Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) e da União Europeia (ZF-Saúde).

1. Preparação da mistura de injecção <ol><li> Use morpholinos vivo como células internalizá-los de forma mais eficiente do que as moléculas morfolino normais. Veja informações do fabricante para obter mais informações (Tabela 1: Reagentes e Materiais). </li><li> É um corante de rastreio fluorescente (por exemplo, vermelho CellTracker CMTPX, Invitrogen) para visualizar a exactidão da injecção. Este corante é metabolizado na célula e se torna fluorescente apenas na célula após a ingestão. Portanto, este passo é crucial para determinar que as células que são orientadas de forma eficiente pela cerebroventricular microinjecção. </li><li> Preparar tampão fosfato salino (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH: 7,4) para diluir solução morfolino. Se for necessária uma diluição da solução de morfolino, usar sempre PBS. </li><li> Prepare a 10 ul da mistura através da adição de injecção 9 ul da solução de morfolina e 1 ml de thcorante rastreador celular e (diluído ou diluído A concentração estoque da solução morpholino é 500 mm Nossos resultados anteriores 22 indicam que várias doses diferentes do morpholino -.. que variam de 50 mm a 500 mm - resultam em diferentes níveis de knockdown de um eficiente knockdown para fenótipos hypomorphic). 1 ml de solução é suficiente para injeção em um cérebro de zebrafish. </li><li> Misture bem e guarde em temperatura ambiente até que a injeção. </li></ol> 2. Preparação do aparelho de injecção <ol><li> Preparar a injeção de capilares de vidro usando um extrator de agulha. Utilize os seguintes parâmetros: o valor do ciclo de aquecimento: 463, puxando valor de ciclo: 230, velocidade: 1,5 seg, tempo: 75 ms. </li><li> Ligue a fonte de pressão e ajustar as configurações de pressão para 50 psi ou 3,5 bares. </li><li> Ajuste as configurações microinjetor da seguinte forma: manter a pressão de 20 psi, pressão de ejeção de 10 psi, o valor de 2,5 e 100 ms gama de gating período. </li><li> Transformaro iluminador anel e localizar o anel sobre a platina do microscópio. </li><li> Colocar o suporte capilar para uma posição adequada para o próximo microscópio. </li><li> Inserir o capilar de vidro para o suporte. Ajustar o ângulo de injecção de 45 graus. </li><li> Encaixe a ponta do capilar de vidro usando uma pinça de ponta fina e calibrar a pressão de saída do orifício. Isto deve ser testado pela imersão da ponta da agulha para dentro da água de peixe e dando um pulso de pressão constante. As bolhas de ar resultantes deve ser apenas uma linha, que é uma indicação da pressão óptima / tamanho do orifício. Por favor, veja o vídeo de demonstração deste calibração. </li><li> Carregue o capilar de vidro com a solução de injeção sem bolhas de interceptação. </li><li> Aplicar pressão para remover o ar entre a ponta do capilar de vidro e a solução injectável carregado. </li></ol> 3. Anestesia <ol><li> Preparar a solução estoque dos anestésicos (0,1% MESAB - etil-m-aminobenzoato metanossulfonato). </li><li> Remover o número desejado de peixe de seus tanques em gaiolas de rato de plástico ou outro recipiente de transporte, com quantidade suficiente de água. </li><li> Preparar a solução de anestesia em uma pequena caixa de plástico através da mistura de 200 mL de água de peixe, com 5 ml de solução de estoque de anestésicos. A concentração final do anestésicos: 0,0025% (v / v). </li><li> Half-encher um prato de plástico Petri com anestésicos. Utilize este prato para injectáveis. </li><li> Incubar a pescar nos anestésicos até que o subjuga peixe. </li></ol> 4. Incisão e microinjeção Cerebroventricular <ol><li> Retire o peixe da caixa usando uma rede de pesca e colocá-lo na placa de Petri. </li><li> Gentilmente segurar o peixe com o forceps e orientar a cabeça de uma maneira que ela se inclina ligeiramente para baixo. Isto irá facilitar a incisão. </li><li> Gerar uma pequena fenda no crânio, utilizando uma agulha farpado-end de calibre 30. É apenas a ponta da agulha e não penetram mais do quesuficiente para o cérebro, pois isso irá causar danos ao tecido cerebral e irá manifestar como sangramento. </li><li> Mantenha o peixe e inserir a ponta do capilar de vidro através do local da incisão. </li><li> Orientar a ponta do capilar de vidro para o telencéfalo. Evitar tocar no tecido do cérebro, pois isso produz danos no tecido e também evita que a dispersão da solução injectada. </li><li> Injectar a solução. O líquido dispersa imediatamente após a injecção. </li></ol> 5. Recuperação e análise da injeção de Precisão <ol><li> Retire o peixe a partir da configuração de injeção e colocar em uma caixa de plástico com peixes de água doce. </li><li> Permitir a recuperação. </li><li> Re-anestesiar o peixe com 0,0025% MESAB brevemente e deixe o peixe sob o microscópio de fluorescência. A dispersão completa da fluorescência vermelha é uma indicação de distribuição generalizada do líquido injectado. </li><li> Coloque o peixe de volta para a caixa de plástico. </li><li> Ligue a caixa de plástico para tele sistema de circulação para oxigenar o peixe e manter durante longos períodos de tempo. </li><li> Usar o peixe para fins desejados, tais como análises de comportamento ou sacrificar os animais a pontos de tempo desejado após a injecção para preparar as amostras de tecido para as análises histológicas (colorações imuno-histoquímica, etc.) As referências a seguir dão exemplos de como analisar o cérebro do peixe-zebra adulto: 9,11,17-20,24-27. O tempo mais rápido para observar um knockdown eficiente (mais de 50% knockdown) foi de 12 h nos nossos estudos, 22. </li></ol> 6. Controles científicos sugeridos <ol><li> É uma molécula morfolino incompatibilidade que não é suposto causar qualquer fenótipo como um controlo negativo. Use uma molécula morpholino padrão ou especificamente do projeto de controles morfolino para cada gene de interesse. Além disso, utilize-se o solvente (neste caso, PBS) como mais um controlo negativo para avaliar os efeitos de toxicidade ou não-específicas do mismovadia / controlar morfolino injeções. </li><li> Use PCNA morpholinos descrito anteriormente 22 como controlos positivos. Isto faz com que morfolino knockdown eficiente no cérebro do peixe-zebra adultos (75-95% de eficiência knockdown dentro de 1 dia após a injecção) 22. </li></ol>

