Este trabalho é suportado por concessões do Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e por Crohn e Colite Fundação de Canadá (CCFC).

1. Modelo murino de DSS-induzida colite aguda <ol><li> Adicionar dextran sulfato de sódio (DSS) para água potável autoclavado à concentração final desejada (1-5%) (wt / vol) (ie Para fazer uma solução de DSS 5%, adicionar 25 mg de pó de DSS para 500 ml de água esterilizada) . Solução estoque podem ser deixados em temperatura ambiente por até uma semana ou a 4 ° C até o uso. </li><li> Em uma capa de biossegurança, despeje solução DSS estoque em 50 mL Falcon tubos (um necessário por gaiola). Manter a solução de ações para tubos de recarga, quando necessário. </li><li> Substituir a água potável em cada gaiola do mouse com a solução de DSS (em 50 mL tubos Falcon) (A duração vai depender do regime de DSS que é usado. Por exemplo, usando de 6-8 semanas, do sexo masculino C57BL / 6 ratos, nós administrar um solução DSS 5% para um total de cinco dias). Camundongos não devem ter acesso a qualquer outra fonte de água. Camundongos de controle são dadas de água potável autoclavado sem DSS. </li><li> Pesar ratos diariamente e registrar a quantidade de DSS consumidos por dia. Top cadagarrafa para 50 mL após a gravação níveis DSS. Isto é para medir o volume aproximado de DSS consumida por gaiola por rato durante toda a duração do experimento. Em nossos estudos, utilizamos uma solução DSS 5% durante 5 dias com machos C57BL / 6 ratos. Perda significativa de peso, consistência das fezes alterado e sinais de sangue nas fezes são vistos como 3 º dia usando este esquema DSS particular. Durante a administração DSS, os ratos apresentam acentuada perda de peso (cerca de 5-10% de seu peso inicial no dia 5) com perda de peso superior a 20% do peso inicial com desidratação e diarréia ser o indicador fisiológico significativo que um animal é igual ou próximo ponto final. Se o animal é dado acesso à água normal após os 5 dias de DSS 5%, ele vai se recuperar dentro de 7 dias. Todos os experimentos devem ser aprovados pela instituição de origem animal comitê de ética e estar em conformidade com o Protocolo aprovado Utilização de Animais (AUP). </li><li> Durante a duração do experimento, um índice de atividade da doença (DAI)pontuação pode ser avaliado para avaliar a evolução clínica de colite. A DAI é a pontuação combinada de perda de peso em relação ao peso inicial, a consistência das fezes, e sangramento. Pontuações são definidos da seguinte forma: perda de peso: 0 (sem perda), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%) e 4 (&gt; 20%); consistência das fezes: 0 (normal), 2 (fezes), e 4 (diarréia); e sangramento: 0 (sem sangue), 1 (Hemoccult positivo), 2 (Hemoccult positiva e visual sangramento pellet), e 4 (sangramento grave, sangue ao redor ânus). DAI pode ser marcado por dia durante a duração do tratamento DSS. </li><li> No ponto de tempo de escolha, pesar e sacrifício camundongos. Ratos podem ser sacrificados por deslocamento cervical após a inalação de isoflurano ou por outro método aprovado pela instalação da instituição de origem animal. </li></ol> 2. Coletar amostras de tecido do cólon <ol><li> Expor o lado ventral do animal e molhar a área do abdômen com uma solução de etanol 70%. Neste ponto, consulte a Tabela 1 e anote umany sinais de sangramento retal (presença de sangue no orifício anal) ou prolapso retal em cada animal. </li><li> Uso padrão tesouras de dissecação de inciso do abdômen, fazendo uma incisão mediana ventral. </li><li> Localize os dois pontos e transecto do cólon tão perto da margem colorectal possível para libertar o cólon distal. </li><li> Cuidadosa e lentamente puxe todo o cólon, destacando-o do mesentério circundante. </li><li> Transecto os dois pontos na margem colonocecal para libertar a extremidade proximal do cólon. As fezes podem ser removidas por lavagem de cólon com PBS estéril usando uma agulha de gavage ligada a uma seringa de 3 mL ou 5 ou com cuidado apertando-lo usando um par de pinças dobrados / forceps. Usando todo o cólon, avaliar por danos (Veja Seção 3.1) </li><li> Amostras de tecido para análise histológica e outros ensaios pode ser feito cortando 0,5 centímetros a 1,0 cm de comprimento de fragmentos do cólon fazendo notar que a área da amostra é de (ie proximal, médio ou distal). </li><li> Amostras de tecidoa ser utilizado para os ensaios podem ser colocados individualmente em tubos de 1,5 mL eppendorf e congelados em nitrogênio líquido e armazenadas até utilização a -70 ° C. </li></ol> 3. Avaliação da gravidade da colite <ol><li> Escore de gravidade macroscópica ou doença terminal é avaliado por um observador imparcial utilizando um sistema de pontuação previamente publicados (Tabela 1). 