Os autores gostariam de agradecer à Vida Freimann Science Center e Center for Research Zebrafish pessoal para seu cuidado e manutenção do peixe-zebra.

1. Preparação morfolino: <ol><li> Todos os oligos morfolino devem ser personalizados e encomendados através GeneTools (Philomath, OR). Usamos a carregada positivamente lisamina marcadas morpholinos para conduzir o morpholinos electroporated para o eletrodo negativo. Tentamos, sem sucesso, alvo de carga negativa fluoresceína tag morpholinos para o eletrodo positivo usando esta técnica. Diluir 300 nmol de morfolino em 100 l de água livre de nuclease para produzir uma solução 3 mM. Alíquota do morfolino em vários tubos de parafina, selada microcentrífuga. Guarde longe da luz à temperatura ambiente. </li><li> Determinar a concentração morfolino diluindo 5 mL de morfolino (ou água utilizada para diluir o morfolino como um espaço em branco) em 95 mL de 0,1 N HCl. Definir o comprimento de onda espectrofotômetro (λ) a 265 nm. Calcule a constante para o seu morfolino usando a seguinte equação: = Peso molecular constante especial para o seu morpholino absorbância X 1000/molar. </li><li> Você vai encontrar o peso molecular e os dados de absorvância molar em &quot;Propriedades Oligo&quot; folha fornecida com cada morfolino. Analisar o espaço em branco para verificar as leituras de base e fazer leituras de cada morfolino diluída. Multiplicar a absorvância a 265 nm de cada morfolino pela sua constante e determinada pelo fator de diluição para obter a concentração em ng / mL. Divida este número pelo peso molecular para determinar a concentração em mM. Diluir o morfolino, se necessário, a uma concentração de trabalho. </li></ol> 2. Remover camada córnea exterior: <ol><li> Anestesiar de 6-12 meses de idade em zebrafish adulto tricaina ou 2-fenoxietanol a 1,0 mg / ml em zebrafish água do tanque. </li><li> Embrulhe em um peixe-zebra umedecido pedaço de papel toalha, cobrindo as brânquias, mas deixando o olho exposto. O peixe embrulhado é colocado sob um estereoscópio ea ampliação é aumentada até o diâmetro do olho enche cerca de um terço doso campo visual (Figura 1). </li><li> Usando Dumont # 5 pinças, pegue a córnea exterior perto da fissura óptica. Este tecido é colorido de vermelho e é rotulado de &quot;OC&quot; na Figura 1. Há uma leve protrusão ou lábio indicado pela seta rotulada &quot;CL&quot;. Puxe em um ângulo baixo (ou seja, 10 graus) em todo o olho para remover a córnea exterior. Com a prática, este pode ser concluído em um movimento. Se o slip pinças, re-pegue o tecido e puxe novamente em um ângulo baixo até que sejam removidas. A córnea bem conectado pode causar o olho a ser desalojado da tomada quando puxado. Você pode manter o olho de cada vez desalojada por firmar com outro conjunto de pinças. </li></ol> 3. Incisão na córnea e injeção morfolino: <ol><li> Imediatamente após a remoção da córnea exterior, fazer uma pequena incisão na córnea onde o aluno encontra a íris (Figura 2). Isso é feito usando uma lâmina de bisturi de safira (Veja Materiais). </li><li> Load 0,5 mL da solução 3,0 mM morfolino em um Hamiltna seringa equipada com um calibre 33 removíveis, agulha blunt-end (Veja Materiais). Pipeta para cima e para baixo para remover bolhas de ar na linha. Insira com cuidado a agulha no vítreo através da incisão (Figura 2). Não insira a agulha longe demais ou você vai perfurar a retina ou deslocar a lente. </li><li> Injecte lentamente a solução morfolino no espaço vítrea. Dependendo da idade dos peixes, o espaço irá realizar vítrea ~ 0,5 mL. Você deve visualizar vítreo uncolored vazando da incisão, uma vez que é deslocado pela solução morfolino. Injetar até que uma pequena quantidade de solução de vazamentos morfolino fora da incisão. Você deve visualizar