Os autores gostariam de agradecer a todos os membros dos laboratórios do Dr. Barletta e Poderes Dr. pelos comentários úteis durante o desenvolvimento do protocolo. Agradecemos Wendy Austin para discussões úteis e revisão do manuscrito. O trabalho descrito neste manuscrito foi financiado por doações piloto de sementes para cada investigador listados acima, da Universidade de Nebraska-Lincoln Center Biologia Redox (pai concessão # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI). Além disso, podemos agradecer ao Dr. Ofelia Chacon do fornecimento de fundos a partir de sua concessão R21 (1R21AI087561-01A1) para fontes de pesquisa e de apoio Sr. Halouska do salário parcial de padronizar as técnicas de RMN incluídos nesta publicação.

1. Texto protocolo Este protocolo destaca a adaptação da metodologia de RMN de M. tuberculose (Classe agente III). Portanto, as práticas do Nível de Biossegurança 3 (BSL3) precisam ser seguidas na condução M. pesquisa da tuberculose em um laboratório certificado anualmente. A exposição a aerossóis gerados laboratório é o risco mais importante encontrado por pessoas que trabalham com esses microrganismos. Os seguintes procedimentos são realizados na instituição, e variações podem existir com base em recomendações do Comitê Institucional de Biossegurança. Pessoal comum equipamento de proteção será composto de um terno Tyvek, gorro, botas, máscara N95, óculos de protecção, luvas e um par de luvas de borracha nitrílica dupla. Trabalhos que impliquem M. culturas de tuberculose e / ou manipulações com M. aberto tuberculose recipientes é realizado na A2 tipo ou cabine de segurança biológica B2. Plástico coberta de papel absorvente é colocado no wempo de superfície. Todos os materiais / materiais a serem eliminados ou removidos da instalação tem de ser colocadas em dois sacos de risco biológico e descontaminados em autoclave. As superfícies de trabalho e equipamentos utilizados dentro do armário (FastPrep-24 lise homogeneizador, espectrofotômetro, balde com gelo, etc) devem ser desinfetados após cada sessão de trabalho com Amphyl 1% (agente, tuberculocida bactericida, fungicida e viricida). M. culturas de tuberculose deve ser colocada sob contenção dupla para o transporte de equipamentos de maior porte localizados fora da cabine de segurança biológica, tais como freezers, incubadoras, centrífugas e refrigeradores. A centrifugação é conduzida com segurança fechados copos e tubos O-ring de enroscar. Para análise adicional fora do laboratório BSL3, extractos livres de células são filtradas através de um filtro de 0,2 | iM ou de calor microorganismos mortos, a 95 ° C durante 15 min. Duas amostras são plaqueadas a verificar a ausência de unidades formadoras de colónias antes da remoção de contenção. <ol><li> Transferir 110 ml de Middlebrook 7H9 meio completo contendo polissorbato 80 (Tween 80 para evitar aglomeração) caldo (MADC-TW) ou de um meio adequado para um frasco Erlenmeyer de 250 ml. Culturas em triplicado são rotineiramente cultivadas por condição quando se utiliza 13 C-metabolitos, e 10 culturas idênticas são cultivadas para 1D 1 H NMR profiling. Por duas condições (por exemplo, com e sem a adição da droga), o volume duplo de cultura de cada repetição podem ser cultivadas e dividida em duas culturas idênticas. Todos os reagentes e soluções receitas são fornecidos no final do protocolo. </li><li> Inocular caldo com 0,150 ml de M. tuberculose estoque de glicerol 50% (deixar descongelar em gelo). Veja a Nota 1 abaixo. </li><li> Deixe que a cultura crescer a 37 ° C com agitação a 100 rpm durante cerca de 6 dias (DO600 0,6-0,8). Nota 2 abaixo. </li><li> Se não antibióticos, acréscimos ou tratamentos alternativos são necessárias outras, as culturas estão prontas para serem colhidas. Se os tratamentos forem utilizados, continuardiretamente para a Etapa 5. Remover uma amostra de 0,5 ml de cada frasco, transferir para um tubo de microcentrífuga e lugar a 4 ° C durante a titulação da cultura e o controlo de qualidade: testes de contaminação, a análise fenotípica, os testes de PCR. Veja a Nota 3 a seguir. Neste ponto, siga para a Etapa 6. </li><li> Remover frascos de agitador e realizar o tratamento desejado (por exemplo, adicionar fármaco ou metabólito). Lugar flasks volta no agitador e incubar por um período adicional (por exemplo, 6-18 horas). No final deste tempo, tomar uma outra alíquota de 1,0 ml e determina OD 600. Remover uma amostra de 0,5 ml de cada frasco, transferir para um tubo de microcentrífuga e lugar a 4 ° C durante a titulação da cultura e do controlo de qualidade. </li><li> Colocar as culturas em gelo durante 5 min. Após este passo, deixa as células em gelo durante todo o protocolo restante. Culturas