Este ensaio molecular bacteriano da tuberculose responde a três perguntas-chave. Qual: Qual é a magnitude da carga da doença do paciente? Dois: Como a carga da doença do paciente responde à medicação anti-tuberculose?
E três: Qual é a relação entre a carga da doença e a resposta ao tratamento? Este ensaio produz um resultado quantitativo da carga de tuberculose do paciente, e mede como essa carga muda com o tratamento em pouco tempo. Com a modificação, essa metodologia pode ser aplicada a outros patógenos bacterianos.
Já desenvolvemos tecnologia semelhante para diagnóstico de micobactérias não intuberréuas e bactérias associadas à doença pulmonar obstrutiva crônica. Ao executar essa técnica pela primeira vez, assista ao vídeo e pratique os passos. É muito importante praticar com amostras que não são necessárias para os resultados diagnósticos dos pacientes.
A demonstração visual é fundamental porque simplifica o aprendizado e o domínio das etapas, especialmente as partes do método que são difíceis de explicar no texto. Comece preparando as culturas celulares. Em um banco de laboratório limpo ou cabine classe um, colher uma alíquota mililitro de fase exponencial Bacille Calmette-Guerin ou bcg cultura em tubos plásticos de 15 mililitros e fechá-los firmemente.
Ao preparar amostras de escarro do paciente, trabalhe em um espaço bem ventilado e siga as orientações no manual GL One Stop TB. Abra cuidadosamente o copo de espécime e a pipeta de um mililitro em tubos de centrífugas de plástico de 15 mililitros. Então, feche bem os tubos.
Transfira os tubos de amostra para um rack de retenção imerso em um banho de água pré-aquecido a 95 graus Celsius, certificando-se de que 3/4 de cada tubo esteja imerso. Ferva as amostras por 20 minutos. Em seguida, transfira os tubos para o banco para esfriar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Realize a extração de RNA em um capô de fumaça se usar um kit com clorofórmio fenol ou etanol de capital tumoral. O procedimento de RNA ilustrado aqui é o procedimento de extração de clorofórmio fenol. No entanto, métodos alternativos para extração de RNA também podem ser usados.
Transfira uma alíquota mililitro da amostra inativada de calor para tubos de 1,5 mililitros e espete 100 microliters de controle de extração em cada amostra. Feche os tubos e misture-os invertendo três vezes. Centrifugar os tubos a 20.000 vezes g por 10 minutos.
Em seguida, aspire o supernascer, deixando 50 microliters de sedimentos. Suspendemos o sedimento em 950 microliters de tampão de lise por pipetação e transferimos toda a suspensão para os tubos de matriz de lise fornecidos com o kit de extração de RNA. Feche bem os tubos e certifique-se de que eles estejam rotulados tanto na tampa quanto na lateral.
Em seguida, homogeneize as amostras por 40 segundos a 6.000 rpm. Centrifugar o lise a 12.000 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare tubos frescos de um mililitro, e adicione 300 microliters de clorofórmio.
Use uma pipeta de um mililitro para aspirar cuidadosamente o supernaente sem tocar na matriz de lise e transferi-la para o tubo com o clorofórmio. Vórtice os tubos por cinco segundos e deixá-los se contentar por cinco minutos ou até que três fases estejam claramente visíveis. Centrifugar os tubos a 12.000 vezes g durante cinco minutos.
Em seguida, pipeta cuidadosamente a fase superior e transfira-a para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microliters de gelo frio 100% etanol à amostra, feche o tubo e inverta-o três vezes para misturar. Incubar os tubos a menos 80 graus Celsius por 15 minutos ou a menos 20 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, carregue os tubos em uma micro centrífuga pré-resfriada e centrífuga por 20 minutos a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius. Descarte o supernascer, adicione 500 microliters de 70% de etanol gelado e centrífuga por mais 10 minutos a 13.000 vezes g. Descarte todos os supernaspentes.
E incubar os tubos a 50 graus Celsius por 20 minutos para secar a pelota de ácido nucleico, certificando-se de manter os tubos parcialmente abertos para permitir a evaporação do etanol. Em seguida, adicione 100 microliters de núcleo de água livre ao pelotização e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Vórtice a amostra por três segundos e proceda com a remoção de DNA ou armazená-la a menos 80 graus Celsius até estar pronta para uso.