claramente as morfolino lisamina marcadas dentro do olho. </li><li> Após a injeção, o retorno dos peixes ao tanque para se recuperar. Nós normalmente só injetar o olho esquerdo, usando o olho direito como um controle uninjected, mas eletroporação de ambos os olhos é possível. </li></ol> 4. Eletroporação: <ol><li> Seguintea injeção de cerca de 10 peixes, re-anestesiar um peixe injetado e envolvê-la em um pedaço de papel toalha umedecido, apenas cobrindo as brânquias, mas deixando o olho exposto. Transfira o peixe para um prato de Petri. Coloque em luvas de látex ou similares para evitar a exposição à anestesia. Enquanto gentilmente segurando o peixe para o fundo do prato, encher o prato com anestesia (Figura 3, painel esquerdo). </li><li> A 3 mm de diâmetro do eletrodo placa de platina (Veja Materiais) localiza os pulsos de eletroporação para aproximadamente metade da retina. Normalmente, alvo da retina dorsal. Pressione suavemente o eletrodo positivo para baixo na metade ventral do olho. Com a córnea externa removida, o olho pode ser facilmente girada, expondo a porção dorsal do globo ocular. </li><li> Ainda pressionando para baixo no lado ventral do olho, coloque o eletrodo negativo próximo (~ 1-2 mm) expostas a metade dorsal do olho. Tenha cuidado para não tocar no eletrodo negativo diretamente para o olho, o que irá resultar em danosa retina dorsal. Depois de determinar a distância adequada entre os eletrodos, use o parafuso de ajuste no punho dos eletrodos para manter que se espalham quando electroporating. Isso mantém o eletrodo negativo de uma distância ideal do olho quando o eletrodo positivo é pressionado para baixo na posição. </li><li> Electroporate do olho usando um CUY21 Electroporator onda quadrada (Veja Materiais). Os parâmetros eletroporação deve ser ajustado para dois períodos consecutivos de 50 msec pulsos, a 75 V com uma pausa de 1 seg entre os pulsos. </li><li> Retorno dos peixes ao tanque. Nós normalmente começam nosso protocolo para a degeneração induzida pela luz constante da retina imediatamente após eletroporação. </li></ol> 5. Resultados representativos: <ol><li> Por 3-5 dias após a eletroporação (dependendo da estabilidade do morfolino), o rótulo lisamina pode ser visualizado em todas as camadas da retina em um retina seccionado (Figura 4). Isto serve como uma confirmação para a presença deos rotulados morfolino. </li><li> Podemos alcançar knockdown proteína completa até 3-5 dias após a eletroporação, dependendo da eficácia do morfolino (Figura 5). Normalmente, durante estudos de tratamento de luz, colhemos os olhos menos 3 ou 4 dias após a eletroporação morfolino. Isto é feito através da remoção de todo o olho com uma pinça Dumont 5B # com extremidades curvas (Figura 6; Materiais) e processamento de tecido para imunohistoquímica 15. Como acontece com qualquer técnica de knockdown, uma demonstração de knockdown eficiente deve ser mostrado, a fim de validar o fenótipo. Portanto, sugerimos a obtenção de anti-soros para a sua proteína de interesse. Alternativamente, se e anticorpo não está disponível e os morfolino é direcionado tanto ao receptor de splice ou local doador no pré-mRNA, ele irá bloquear splicing eficiente do mRNA. Neste caso, é possível a utilização da transcriptase reversa-PCR para amplificar as seqüências de acompanhamento no RNA morphant e determinar a eficiência do bloqueio da splic normaispadrão ing. </li><li> Quando o retinas são seccionados de nasal para temporais no eixo dorsal ventral, as caixas de sombreado azul (Figura 6) representam as áreas da retina que são mais frequentemente danificados a partir do evento eletroporação em si. A caixa sombreada rosa representa a área que é alvo de morfolino introdução em células da retina pela