9 A consistência das fezes pode ser avaliada usando um par de fórceps e pressionando as fezes para determinar a consistência. Para determinar a pontuação de sangue nas fezes, observe a cor das fezes (ou seja, fezes pretas versus luz fezes marrom) e validar ainda mais usando um teste Hemoccult. Usando o sistema de pontuação, determine uma pontuação para cada uma das condições. A pontuação final macroscópica para cada animal é a soma de cada pontuação individual. </li><li> Para avaliar os danos histológicos de gravidade colite, corte um pequeno fragmento (0,5 cm) do cólon, coloque em um cassete de tecido e mergulhe numa solução formalina a 10%. Prepare 5parafina mM incorporados seções transversais e secções mancha com hematoxilina / eoxin (H &amp; E), utilizando os procedimentos adequados. Fragmentos de cólon podem ser tomadas a partir da proximal, cólon médio, ou seção distal do cólon. </li><li> H &amp; E manchada secções de tecido do cólon são marcados por um observador cego usando um sistema previamente publicados para as seguintes medidas: cripta arquitetura (normal, 0 - distorção cripta grave com perda de criptas inteiro, 3), grau de infiltração de células inflamatórias (normal, 0 - denso infiltrado inflamatório, 3), espessamento do músculo (base da cripta fica na mucosa muscular, 0 - apresentam espessamento marcado muscular, 3), depleção de células caliciformes (ausente, 0 - presente, 1) e abscesso crypt (ausente, 0 - presentes , 1). 7 A pontuação dano histológico é a soma de cada pontuação individual. Deve-se notar que, ao contrário humana UC, abscessos da cripta não são características deste modelo e raramente são vistos; ulcerações microscópicas também são raras. Se seções cólon múltiplas forammanchado, escores histológicos entre as seções semelhantes devem ser usados ​​para determinar a pontuação final para cada área (ou seja, pontuação histológica no cólon proximal contra pontuação histológica no cólon distal). </li></ol> 4. Preparar soluções estoque de reagentes para testes <ol><li> Prepare uma solução de 50 mM de tampão fosfato de potássio pela adição de solução B (K 2 HPO 4, 8,7 g de fosfato de potássio dibásico em 1 L de dH 2 O) para a solução A (KH 2 PO 4, 6,8 g de fosfato monobásico de potássio em 1L de dH 2 O) até que um pH de 6,0 é conseguido. Soluções restantes podem ser armazenados em geladeira (2-8 ° C) até o uso futuro. </li><li> Prepare hexadeciltrimetilamônio brometo de buffer (HTAB) pela adição de 5 g HTAB em 1 L de tampão fosfato de potássio (50 mM, pH = 6,0). Aquecer lentamente para dissolver e armazenar de 2-8 ° C até o uso. Quando necessário, o calor para re-dissolver. </li><li> Prepare tampão de lise para homogeneização de tecido para análise de proteínas poradição de 10 mL de ácido tris-1M clorídrico (pH = 8,0), 6 mL de cloreto de sódio 5M e 2 mL de Triton X-100-182 mL de água destilada esterilizada. Triton X-100 é muito viscoso à temperatura ambiente e, portanto, deve ser suavemente aquecido antes do uso. O tampão de lise preparado pode ser armazenado a -20 ° C até o uso. </li></ol> 5. Preparação de amostras para ensaios <ol><li> Preparação de amostras para análise MPO. <ol><li> Remover amostras de -70 ° C e colocar no gelo. Registre o peso de cada amostra após a remoção de qualquer fezes ou gordura visível usando um fórceps curvado / pinça e coloque em um tubo de microcentrífuga Eppendorf de 2mL Safe-Lock (ou qualquer tubo que pode ser usado com um homogeneizador). Amostras devem ser mantidas no gelo em todos os momentos. É importante notar que os fragmentos de cólon similares devem ser utilizados a partir de cada réplica biológica (ie seções distal seções somente ou apenas proximal). </li><li> Adicionar homogeneizador bead a cada tubo de amostra. </li><li> Adicionar a quantidade adequada de buf HTABfer acordo com o peso do tecido. Se o peso do tecido é inferior a 25 mg, adicionar o buffer em uma proporção de 