de colheita por centrifugação a 2000 xg e 4 ° C durante 15 min em tubos de 50 ml, utilizando uma centrífuga de bancada. Cada cultura exigirá quatro tubos com 25 ml cada (um total de 100 ml é necessária para obter adequada de sinal-para-ruído de 2D 1 H-13 C experiências de RMN, onde apenas 50 ml por cultura é necessária para 1D experimentos 1 H RMN). </li><li> Lava-se cada pelete de células duas vezes com gelado DDH 2 O (aproximadamente 15 ml da primeira vez e 10 ml na segunda vez) pelos parâmetros de centrifugação acima descritas. Para a segunda lavagem, combinar as alíquotas de 10 ml para dentro do tubo mesmo antes da fiação. Ressuspender o sedimento de células, num volume final de 1,0 ml DDH 2 O (necessidade de ajustar para o volume de sedimento de células). Se uma única suspensão de células livres de aglomeração é desejado nesta etapa, as células podem ser brevemente sonicada e / ou passada através de uma agulha de calibre 27, três vezes. Em alternativa, a pelete de células podem ser congeladas a -80 ° C e armazenados até posterior processamento. Neste último caso, as peletes congelados foram descongelados em gelo antes da ressuspensão. Ressuspender as peletes de células, num volume final de 1,0 ml DDH 2 O como indicado acima. </li><li> Transfer a 1,0 ml de suspensão de células para um tubo de tampa de rosca contendo 2,0 ml de lise matriz B (esferas de sílica 0,1 mm). Coloque o homogeneizador FastPrep-24 lise dentro do gabinete de biossegurança. Coloque as amostras para o suporte de amostras, assegurando a retenção falou placa na parte superior do tubo. Processe as amostras para 60 seg no homogeneizador a uma regulação da velocidade de 6 m / seg. </li><li> Girar as amostras numa microcentrífuga a 15.000 xg e 4 ° C durante 10 min para sedimentar os detritos celulares e células intactas. </li><li> Remover o sobrenadante da amostra e passagem através de um filtro de seringa (0,2 um) em um tubo estéril. 0,1 ml da amostra de placa (ou de uma parte representativa da amostra, como por exemplo 10%) em ágar MADC para verificar que não existem células viáveis. Os investigadores também podem realizar mais do que um passo de filtração e / ou verificar a presença de células viáveis ​​nos extractos utilizando procedimentos de coloração live-mortos, de modo a prevenir ou identificar quaisquer problemas potenciais de biossegurança. Congele as amostras num banho de gelo seco-etanol para armazenarà temperatura de -80 ° C até estarem prontas para ser liofilizada e processada numa instalação de RMN. </li><li> Após 2 meses, verificar as placas a fim de verificar a ausência de unidades formadoras de colónias. Se o não CFU são encontrados, as amostras podem ser retiradas de laboratório BSL3. Uma análise adicional é levada a cabo numa instalação de RMN padrão, que normalmente serve de multi-utilizadores e opera sob nenhumas exigências específicas de confinamento. </li><li> Liofilizar as amostras até à secura e, em seguida ressuspender em 0,7 ml de tampão de RMN e transferir para um tubo de microcentrífuga. Centrifugar durante 3 minutos a 13.000 x g. Remover 0,6 ml e transferir para um tubo de RMN de 5 mm. Alternativamente, amostras liofilizadas poderia ser enviado para uma instalação externa como não-biológicos perigosos amostras regulares. </li><li> RMN dados são recolhidos imediatamente. Apesar de todas as precauções, enzimas activas podem estar presentes na amostra e não é geralmente estável durante longos períodos de tempo. As mudanças no espectro de RMN são perceptíveis quando as amostras são deixadas à temperatura ambiente ou a 4 ° C para mminério de 1 semana. Além disso, a coleta de dados de RMN é alternado entre tratados e não tratados droga culturas, onde as amostras são selecionados aleatoriamente de cada categoria. Isto evita viés desnecessário porque uma categoria particular, tinha um longo atraso antes de os espectros de RMN foram coletados. Uma tendência nos dados que ocorreria se os espectros de RMN para todas as amostras não tratadas foram recolhidas em primeiro lugar, e, em seguida, seguido pelas amostras de drogas tratados. Se as amostras não são capazes de ser imediatamente analisada por RMN, as amostras devem ser armazenadas em tubos Eppendorf de 1 ml a -80 ° C. </li><li> Depois de inserir as amostras em um BACS-120 amostra de calibração de instrumentos changer, que envolve passos de rotina a tais como bloqueio, calço, ajustar e otimização do comprimento de pulso de 90 °, é necessário para maximizar a qualidade dos resultados. Um exemplo simples é utilizado para calibrar o comprimento de impulso 90 ° e afinar o instrumento para as amostras restantes. Bloqueio, calços, e RMN de coleta de dados para cada amostra é usin automatizadog ICONNMR e gradshim. </li><li> A 1D 1 H espectro NMR é recolhida utilizando o Bruker zgesgp sequência de impulsos com supressão de água usando escultura de excitação. Um total de pontos de 32k de dados com uma largura de varredura de 5482.5Hz, 128 exames e 16 exames fictícios são usados. Um 2D 1 H-13 C espectro HSQC são coletados usando o Bruker hsqcetgp seqüência de pulsos. Um total de 2048 pontos de dados com uma largura de varredura de 5000,0 Hz é coletado ao longo da dimensão direta H 1, e 64 pontos de dados, com uma largura de varredura de 18864,9 Hz ao longo da dimensão indireta C 13. O espectro é coletada com 128 exames e 16 exames falsos para obter bom sinal ao ruído. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig1.jpg" /> Figura 1. Um diagrama de fluxo dos procedimentos experimentais é apresentada. RMN tampão Solução estoque de 50 mM fosfato de potássio lustreer com 50 uM TMSP: <ul><li> 2,17 g de K 2 HPO 4 (fosfato de potássio dibásico) </li><li> 1,70 g de KH 2 PO 4 (fosfato de potássio monobásico) </li><li> 7,86 mg de sódio-3-trimetilsilil-(TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98%)) </li><li> Dissolver em 500 ml de &quot;100%&quot; D 2 O </li><li> A solução final deve ser a um pH 7,2 (não corrigido) </li></ul> MADC-TW ou MOADC-TW (1 L) <ul><li> 4,7 g Middlebrook 7H9 caldo de base </li><li> 900 ml DDH 2 O </li><li> 2 ml de glicerol </li><li> Misturar os componentes e autoclavagem durante 25 minutos. Líquido fria ao toque e adicionar as seguintes soluções: </li><li> 100 ml ADC MADC na preparação ou 100 ml OADC ao preparar MOADC </li><li> 2,5 ml de Tween 20 a 80% (em alternativa, 1 ml de não-metabolizável Tyloxapol 20%) </li><li> 10 ml de cicloheximida 1% </li></ul> ADC (1 L) <ul><li> 20 g de D (+)-Glucose </li><li> 50 g de BSA FracçãoV </li><li> 8,5 g de NaCl </li><li> 800 ml DDH 2 O </li><li> Dissolver em conjunto, ajustar o volume para 1 litro e esteriliza com filtro de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C. </li></ul> Como alternativa, para preparar OADC (1 L), adicionar todos os componentes listados acima, mais 50 ml de ácido oleico de 1% (receita a seguir faz a 250 ml de lote). Dissolver em conjunto, ajustar o volume para 1 litro e esteriliza com filtro de 0,2 um. Garrafa necessita de ser envolvido em folha de alumínio e armazenar a 4 ° C. <ul><li> 2,5 g Ácido oleico </li><li> 250 ml de NaOH 0,2 M </li><li> Ácido oleico degelo (solidifica após refrigeração) por aquecimento a 55 ° C durante 10 min e adicionar a uma solução de NaOH e de calor, com agitação durante 60 min. Conservar em frascos de vidro esterilizados que são enrolados em papel alumínio. Garrafas de vedação com parafilme e armazenar a 4 ° C. </li></ul> Se preferir, você pode comprar comercial BD BBL Middlebrook ADC ou OADC com o enriquecimento de catalase. Cicloheximida 1% (100 ml) </strong&gt; <ul><li> 1 g cicloheximida </li><li> 100 ml DDH 2 O </li></ul> Dissolver e esterilizar com filtro de 0,2 ^ m. Armazenar a 4 ° C. Atenção: cicloheximida é tóxico para lidar com extremo cuidado. 20% (v / v) de Tween 80 (100 ml) <ul><li> 20 ml de Tween 80 </li><li> 80 ml ​​DDH 2 O </li></ul> Alternativamente, pesar 20 g de Tween 80 (aproximadamente 18,9 ml, densidade 1,06 g / ml), para preparar uma solução a 20% w / v. Solução de calor a 55 ° C durante 30 min para dissolver e misturar completamente. Esterilizar o líquido com um filtro de 0,2 um. Armazene a solução final à temperatura ambiente. 20% (v / v) de tiloxapol (100ml) <ul><li> 20 ml Tyloxapol </li><li> 80 ml ​​DDH 2 O </li></ul> Alternativamente, pesar 20 g de tiloxapol (aproximadamente 18,2 ml, densidade 1,1 g / ml), para preparar uma solução a 20% w / v. Solução de calor a 55 ° C durante 30 min para dissolve, e misturar completamente. Esterilizar o líquido com um filtro de 0,2 um. Armazene a solução final à temperatura ambiente. Nota 1: ações glicéricos de M. tuberculose são preparadas usando o seguinte protocolo. Estocagem de M. tuberculose <ul><li> Crescer M. tuberculose em 50 ml de MADC saturação (OD 600 = 1,5 a 2,0) a 37 ° C sob condições de agitação (100 rpm). Dependendo da estirpe, isso vai levar 7-14 dias. </li><li> Girar as amostras a 2000 xg, a 4 ° C durante 15 min para a cultura da pelota. Remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender em 6 ml de glicerol a 50% estéril. </li><li> Ml alíquota 1,5 em 4 frascos Corning criogênicas e etiqueta de forma adequada. </li><li> Imediatamente de flash frascos de congelamento em etanol banho de gelo seco / e armazenar a -80 ° C. </li></ul> Nota 2: A inoculação estirpe H37Rv (-80 ° C estoque até 1,5 anos de idade) em 70 ml de meios de comunicação MADC produz uma OD 600 &lt;/&gt; Sub de cerca de 0,6 após 5 dias de crescimento a 37 ° C sob condições de agitação (100 rpm) num agitador Innova 40. Nota 3: Para testar contaminação da cultura, os investigadores poderiam inocular uma alíquota de cultura em meio rico padrão e verificar a ausência de crescimento após incubação durante a noite. Rotineiramente, as culturas são semeadas em ágar MADC para observar a morfologia das colônias e examinar por contraste de fase microscopia. Se desejado, as culturas podem ser verificadas por PCR utilizando os iniciadores IS 6110, tal como descrito. 