eletroporação. </li></ol><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática representando a remoção das camadas epiteliais da córnea. O painel esquerdo mostra as principais características estruturais do olho, incluindo a lente (L), o vítreo (Vit), a retina (R), a córnea exterior (OC), a córnea interna (IC), e a saliência da córnea ( CL). A orientação do olho é mostrado no canto inferior direito do primeiro painel e é rotulado anterior (A), posterior (P) dorsal, (D) e ventral (V). A coloração vermelha indica a córnea exterior, que é removido. O pan segundo<html> el mostra como as pinças são usadas para agarrar a saliência da córnea e para puxar a córnea exterior através do olho em um ângulo baixo (terceiro painel). O painel da direita mostra como um segundo par de fórceps pode ser usado para o olho da constante enquanto puxa a córnea. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Figura 2. Esquemática das etapas envolvidas na injeção intravítrea de morfolino. Uma pequena incisão é feita no olho, onde o aluno encontra a íris (painel esquerdo). A diferença resultante deve ser grande o suficiente para uma agulha de calibre 33, que é preenchido com a solução morfolino, para ser inserido (painel do meio). Injectar lentamente 0,5 ml de solução para o vítreo (painel direito). Você deve visualizar uma pequena quantidade de solução vítrea sair da incisão como o vítreo é parcialmente substituído por com-lisamina tag morfolino (painel direito). ig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Esquemática do procedimento de eletroporação geral. Os peixes anestesiados, que foi injeção intravítrea injetado com o morfolino, é delicadamente envolto em papel toalha úmido (painel esquerdo). A toalha de papel deve cobrir as brânquias, mas não obstruir o olho (painel do meio). Pressione suavemente o eletrodo positivo para baixo na parte ventral do olho, permitindo a metade dorsal do olho para girar para fora do soquete. Coloque o eletrodo negativo de cerca de 1 milímetro a partir da metade dorsal do olho e começar a eletroporação (painel direito). <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Figura 4. Confocal imagem comparando uma retina electroporated sem injeção intravítrea injeção de um morfolino lisamina-tagged (A), e uma retina intravítreo injetado e electroporated com o morfolino lisamina-marcados (B). A etiqueta lisamina é encontrado em todas as camadas da retina e tipos de células. ROS, de haste exteriorsegmentos; ONL, a camada externa nuclear; INL, camada nuclear interna; GCL, camada de células ganglionares. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Figura 5. Confocal imagens comparando imunolocalização PCNA em retinas electroporated com um controle de morfolino (painéis à esquerda) e retinas electroporated com um morfolino anti-PCNA (painéis à direita) antes da luz morte celular induzida por fotorreceptoras. De adaptação ao escuro zebrafish adulto albinos foram colocados em luz intensa constante para 1, 2 ou 3 dias após a eletroporação do morfolino. O controle de morfolino não para reprimir a expressão PCNA crescente no retinas de luz danificado. O morfolino anti-PCNA eficiente derrubado PCNA expressão da proteína por três dias de intensa danos luz constante. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> Esquema Figura 6. (Painel esquerdo) mostrando enucleação do olho para pROCESSAMENTO e cryosectioning, que é feito ao longo do eixo dorsal ventral. A caixa cor de rosa sombreada (painel direito) mostra a região da retina com a maior quantidade de proteína knockdown usando esta técnica. As caixas azuis sombreadas representam as áreas que são mais frequentemente danificados pelo evento eletroporação. A orientação do olho é rotulado anterior (A), posterior (P) dorsal, (D) e ventral (V).