12.5mg/mL; se o peso do tecido é entre 25-50, adicionar na proporção de 25mg/ml. Se o peso do tecido é maior do que 50, adicionar tampão na proporção de 50mg/ml. </li><li> Homogeneizar com um homogeneizador de tecidos para 4 min a 30 Hz. Repita se o tecido não é totalmente homogeneizado. </li><li> Remover homogeneizador bead e solução de centrífuga por 6 min (13.400 xg, 4 ° C). </li><li> Recolher o sobrenadante e descartar o pellet resultante. Sobrenadante pode ser armazenada a -70 ° C até o uso. </li></ol></li><li> Preparação de amostras para análise de citocinas. <ol><li> Repita os passos 5.1.1. a 5.1.2. </li><li> Adicionar 50 ul de inibidor de protease cocktail (PIC) para 10 mL de tampão de lise preparado. </li><li> Adicionar 1 mL da PIC e solução tampão de lise para cada amostra independentemente do peso. </li><li> Homogeneizar durante 5 min a 30 Hz. Repita se o tecido não é totalmente homogeneizado. </li><li> Remover homogeneizador bead e centrifugar solutipor 5 min a 3300 x g. </li><li> Recolher o sobrenadante e descartar o pellet resultante. Sobrenadante pode ser armazenada a -70 ° C até o uso. </li></ol></li></ol> 6. Quantificação de marcadores inflamatórios <ol><li> Ensaio de atividade MPO <ol><li> Prepare o-dianisidina dicloridrato de solução (o-dianisidina) através da combinação de 16,7 mg de o-dianisidina dicloridrato, 90 mL de dH 2 O e 10 mL de tampão fosfato de potássio. Esta solução deve ser preparada para cada ensaio. </li><li> Adicionar 7 mL de homogeneizado de tecido (preparado na seção 5.1) em triplicado em uma placa de 96 poços. </li><li> Adicionar 50 mL da diluição H 2 O 2 (4 mL de 30% H 2 O 2 diluída em 96 mL de dH 2 O) à mistura o-dianisidina. </li><li> Use uma pipeta multi-canal para adicionar 200 mL da mistura o-dianisidina contendo H 2 O 2 a cada um dos poços. </li><li> Medir a absorvância a 450 nm usando um spectrophotómetros. Tome três leituras em intervalos de 30 segundos. </li><li> Calcular a atividade MPO. Atividade de MPO é medido em unidades (U) de MPO / mg de tecido, onde uma unidade de MPO é definida como a quantidade necessária para degradar a 1 mmol de H 2 O 2 por minuto em temperatura ambiente. Considerando que uma unidade (U) da MPO = 1 mol de H 2 O 2 dividido e que 1 mmol de H 2 O 2 apresenta uma mudança de absorbância de 1,13 x 10 -2 nm / min, unidades de MPO em cada amostra é determinada como variação de absorvância [ΔA (t 2-t 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). Para obter unidades por mg de tecido, use o tecido: a relação buffer. Por exemplo, se um tecido: relação de buffer de 50 mg / mL foi usado, em 7 mL de homogeneizado, não é de 0,35 mg de tecido. Portanto, para obter unidades por mg de tecido, dividir as unidades de MPO de 0,35. Um cálculo amostral utilizando valores de absorbância (nm) é incluída abaixo (assumindo que a amostra foi adicionado em triplicado): </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Amostra </td><td colspan="3"> Tempo 0 sec </td><td colspan="3"> Tempo de 30 seg </td><td colspan="3"> Tempo de 60 seg </td></tr><tr><td> A </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 1 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 3 &#39; </td><td> 1 &quot; </td><td> 2&#39;&#39; </td><td> 3 &quot; </td></tr><tr><td></td><td> 0,048 </td><td> 0,048 </td><td> 0,051 </td><td> 0,061 </td><td> 0,061 </td><td> 0,065 </td><td> 0,074 </td><td> 0,073 </td><td> 0,078 </td></tr></tbody></table><ol class="lroman"><li> Média em tempo de 0 seg = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 nm </li><li> Média no tempo de 30 seg = 0,0623 nm </li><li> Média no tempo de 60 seg = 0,075 nm </li><li> Variação de absorvância (ΔA) 0-30 tecido seg / mg (assumindo que 50 mg / mL de tecido: relação buffer) = [(0,0623-0,049) / (1,13 x 10 -2)] / 0,35 = 3,363 </li><li> Mudança em absorverdade (ΔA) 30-60 tecido seg / mg = 3,211 </li><li> * Atividade MPO (U / mg tecido) = média de ΔA (0-30) e ΔA (30-60) = 3,287 </li></ol><ol start="2"><li> Quantificação de citocinas pró-inflamatórias por ELISA <ol><li> Citocinas (IL-1β, IL-6 e TNF-α), os níveis são determinados utilizando comercialmente disponíveis de ensaio imunoenzimático (ELISA) kit (Quantikine murino; R &amp; D Systems). </li><li> Valores de absorbância de cada ELISA é normalizada utilizando um ensaio de proteína Bradford respectivos