O DNA preparado é uma mistura de acordo com as instruções do manuscrito e pipetas 11 microliters em cada tubo contendo extrato de RNA. Vórtice por três segundos e gire brevemente para remover quaisquer gotículas da parede do tubo. Em seguida, incubar o tubo a 37 graus Celsius por 30 minutos no bloco quente ou incubadora.
Após a incubação, adicione um microliter adicional de uma enzima do DNA diretamente ao tubo, e misture bem com o vórtice. Em seguida, incubar os tubos por mais 30 minutos a 37 graus Celsius. Descongelar e vórtice o reagente de inativação do DNA.
Em seguida, adicione 10 microliters a cada extrato de RNA. E incubar os tubos em temperatura ambiente por cinco minutos. Vórtice dos tubos três vezes durante a etapa de incubação.
Em seguida, centrifugar a mistura a 13.000 vezes g por dois minutos e transferir cuidadosamente o supernasal para um tubo livre de RNA de 1,5 mililitro, certificando-se de não tocar em nenhuma das matriz de inativação. Diluir todas as amostras de RNA desconhecidas de um a 10 na água livre do RNA, então, misture-as por vórtice por cinco segundos e girando-as brevemente para baixo. Descongele amostras de MTB e EC-RNA e faça diluições de sete e seis vezes, respectivamente, para uma curva padrão.
Prepare RT plus e RT menos PCR master mixes de acordo com as instruções do manuscrito. Vortex o RT plus misturar e transferir 16 microliters para cada tubo RT plus PCR. Em seguida, o vórtice rt menos misturar e adicionar 16 microliters em cada tubo RT menos PCR.
Adicione quatro microliters de extrato de RNA ou água e duplique nos tubos RT plus. A água é o controle não-modelo ou NTC. Adicione quatro microliters de extrato de RNA ou água aos tubos RT menos.
Carregue os tubos de reação na máquina PCR em tempo real, programe a reação conforme descrito no manuscrito e execute a reação. Para interpretar a resposta ao tratamento, use a curva padrão para converter valores de QC em carga bacteriana e calcular a resposta como a mudança na carga bacteriana durante o período de seguimento do tratamento. A queda da carga bacteriana após o tratamento significa uma resposta positiva, enquanto nenhuma alteração ou aumento da carga bacteriana implica uma resposta negativa.
Para verificar se todos os bacilos de M.tuberculosis eram inativados pelo calor, a densidade óptica das células foi medida e comparada com a das células vivas. Não foi observada alteração no OD ao longo do tempo para as amostras inativadas de calor que não indicam crescimento. Amostras inativadas por calor foram incubadas a 37 graus Celsius para determinar se o RNA se degrada após a inativação térmica das células.
Não foi encontrada diferença entre o RNA colhido imediatamente após a inativação do calor, e o RNA isolou um, dois, três e quatro dias depois em ambas as culturas BCG e tb positiva. Quando a enzima A do RNA foi exogenously adicionada às amostras, antes e depois da inativação do calor, a perda de RNA ocorreu em todas as amostras inativadas de calor ao longo de quatro dias de incubação. O efeito da inativação de calor no RNA ribossômico foi medido nas culturas BCG e na escarro de pacientes positivos da TB.
A carga bacteriana medida de cultura de controle foi maior do que a carga bacteriana combinada de cultura inativada por calor a 80 graus Celsius, 85 graus Celsius e 95 graus Celsius para amostras de BCG e escarro. A inativação térmica das amostras causa perda mínima de RNA, deixando RNA adequado para TB-MBLA a jusante e outros testes moleculares a jusante. A Microscopia Eletrônica de Transmissão foi usada para investigar se as células são líspidas pela inativação do calor.
A inspeção das células em ampliação cada vez maior revelou as paredes celulares intactas e os corpos lipídudos intracelulares visíveis. As células pareciam alongadas, mas não líssedas. Ao tentar este procedimento, é fundamental lembrar de adicionar o controle de extração, que controla quaisquer resultados falsos negativos devido à má extração de RNA.
Essa abordagem pode ser aplicada a bactérias associadas à doença pulmonar obstrutiva crônica, infecção por micobactérias não intuberculous e outros patógenos respiratórios. Os resultados quantitativos da TB-MBLA permitiram a modelagem matemática e farmaco de como os pacientes respondem a uma terapia de tuberculose. Esperamos aplicar a técnica no cuidado de rotina onde os pacientes com tuberculose estão sendo gerenciados.