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Não temos nada a divulgar

Recentemente, duas análises microarray examinou as mudanças de expressão gênica que ocorreu durante a regeneração de qualquer retina a luz danificado ou um patch cirurgicamente extirpado da retina 10, 16. Ambos os estudos revelaram numerosos genes que apresentaram mudanças significativas na expressão, seja crescente ou decrescente, que provavelmente são necessários para diferentes eventos que ocorrem durante a regeneração da retina, como a re-entrada da glia Müller no ciclo celular, proliferação e migração contínua do progenitores neuronais para a camada da retina danificada, ea diferenciação dos progenitores neuronais para o tipo de célula neuronal correta. Embora uma comparação direta desses dois conjuntos de dados microarray revelam genes candidatos que possam estar envolvidos nestes eventos celulares, em última instância esses genes e suas proteínas codificadas devem ser testados para determinar se eles são necessários para a regeneração neuronal. Aqui, descrevemos uma abordagem de perda de função-poderoso a conditionalmente knockdown proteínas de interesse na retina zebrafish adulto. Esta técnica tem sido usada para estudar ambas as proteínas extracelular e intracelular, bem como moléculas sinalizadoras, fatores de transcrição e proteínas necessárias para a replicação de DNA 17-19. Assim, este método tem ajudado muito a nossa compreensão do mecanismo molecular subjacente a regeneração da retina adulta em zebrafish. Testamos vários parâmetros eletroporação (número de tensão, de pulsos, o tempo entre os pulsos) antes de um protocolo bem sucedido foi alcançado. Um relatório anterior do electroporating morpholinos no fin regeneração caudal zebrafish utilizado 10 pulsos em uma baixa voltagem (15 V) 20. Porque a retina zebrafish adulto é rodeado por várias camadas de células e não é facilmente acessível a eletrodos pinça, os parâmetros utilizados na fin foram fracassadas de forma eficiente electroporating morpholinos na retina adulta. Por outro lado, uma alta voltagem (100 V), muitas vezes resulted na morte do peixe. Recentemente, 5 pulsos de 80 V foi descrito electroporate DNA plasmídeo na retina do rato recém-nascido filhote 21. Descobrimos que um pouco menos intensa 2 pulsos de 75 V resultou em eletroporação bem-sucedida do morpholinos na retina zebrafish adulto com a sobrevivência de 100% dos peixes tratados. Além disso, descobrimos que a remoção da maioria do exterior (ou externo-mais) componente da córnea aumentou muito a eficiência eletroporação. Aumentar o número de pulsos pode eliminar a necessidade de remoção deste tecido, mas também pode causar danos maiores tecido. Estudos de controle extensa demonstrou que estes parâmetros não causou morte celular significativa da retina ou alterar as respostas celulares específicas observadas durante a regeneração de fotorreceptores 19. Ganho de função de estudos não são atualmente possíveis usando esta técnica in vivo, devido à nossa incapacidade de forma consistente electroporate grandes ácidos ribonucléico em todos os retinal células. No entanto, o sucesso de electroporating plasmídeos na retina do rato in vivo e da retina zebrafish em explantes sugere ainda é uma possibilidade em zebrafish 21, 22. Um dos pontos fortes desta técnica é a eletroporação parece eficiente introduzir o morfolino em todos os diferentes tipos de células da retina. No entanto, uma potencial fraqueza era que a eletroporação eficiente entregou o morfolino apenas nas regiões dorsal e central da retina. Um evento de eletroporação segunda para a metade ventral dos resultados retina no alvo bom para todas as camadas, mas muitas vezes resulta em danos. Esta restrição espacial foi provavelmente devido à forma e posicionamento dos eletrodos. O uso de eletrodos de design personalizado em forma de taça que poderia ser colocado ao redor do olho pode melhorar esta fraqueza. Esta restrição espacial da entrega morfolino limita o uso desta técnica e impede o uso de um ensaio de sucessoh como a análise ERG que exigiria uma avaliação global da retina. Deve-se notar que como em qualquer experimento morfolino, é aconselhável para confirmar seus resultados usando um segundo, não se sobrepõem morfolino ao mRNA alvo. Em alguns casos, é possível também electroporate dois morpholinos diferentes simultaneamente para knockdown da expressão de duas proteínas diferentes. Demonstramos isso derrubando a expressão de ambos os Pax6a e proteínas Pax6b, individualmente e em associação 18. Embora tenhamos demonstrado o uso desta técnica com o nosso modelo de danos luz, poderia provavelmente ser usado para estudar a regeneração em modelos de outros danos 2-8 ou usado para examinar a função das proteínas na retina não danificada. Por exemplo, eletroporação de morpholinos poderia ser usado para knockdown da expressão de canais específicos ou moléculas de transdução de sinal no gânglio ou células amácrinas e depois estudar a função desses sinalizaçãocaminhos no processamento visual. No entanto, como