3 2. Resultados representativos Um exemplo que é bem preparada irá produzir um espectro de RMN semelhante ao representado na Figura 2. Este espectro é uma representação do M. tuberculose piscina metabólica tipo selvagem. Os metabolitos identificados são directa ou indirectamente associada com a via de D-alanina. Além disso, a magnitude das intensidades de pico é proporcional à concentração de metabólitos apresentamno extracto celular. Portanto, as mudanças nas intensidades de pico entre culturas não tratadas, tratamento medicamentoso, e cepas mutantes podem indicar perturbações em metabolitos e vias metabólicas. O M. tuberculose 1D 1 H RMN foram obtidos num espectrómetro Bruker Avance 500 MHz equipado com uma tripla ressonância criossonda gradiente, Z-eixo. O espectro contém ca. 400 picos, a partir da qual foi possível identificar e quantificar 40-50 metabolitos, incluindo aminoácidos, precursores de nucleótidos, e intermediários de ácido cítrico e glicolíticas. Um trocador BACS-120 amostra com software Bruker Icon foi usado para automatizar a coleta de dados de RMN. 1D 1 H RMN foram obtidos utilizando escultura de excitação de 4 a remover eficientemente o solvente e manter uma linha de base plana, eliminando qualquer necessidade de recolha de linha de base, que pode induzir a artefactos em análise subsequente componente principal (PCA) ou ortogonal análise discriminante mínimos quadrados parciais (OPLS- DA). A 1D 1 H espectro de RMN é recolhida a 25 ° C, com uma largura de espectro de 5482,5 Hz e pontos de 32K de dados. Um total de 16 varrimentos do manequim e 128 scans foram utilizados para obter o espectro. A ACD Labs 1D software processador de RMN foi usado para semi-processar automaticamente todos os 1D 1 H RMN. Os espectros foram transformadas de Fourier, por fases, e referem-se ao pico TMSP (0,0 ppm). O pacote de software foi utilizado para NMRpipe individualmente processar a 2D 1 H-13 C Os espectros de RMN e analisados ​​com NMRDraw. A Bruker FID ficheiro de dados foi primeiro convertido para um formato de arquivo reconhecível por NMRpipe e, em seguida, a análise do espectro foi transformada de Fourier, a fase corrigida, e zero preenchido. Os picos observados no RMN 1 H RMN 1D e espectro de 1 H-13 C espectro de RMN 2D são atribuídos aos metabolitos específicos utilizando 1 H e 13 C tolerâncias desvio químico de 0,05 e 0,50 ppm, respectivamente, e o Madison Metabolomics Consortium Database (MMCD ), <sup&gt; 5 a BioMagResBank, 6 e a base de dados humana Metaboloma. 7 Especificamente, os espectros de RMN de 1D e 2D são manualmente pico-escolhido, em que a lista de pico de deslocamentos químicos de RMN é então enviado para a base de dados humana Metaboloma. Os metabolitos identificados pela base de dados Metaboloma humano são designados para o espectro de RMN de base em ambas a maximização do número de correspondência de ressonâncias de RMN e pertencente a uma rede metabólica. Cada composto ou metabolito tipicamente tem pares múltiplos CH e ressonâncias de RMN correspondentemente múltiplas. Assim, quanto mais destas ressonâncias de RMN que são observados no espectro de RMN experimental, o mais provável é o metabolito presente. Do mesmo modo, identificar metabolitos múltiplos associados com o mesmo percurso aumenta a probabilidade de as atribuições correctas. A presença de metabolitos e vias metabólicas são verificados com a Enciclopédia de Kyoto de genes e genomas (KEGG) 8 e as bases de dados MetaCyc. 9 Mycobacterium smegmatis é um sistema modelo útil para o M. tuberculosis e outras micobactérias patógenos. Como já descrito, amostras de M. smegmatis também poderia ser rompidas por sonicação 10. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig2.jpg" /> Figura 2. 1D 1 H espectro NMR de Mycobacterium tuberculosis extrato celular. Picos de RMN metabolitos associados representativos são rotulados. As abreviaturas são as seguintes: AMP, fosfato de mono adenosina; α-Kg, α-cetoglutarato; Glu, glutamato, e Ala, alanina.