a cada amostra e é expressa em unidades de pg / mg de proteína. </li></ol></li></ol> 7. Resultados representante Administração de um esquema apropriado DSS irá induzir colite aguda em camundongos. Durante a duração do tratamento DSS, DAI pode ser usado para analisar e avaliar a evolução clínica da doença. Animais tratados com DSS irá mostrar perda de peso significativa em comparação com seus pesos iniciais, fezes moles e fecalsangramento (Figura 1). Após sacrifício e exame do cólon, a gravidade da colite é macroscopicamente marcou com base na redução do comprimento do cólon, sangramento do cólon, sangramento fecal, afrouxamento da consistência das fezes, e sinais de sangramento retal comparados aos controles tratados apenas com água (Figura 2 e Tabela 1). Seções transversais de amostras de tecido do cólon corado com H &amp; E terá maiores escores histológicos para DSS-tratados dois pontos em relação a água tratada com controles (Figura 3). Para melhor caracterizar a extensão da inflamação em camundongos tratados com DSS, a atividade de MPO pode ser avaliado a partir de amostras de tecido do cólon homogeneizada. DSS-tratados dois pontos terá maior atividade MPO comparados aos controles (Figura 4). Além disso, esta está associada com níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Figura 5). <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig1.jpg" /><br/&gt; Figura 1. Male, camundongos C57BL / 6 receberam DSS 5% em água potável durante 5 dias. Pontuações DAI foram avaliados diariamente para cada animal e foram em média por dia para cada grupo (média ± SEM, n = 4 ratos / grupo). <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig2.jpg" /> Camundongos figura 2. C57BL / 6 receberam DSS 5% em água potável durante 5 dias. Camundongos controle receberam água sem DSS. Macroscópica danos pontuação / pontuação da severidade da doença foram avaliados às cegas no dia 5 pós colite induzida por DSS. Dois pontos isolados de camundongos que receberam DSS têm escores mais elevados danos macroscópicos (sangramento retal, prolapso retal, diarréia, sangramento do cólon), indicando maior gravidade da doença (média ± SEM, n = 4 ratos / grupo). <img src="/files/ftp_upload/3678/3678fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Camundongos C57BL / 6 receberam solução DSS 5% em água potável a fim de induzir colite. Camundongos de controle<html> recebeu água sem DSS. (A) Escores histológicos foram cegamente registados com H &amp; E manchada secções de tecido do cólon coletadas sobre a administração de 5 dias pós-DSS. (B) DSS-tratados amostras mostram mais danos histológicos (infiltração mais celulares, mais de depleção de células caliciformes, maior a distorção / danos à cripta arquitetura) em comparação com (C) controles (média ± SEM, n = 4 ratos / grupo). Em (B) e (C), asterisco (*) indica área de depleção de células caliciformes e distorção da arquitetura da cripta; sinal de número (#) indica infiltração celular. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig4.jpg" /> Figura 4. Todos os animais foram sacrificados no dia 5 após a administração da SAD e amostras de tecido do cólon foram coletados para avaliar a atividade MPO. Gravidade da colite induzida por DSS está associada com maiores níveis de atividade de MPO em relação aos controles (média ± SEM, n = 4 ratos / grupo). _upload/3678/3678fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Além de maiores níveis de MPO, gravidade da DSS-induzida colite também está associada com um aumento do nível de inflamação pró-citocinas como IL-1β, IL-6, TNF-α (média ± SEM, n = 4 ratos / grupo). <table border="1"><tbody><tr><td> Contagem </td><td> Sangramento retal </td><td> Prolapso retal </td><td> Consistência das fezes </td><td> Sangue </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td><td> Normal </td><td> Normal </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Vermelho </td><td> Sinais de prolapso </td><td> Suave </td><td> Vermelho </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Vermelho Escuro </td><td> Prolapso clara </td><td> Muito suave </td><td> Vermelho escuro </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Bleeding bruta </td><td> Prolapso extensa </td><td> Diarréia </td><td> Negro </td></tr></tbody></t&gt; capaz Tabela 1. Severity Score macroscópica / Doença