<ol>
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Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).</li><li>Ihrie, R. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito aqui permite a administração fácil e rápida de morpholinos no cérebro do peixe-zebra adulto. Nós demonstramos que o nosso método de injecção bloqueia eficientemente a expressão do gene nas células dos ventrículos e resulta em consequências funcionais na resposta neurogenesis. Há pontos importantes a serem cautelosos sobre durante a execução da microinjeção cerebroventricular. Por exemplo, o efeito das moléculas morfolino depende da concentração utilizada. Esta concentração deve ser determinada pelo utilizador final. Recomendamos começar com a solução estoque (500 mm) e realizar diluições seriadas e, idealmente, de pré-teste por injeção em embriões utilizando protocolos padrão embrião injeção 28-30. Anteriormente, foram obtidos diferentes níveis de eficiência de knockdown com concentrações de morpholinos que variam de 50 pM a 500 pM 22. Em segundo lugar, o orifício do capilar de vidro não deve ser large como isso vai levar a grande afluxo de líquido dentro do cérebro após a injecção. Da mesma forma, a abertura não deverá ser muito estreita como isso vai impedir de injecção adequada. Pode-se determinar a melhor combinação de orifício de pressão por bombeamento de ar numa placa de Petri com água. As bolhas resultantes devem estar em uma única linha, mas não em linhas múltiplas. Demonstramos este no vídeo. Em terceiro lugar, a incubação do peixe nos anestésicos é crítica. O peixe não deve ser mantido por mais tempo do que 2 minutos nos anestésicos. Isso vai dificultar a taxa de recuperação após a injeção. Em quarto lugar, o local da incisão é crítica para dispersar completamente o líquido injectado. A região ventricular ao longo do tecto óptico é maior acima da linha média e fica mais estreito lateralmente. Portanto, o experimentador deve gerar a ranhura no crânio, perto da linha média e apenas caudal ao crânio placa que cobre a região telencefálica. Uma das vantagens do injectio cerebroventricularMétodo N (IMV) é a sua rapidez. IMV é um método rápido para ensaio da função dos genes. Esta característica é importante e útil, quando comparado com a geração de linhas transgénicas para estudos funcionais, que geralmente levam vários meses. Além disso, IMV leva a uma distribuição uniforme do líquido injectado e, por conseguinte, fornece uma manipulação relativamente minuciosa da actividade do gene, quando comparado com injecções focais ou electroporação. Com IMV, vários genes podem ser derrubados simultaneamente por que prepara a injeção mistura contendo morpholinos múltipla oligonucleotídeo. IMV pode ser utilizada para injectar diferentes concentrações de uma dada oligonucleótidos morfolino, e, portanto, pode ser usado para analisar os fenótipos hypomorphic. Finalmente, este paradigma de injecção não provoca toxicidade ou comprometer a sobrevivência dos animais. A técnica IMV pode ser expandida para outros tipos de estudos, como a injeção de peptídeos moduladores, drogas, plasmídeo de DNA ou RNA modulatory molecules ou outras substâncias que possam afetar a fisiologia das células. Assaying combinação de moléculas e realizando análises de dose-resposta são possíveis utilizando o nosso método, o que permite estudar fenótipos hypomorphic. Com essas propriedades, IMV revela-se um ensaio rápido e fácil para os estudos de expressão no cérebro adulto peixe-zebra, e abre-se triagem rápida e análises funcionais. O cérebro do peixe-zebra adulto pode constitutivamente produzir novos neurônios ao longo de todo o eixo rostrocaudal e também pode regenerar após lesões traumáticas. Isto está em contraste gritante com cérebros de mamíferos com a neurogênese limitado e se em tudo, bastante pobre capacidade regenerativa. Essa atividade de células-tronco generalizada e capacidade de recuperação faz paulistinha um organismo modelo útil para a compreensão dos programas moleculares necessários para a regeneração do sistema nervoso central, que estão atualmente em grande parte desconhecido. Portanto, a investigação da base molecular da capacidade regenerativa do zebrafish cérebro é um campo de pesquisa que pode explicar a diferença fundamental como peixes e mamíferos cérebro reagir após uma lesão, e também dotar caminhos para terapias médicas regenerativas em seres humanos. Para entender a infra-estrutura molecular de vertebrados plasticidade cerebral e na regeneração, as células gliais servir como uma área de pesquisa importante, pois são os progenitores neurogênicas 3,8,20. Assim, utilizando a técnica de IMV para alterar a função de genes nas células da glia radial do cérebro zebrafish é fundamental para elucidar como o cérebro de peixe pode acoplar atividade progenitor a neurogênese adulta eficiente e resposta regenerativa. Mostrámos recentemente o envolvimento e exigência de vários factores e caminhos de sinalização em resposta a neurogénese regenerativa do peixe-zebra cérebro adulto 24,26,27, e estes estudos foi tornada possível pela utilização do método de IMV. No geral, o conhecimento que adquirimos a partir de zebrafish cérebro poderia ser aproveitada para impor regenecapacidade operatória para as células gliais mamíferos que reagem aos ferimentos e, portanto, ajudar a projetar terapias clínicas para distúrbios neurológicos humanos e lesões agudas.