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis.">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates.">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function:+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase.">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li><li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection.">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis.">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li><li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1.">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria:+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system.">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li><li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(LC-MS)+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery.">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li><li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy:+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox.">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li><li>Simpson, R. J., Inglis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).</li><li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis.">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li><li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis:+an+unexpected+frontier.">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li><li>Who. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Organization.">Health Organization.</a> Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).</li><li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensively+drug-resistant+tuberculosis.">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um número significativo de estudos analisaram os perfis transcriptomic e proteômica de M. tuberculosis, sob uma variedade de ensaios in vitro e in vivo. 11-16 Em última análise, as alterações na expressão de genes e a actividade da enzima levar a variações nas concentrações de pequenas moléculas de peso molecular. A descrição completa destes compostos constitui o metaboloma. Assim, os efeitos da droga e as condições de crescimento diferentes sobre as vias me...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Enriquecimento ADC </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Changer Amostra </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RMN Bruker Avance </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Fração V </td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Bancada </td></tr><tr><td> Tubos da centrífuga </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml de polipropileno estéril </td></tr><tr><td> Os frascos criogênicos </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2,0 ml de polipropileno estéril </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG Científico </td><td> C-1189 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> D (+) - Glucose </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Óxido de deutério </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Garrafa de Erlenmeyer </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Base, estéril plana, policarbonato, 0,22 um tampa da membrana PTFE ventilada </td></tr><tr><td> Flash Flask Congelar </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Liofilizador </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4,5 L de bancada </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> New Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> Agitador de bancada </td></tr><tr><td> Lise Matrix B </td><td> Biomedicals MP </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Máquina de lise </td><td> Biomedicals MP </td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrífuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Bancada </td></tr><tr><td> Microcentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microcentrífuga 22R </td><td> Bancada </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 Broth </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> RMN tubos </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Enriquecimento OADC </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido oléico </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de Potássio Dibásico </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - Microcentrifugue 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Selado e polipropileno </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Com bio-certificadas capas </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Sódio-3-trimetilsilil-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge Isotope </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Cubetas Espectrofotômetro </td><td> Corda salva-vidas </td><td> LS-2410 </td><td> 1,5 ml de poliestireno, 2 lados claros </td></tr><tr><td> Seringa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Estéril, 3 ml de Luer-Lok </td></tr><tr><td> Filtrar seringa </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> 0,2 mM de acetato de celulose estéril </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation of mycobacterium tuberculosis extracts for nuclear magnetic resonance metabolomic studies