morpholinos só afetam tradução da nova proteína, a pessoa teria que esperar até turnover de proteína endógena ocorre antes de um ensaio pode ser realizado. Em função da estabilidade da proteína, que pode variar de horas a dias 18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT ou CUY21-SC onda quadrada electroporator </td><td> Protech Internacional </td><td> CUY21EDIT ou CUY21SC </td><td> Ambas as unidades de trabalho para este protocolo </td></tr><tr><td> 3 mm de diâmetro paddle eletrodos </td><td> Protech Internacional </td><td> Cuy 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morfolino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morfolino deve ser personalizados à sua proteína de interesse </td></tr><tr><td> 2-fenoxietanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anestesia; diluída 1:1000 em água do sistema de peixe para o procedimento, 1:500 para a eutanásia </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinças </td><td> Precision Instruments mundo </td><td>14095 </td><td> Qualquer # 5 pinças com o trabalho </td></tr><tr><td> Dumont # 5B pinça com pontas em ângulo </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 500234 </td><td> Usado para a eutanásia enuclear seguintes olho </td></tr><tr><td> Sapphire blade, duplo fio lance, 1 mm de largura, com Sapphire cabo da faca </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> Blade: 500314 Handle: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton seringa com removível 33 gauge blunt-end agulha </td><td> Empresa Hamilton </td><td> Seringa: 87930 Agulha: 7762-06 </td><td> Remova a agulha que vem com seringa e substituir com 33-gauge agulha blunt-end </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Muitos devastadoras doenças oculares hereditárias resultar em cegueira progressiva e irreversível, porque os seres humanos não podem se regenerar morrendo ou doentes neurônios da retina. Em contraste, a retina zebrafish adulto possui a capacidade robusta de espontaneamente regenerar qualquer classe neuronal que se perde em uma variedade de diferentes modelos de danos na retina, incluindo punção da retina, a ablação química, alta temperatura concentrada, e tratamento luz intensa 1-8. Nosso laboratório amplamente caracterizada a regeneração de fotorreceptores após o tratamento luz constante intensa e interior neurônios da retina após injeção intravítrea ouabaína 2, 5, 9. Em todos os casos, residente glia Müller re-entrar no ciclo celular para a produção de progenitores neuronais, que continuam a proliferar e migrar para a camada adequada da retina, onde se diferenciam em neurônios deficiente. Nós caracterizada cinco estágios diferentes durante a regeneração da dama-luzged retina que foram destacados por respostas específicas celular. Foram identificados vários genes diferencialmente expressos em cada estágio de regeneração da retina através da análise mRNA microarray 10. Muitos destes genes também são críticos para o desenvolvimento ocular. Para testar o papel de cada gene candidato / proteína durante a regeneração da retina, precisávamos desenvolver um método para condicionalmente limitar a expressão de uma proteína único candidato, por vezes, durante a regeneração da retina adulta. Oligos morfolino são amplamente utilizados para estudar a perda da função de proteínas específicas durante o desenvolvimento do peixe-zebra, Xenopus, pinto, mouse e tumores em xenoenxertos humanos 11-14. Estes pares de bases modificadas oligos com seqüência de RNA complementar, quer bloquear a emenda ou a tradução do RNA alvo. Morpholinos são estáveis ​​na célula e pode eliminar ou &quot;knockdown&quot; a expressão da proteína por três a cinco dias 12. Aqui,nós descrevemos um método eficiente para a expressão da proteína knockdown alvo na retina zebrafish adulto. Este método emprega lisamina marcadas morpholinos antisense que são injetadas no vítreo do olho zebrafish adulto. Utilizando uma pinça eletrodo, o morfolino é então electroporated em todos os tipos de células da retina dorsal e central. Lissamina fornece a carga na morfolino para eletroporação e podem ser visualizados para avaliar a presença do morfolino nas células da retina. Knockdown condicional na retina pode ser usado para examinar o papel de proteínas específicas em momentos diferentes durante a regeneração. Além disso, esta abordagem pode ser usada para estudar o papel de proteínas específicas na retina não danificada, em processos como a transdução visual e processamento visual em neurônios de segunda ordem.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

19.1K visualizações.  Wayne State University School of Medicine. Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Vídeo: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Cultura organotípicas de Retina Coelho Adulto

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Biologia

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Eletroporação única célula in vivo dentro do cérebro intacto desenvolvimento

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...