Neurogênese adulta é uma característica comum aos vertebrados, no entanto o seu grau de prevalência e eficiência varia de acordo com a filogenia 1,2,3,4,5,6. Por exemplo, os cérebros de mamíferos adultos contém regiões de células-tronco em grande parte restritas a parte frontal do cérebro 7,8, enquanto o peixe-zebra teleost contém dezesseis domínios de células-tronco diferentes e zonas neurogênicas associados em todo o seu cérebro 4,5,9,10. Esta variação entre mamíferos e peixes-zebra pode refletir uma disparidade nos mecanismos de manutenção de células-tronco ea capacidade neurogênica de células progenitoras. A competência ao longo da vida do peixe-zebra para a produção de neurônios no cérebro também pode representar implicações clínicas como os mecanismos moleculares empregados por zebrafish cérebro poderia ser aproveitada para aplicações terapêuticas para combater as doenças neurodegenerativas em humanos. Várias células estaminais zonas do cérebro de peixe zebra adultos foram analisados ​​e foi demonstrado que océlulas que revestem a superfície ventricular dessas regiões servem como células progenitoras 9,11-20. Análises detalhadas no telencéfalo peixe-zebra, por exemplo, identificou as células gliais radiais, os quais delimitam a superfície do ventrículo desta região do cérebro a ser progenitores neurogénicos 19, 20. Isso vale para outras regiões, como o cerebelo eo tecto óptico, onde ventricularly localizado células gliais fornecem a entrada neurogênica 16,21. Para este fim, a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam a competência neurogénica generalizada no cérebro de peixe-zebra adulto requer manipulação da expressão de genes nas células progenitoras. Vários métodos foram descritos anteriormente para a modulação da função do gene do peixe-zebra. Estes incluem a geração de linhas de transgénicos condicionais que expressam variantes desejadas de uma única proteína, injecções focais baseados plasmídeo acoplados a electroporação ou tratamentos químicos. Nós já projetou umMétodo para a administração de várias substâncias, incluindo oligonucleótidos morfolino ou proteínas do peixe-zebra para o cérebro adulto utilizando microinjecção cerebroventricular como uma maneira rápida e eficiente de modular a função do gene nas células ventriculares do adulto zebrafish prosencéfalo 22. Nos nossos estudos, in vivo morpholinos foram utilizados devido à sua química que envolve a molécula morfolino ligado covalentemente a arginina péptidos ricos de entrega, o que permite o fornecimento eficaz às células de interesse e sem necessidade de permeabilização extra, tal como electroporação 23. Isso permitiria que a segmentação completa do tecido desejado após a injeção, assim como o que foi observado em adulto zebrafish telencéfalo 22. Utilização de morpholinos in vivo são, portanto, superior à dos métodos já existentes, tais como o tecido alvo electroporação ou injecção focal de moléculas de ADN. Aqui, vamos demonstrar visualmente como podemos realizar esta operação e proporcionar umaprotocolo de passo-a-passo. Começamos com a explicação preparação da mistura de injecção e os peixes a ser injetado, e continuar demonstrando como o aparelho de injeção é configurada. Nós proporcionamos uma descrição do método de injecção cerebroventricular, que envolve a geração de uma incisão no crânio e injecção das morpholinos utilizando microinjetor. Também elaborar sobre os pontos críticos é preciso ser cauteloso durante todo o processo, declarando-os como otimização ou guias de solução de problemas.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