Mycobacterium tuberculosis é uma das principais causas de mortalidade em seres humanos em escala global. O surgimento de ambos multi-(MDR) e-(XDR) resistentes à drogas-cepas ameaça descarrilar os esforços atuais de controle da doença. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver drogas e vacinas que são mais eficazes do que aqueles atualmente disponíveis. O genoma de M. tuberculose tem sido conhecida há mais de 10 anos, ainda existem lacunas importantes no conhecimento da função dos genes e essencialidade. Muitos estudos têm utilizado uma vez que a análise da expressão do gene, tanto a nível transcriptomic e proteômica para determinar os efeitos das drogas, oxidantes, e condições de crescimento sobre os padrões globais de expressão do gene. Em última análise, a resposta final destas alterações é reflectido na composição metabólica da bactéria incluindo alguns milhares de pequenos produtos químicos de peso molecular. Comparando os perfis metabólicos de tipo selvagem e estirpes mutantes, quer não tratadas ou treated com um fármaco particular, podem efectivamente permitir a identificação do alvo e pode levar ao desenvolvimento de novos inibidores com actividade anti-tuberculoso. Da mesma forma, os efeitos de duas ou mais condições do metaboloma pode também ser avaliada. Ressonância magnética nuclear (RMN) é uma tecnologia poderosa, que é utilizado para identificar e quantificar os intermediários metabólicos. Neste protocolo, os processos para a preparação de M. extractos de células de tuberculose para análise de RMN são descritos metabolômica. As culturas de células são cultivadas em condições adequadas e exigidas Biossegurança Nível 3 de confinamento, uma colhidas e submetidas a lise mecânica, mantendo a temperaturas frias para maximizar a preservação de metabolitos. Os lisados ​​de células são recuperadas, filtrado esterilizado e armazenado a temperaturas ultra-baixas. Alíquotas destas extractos celulares foram semeadas em agar Middlebrook 7H9 para unidades formadoras de colónias para verificar a ausência de células viáveis. Após dois meses de incubação a 37 ° C, na ausência de vicolónias capazes são observadas, as amostras são removidas da unidade de contenção para o processamento a jusante. Os extratos são liofilizadas, ressuspensas em tampão de deuterado e injectada no instrumento de RMN, a captura de dados espectroscópicos que é então submetida a análise estatística. Os procedimentos descritos podem ser aplicados tanto para unidimensional (1D) 1 H NMR e de duas dimensões (2D) 1 H-13 C análises de RMN. Esta metodologia proporciona mais fiável de identificação de baixo peso molecular e do metabolito mais fiáveis ​​e sensíveis análises quantitativas de composições de extracto de células metabólicas de métodos cromatográficos. Variações do processo descrito a seguir ao passo de lise de células pode também ser adaptado para análise proteômica paralelo.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

O perfil de metabolômica<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; É determinada após crescimento em culturas em caldo. As condições podem ser variadas para testar os efeitos de suplementos nutricionais, oxidantes e agentes anti-tuberculose no perfil metabólico deste microrganismo. Procedimento para a preparação de extracto é aplicável tanto para 1D<sup&gt; 1</sup&gt; H e 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; Análises de C NMR.

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

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15.2K visualizações.  University of Nebraska-Lincoln. O perfil de metabolômica Mycobacterium tuberculosis É determinada após crescimento em culturas em caldo. As condições podem ser variadas para testar os efeitos de suplementos nutricionais, oxidantes e agentes anti-tuberculose no perfil metabólico deste microrganismo. Procedimento para a preparação de extracto é aplicável tanto para 1D 1 H e 2D 1 H- 13 Análises de C NMR.

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Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Imunologia e Infecção

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infecção

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Análise de 18FDG PET-CT Imaging como uma ferramenta para estudar infecção por Mycobacterium tuberculosis e tratamento em primatas não-humanos

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...