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Não há conflitos de interesse declarados.

DSS colite é um modelo amplamente utilizado induzido quimicamente de inflamação intestinal. Neste modelo, os camundongos são dadas de água potável suplementado com DSS, que é pensado para ser tóxico para células epiteliais do intestino e perturbar a integridade da barreira mucosa. 10 Administração da SAD induz uma colite aguda que se caracteriza por fezes, sangramento fecal, e infiltração com granulócitos. DSS 10 Durante a administração, colite é normalmente associada com perda de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamento: </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Tubo de microcentrífuga Eppendorf Safe-Lock (2 ml) </td><td> eppendorf </td><td> 0030 120.094 </td><td></td></tr><tr><td> Biotek EL808 leitor de placas de absorbância </td><td> Biotek </td><td> EL808 </td><td></td></tr><tr><td> Dextran sulfato de sódio grau reagente sal (peso molecular 36,000-50,000 Da) </td><td> Biomedicals MP </td><td> 160110 </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 (software) </td><td> Biotek </td><td> Versão 1.10.8 </td><td></td></tr><tr><td> Brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5882-100G </td><td></td></tr><tr><td> Peróxido de hidrogênio, 30 wt solução.% Em água </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 216763 </td><td> Armazenar de 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Microtest plcomeu de 96 poços de fundo plano </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td><td> Para uso único </td></tr><tr><td> o-dianisidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-3252 </td><td> Sensível à luz. Armazenar de 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio dibásico </td><td> Caledon </td><td> 6620-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Merck Química </td><td> PX1565-1 </td><td></td></tr><tr><td> Protease cocktail inibidor </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8340 </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsten Carbide contas para Tissue Lyser II </td><td> QUIAGEN </td><td> 69997 </td><td></td></tr></tbody></table>