A manipulação da expressão de genes nos tecidos é necessária a realização de estudos funcionais. Neste trabalho, nós demonstramos a técnica de microinjecção (IMV) cerebroventricular como um meio de modular a expressão do gene do peixe-zebra, no cérebro adulto. Usando IMV, as substâncias podem ser administradas para o fluido cerebroventricular e ser completamente distribuído ao longo do eixo rostro-caudal do cérebro. Nós especial atenção para a utilização de oligonucleótidos anti-sentido morfolino, os quais são ferramentas potentes para derrubar a expressão do gene in vivo. Neste método, quando aplicado, morfolino moléculas são absorvidas pelas células que revestem a superfície do ventrículo. Essas células incluem as células gliais radiais, que atuam como progenitores neurogênica. Portanto, derrubando a expressão do gene nas células gliais radiais é de extrema importância para analisar a resposta neurogênese generalizada no peixe-zebra, e também proporcionar insights sobre como os vertebrados poderia sustentar neurogen adultoesis resposta. Tal entendimento também ajudaria os esforços para aplicações clínicas em doenças neurodegenerativas humanas e regeneração do sistema nervoso central. Assim, apresentamos o método de microinjeção cerebroventricular como uma maneira rápida e eficiente para alterar a expressão genética e resposta a neurogênese no cérebro anterior zebrafish adulto. Também fornecem dicas para solução de problemas e outras informações úteis sobre como realizar o procedimento IMV.

