, eo desenvolvimento do mouse 17-19. Morpholinos pares de bases com uma sequência de RNA complementar ou bloco de splicing pré-mRNA ou a tradução do mRNA. Nós descrevemos um método para introduzir de forma eficiente de fluoresceína-etiquetados com anti-sentido morpholinos em aletas regeneração peixe-zebra para expressão knockdown da proteína alvo. O micro-morfolino é injetado em cada blastema da nadadeira em regeneração da cauda do peixe-zebra e electroporados nas células vizinhas. Fluoresceína fornece a carga para a electroporate morfolino e para visualizar o morfolino no tecido barbatana. Este protocolo permite knockdown proteína condicional para examinar o papel de proteínas específicas durante conseqüência fin regenerativa. No Discussion, nós descrevemos como esta abordagem pode ser adaptado para estudar o papel das proteínas específicas durante a cicatrização de feridas ou formação de blastema, bem como um marcador potencial de migração celular durante a formação do blastema.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Nós descrevemos um método para condicionalmente knockdown a expressão de uma proteína alvo durante a regeneração do adulto peixe-zebra barbatana. Esta técnica envolve a micro-injecção e electroporating morpholinos oligonucleótido anti-sentido para o tecido da aleta, o que permite testar o papel da proteína em vários estágios de regeneração da barbatana, incluindo a cicatrização de feridas, a formação de blastema, e excrescência regenerativo.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

in-vivo-electroporation-morpholinos-into-regenerating-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

16.8K visualizações.  University of Notre Dame. Nós descrevemos um método para condicionalmente knockdown a expressão de uma proteína alvo durante a regeneração do adulto peixe-zebra barbatana. Esta técnica envolve a micro-injecção e electroporating morpholinos oligonucleótido anti-sentido para o tecido da aleta, o que permite testar o papel da proteína em vários estágios de regeneração da barbatana, incluindo a cicatrização de feridas, a formação de blastema, e excrescência regenerativo.

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Eletroporação única célula in vivo dentro do cérebro intacto desenvolvimento

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish Adulto

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...