Microinjeção Cerebroventricular leva a ampla distribuição da solução injetada Usando o regime de fluxo de trabalho e técnica da microinjecção cerebroventricular representado na Figura 1, administrou-morfolino oligonucleótidos no cérebro adulto peixe-zebra. Um protocolo de injecção exacta leva à dispersão do líquido injectado em todo o cérebro e eficiente segmentação das células perto da superfície do ventrículo esquerdo (Figura 2A). Injecções onde o capilar de vidro, espeta o tecido cerebral terá um sinal fluorescente denso no ponto de injecção (Figura 2B). Se a quantidade injectada não é suficiente, o sinal fluorescente fraco será observado (Figura 2C). Microinjecção Cerebroventricular pode ser usado para derrubar a expressão do gene na região do ventrículo do cérebro de peixe zebra adultos Nós mostramos ªNa Vivo morpholinos podem penetrar algumas células no interior de diâmetros superfície ventricular e, portanto, podem ser eficazes para atingir as células ventriculares (Figuras 3A, 3B). Morfolino injecção pode expressão do gene knockdown uma vez que irá aliviar a produção da proteína correspondente (um exemplo é o PCNA como mostrado nas figuras 3C, 3D). Nós demonstramos anteriormente que derrubar genes usando esta técnica leva a consequências funcionais durante a neurogênese adulta (Figuras 3E, 3F) ou resposta regeneração (Figuras 3G, 3H). Demonstrou-se que o intervalo de knockdown eficiente (mais de 50% knockdown) é alcançada cerca de 12 horas após a injecção do morpholinos 22. Observamos também que período knockdown eficiente é até aproximadamente 5 dias após a injeção da proteína PCNA 22. Mais de 70% knockdown foi visto até 3 dias após a injecção 22. As curvas knockdown são o dependenten o nível de expressão das proteínas endógenas e da eficiência das moléculas de morfolino, e tem que ser determinada para cada gene pelo experimentador. Em nossos estudos, nós não vimos que o procedimento IMV compromete a sobrevivência do animal, provavelmente porque a administração das moléculas morfolino é local e não causar uma toxicidade sistêmica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática da técnica de injecção cerebroventricular. (A) A injecção é realizada a partir da dorsal do peixe-zebra adultos (1) ao nível do tecto óptico (ot, 2). É feita uma incisão ao longo da placa do crânio tectal óptica com uma agulha de calibre 30 (3). Usando capilares de vidro, as moléculas morfolino são injectados no fluido do ventrículo esquerdo (4). Uma dispersão completa é umachieved instantaneamente (5). (B) A cânula e sua farpado final é mostrado em grande ampliação. (C) A orientação da agulha antes da incisão. (D) A incisão é circulado e delineada por linhas tracejadas. (E) A injecção capilar fica imediata e injecção é executada. Todos os painéis foram adaptados de ref. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Figura 2. A comparação da eficiência de injecção e precisão. (A) Um bom injecção leva a segmentação das células perto da superfície do ventrículo. (B) se o capilar de vidro é introduzido no tecido do cérebro, este irá gerar um sinal de fluorescência localizada centralmente. (C </strong&gt;) Se a quantidade de injeção é baixo, isso vai levar a sinal de fluorescência mais fraca. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Figura 3. . Penetração Morpholino, a eficiência de knockdowns genes e as conseqüências funcionais (A) GFP imunomarcação nas seções transversais telencefálicos de controle morpholino-injetados Tg (H2A: GFP) linhagem transgênica mostrando núcleos GFP-positivo. (B) GFP imunomarcação nas seções transversais telencefálicos da GFP antisense morpholino-injetado Tg (H2A: GFP) linhagem transgênica mostrando núcleos GFP-positivo. Note-se a diferença no sinal de GFP na região ventricular. v: ventrículo. (C) imunomarcação para PCNA controle morpholino-injetado cérebro que mostram a distribuição generalizada de células PCNA-positivos. ( <strong&gt; D) PCNA imunocoloração em PCNA antisense cérebros morpholino injetados mostram valores significativamente reduzidos de células PCNA-positivas, mostrando que IMV can knockdown genes endógenos. (E) BrdU e HuC / D imunomarcação no controle morpholino-injetado cérebro para determinar neurônios recém-nascidos depois de um experimento de pulso-chase BrdU descrito anteriormente 22. (F) BrdU e HuC / D imunocoloração em PCNA antisense cérebros morpholino-injetados para determinar neurônios recém-nascidos depois de um experimento de pulso-chase BrdU descrito anteriormente 22. (L) para baixo Knocking PCNA leva a uma redução significativa na geração de neurónios-nascidos, indicando que o IMV pode ser utilizado para os genes endógenos de knockdown, que dão origem a consequências funcionais. Todos os painéis foram adaptados de ref. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> .

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Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Neste artigo, é demonstrar um método para a manipulação da expressão de genes nas células dos ventrículos do telencéfalo peixe-zebra adultos utilizando oligonucleótidos anti-sentido morfolino. Apresenta-se este método como um protocolo eficiente e rápida, que pode ser utilizado para estudos funcionais no cérebro adulto vertebrado.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K visualizações.  Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden. Neste artigo, é demonstrar um método para a manipulação da expressão de genes nas células dos ventrículos do telencéfalo peixe-zebra adultos utilizando oligonucleótidos anti-sentido morfolino. Apresenta-se este método como um protocolo eficiente e rápida, que pode ser utilizado para estudos funcionais no cérebro adulto vertebrado.

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Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Neurociência

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

Na Vivo Monitoramento de expressão de Gene relógio circadiano no núcleo supraquiasmático do Mouse usando a repórteres de fluorescência

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...