investigating intestinal inflammation in dss-induced model of ibd

Doença inflamatória intestinal (DII) engloba uma gama de patologias intestinais, o mais comum dos quais são a colite ulcerosa (UC) e Doença de Crohn (DC). Ambos UC e CD, quando presentes no cólon, gerar um perfil de sintomas similares que podem incluir sangramento, diarréia retal, dor abdominal e perda de peso. 1 Embora a patogênese da DII permanece desconhecida, é descrita como uma doença multifatorial que envolve tanto componentes genéticos e ambientais. 2 Existem inúmeros modelos animais e variável de inflamação do cólon que se assemelham a várias funcionalidades do IBD. Modelos animais de colite gama daqueles surge espontaneamente em estirpes sensíveis de certas espécies para aqueles que requerem a administração de concentrações específicas de colite indutores de produtos químicos, como dextran sulfato de sódio (DSS). Química induzida por modelos de inflamação intestinal são os modelos mais usados ​​e melhor descrito de IBD. Adminidemonstração de DSS na água potável produz colite aguda ou crônica, dependendo do protocolo de administração. 3 Animais dada a perda de peso DSS exposição e sinais de fezes moles ou diarréia, às vezes com evidências de sangramento retal 4,5. Aqui, descrevemos os métodos pelos quais colite desenvolvimento ea resposta inflamatória pode ser caracterizado após a administração de DSS. Estes métodos incluem a análise histológica de hematoxilina / eosina seções cólon manchado, medição de citocinas pró-inflamatórias, e determinação de mieloperoxidase (MPO), atividade que pode ser usado como um marcador da inflamação 6. A extensão da resposta inflamatória em estado de doença pode ser avaliada pela presença de sintomas clínicos ou por alteração na histologia nos tecidos da mucosa. Dano histológico do cólon é avaliado por meio de um sistema de pontuação que considera perda de cripta arquitetura, infiltração de células inflamatórias, músculo thickening, a depleção de células caliciformes, e cripta abscesso. 7 Quantitativamente, os níveis de citocinas pró-inflamatórias agudas inflamatórias, como a interleucina (IL)-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF)-α, pode ser determinada usando métodos convencionais de ELISA. Além disso, a atividade de MPO pode ser mensurado através de um ensaio colorimétrico e usado como um índice de inflamação. 8 Na colite experimental, a gravidade da doença é muitas vezes relacionada com um aumento na atividade MPO e os níveis mais altos de citocinas pró-inflamatórias. Gravidade e colite associada à inflamação danos podem ser avaliados através da análise de consistência das fezes e sangramento, além de avaliar o estado histopatológico do intestino usando hematoxilina / eosina secções de tecido do cólon. Fragmentos de tecido do cólon pode ser usado para determinar a atividade MPO e produção de citocinas. Juntas, essas medidas podem ser utilizadas para avaliar a resposta inflamatória intestinal emmodelos animais de colite experimental.

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Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

Modelos experimentais de doença inflamatória intestinal nos permitiram analisar a complexa inata e adaptativa respostas imunes associadas com a patogênese. Usando pontuação histológico, quantificação de citocinas pró-inflamatórias e atividade da mieloperoxidase, pode-se começar a avaliar essas respostas visto na doença inflamatória intestinal.

Investigando inflamação intestinal em DSS-induzida Modelo de IBD

Inflammatory bowel disease (IBD) encompasses a range of intestinal pathologies, the most common of which are ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease ...

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Research

JoVE Journal

Biology

66.7K visualizações.  McMaster University. Modelos experimentais de doença inflamatória intestinal nos permitiram analisar a complexa inata e adaptativa respostas imunes associadas com a patogênese. Usando pontuação histológico, quantificação de citocinas pró-inflamatórias e atividade da mieloperoxidase, pode-se começar a avaliar essas respostas visto na doença inflamatória intestinal.

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Catheterization of Intestinal Loops in Ruminants

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the outside world. As such, the intestine plays a pivotal role in immunosurveillance and protection from enteric pathogens. Investigating intestinal physiology and immunology commonly employs 'intestinal loops' as an experimental model. The majority of these loop models are non-recovery surgical procedures that study short-term (&lt;24 hr) changes in the intestine (1-3). We previously created a recovery intestinal loop model to specifically measure long-term (&lt;6 mo) immunological changes in the intestine of sheep following exposure to vaccines, adjuvants, and viruses (4). This procedure localized treatments to a specific 'loop', allowing us to sample this area of the intestine. A significant drawback of this method is the single window of opportunity to administer treatments (i.e. at the time of surgery). Furthermore, samples of both the intestinal mucosa and luminal contents can only be taken at the termination of the project. Other salient limitations of the above model are that the surgical manipulation and requisite post-operative measures (e.g. administration of antibiotics and analgesics) can directly affect the treatment itself and/or alter immune function, thereby confounding results. Therefore, we modified our intestinal loop model by inserting long-term catheters into the loops. Sheep recover fully from the procedure, and are unaffected by the exteriorized catheters. Notably, the establishment of catheters in loops allows us to introduce multiple treatments over an extended interval, following recovery from surgery and clearance of drugs administered during surgery and the post-operative period.

We describe a novel surgical method for catheterizing 'intestinal loops' within the ileum of sheep. Once animals have recovered from surgery and have cleared antibiotics and analgesics, multiple treatments can be deposited directly in loops via the catheters.

Cateterização de alças intestinais em Ruminantes

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the ...

Biologia

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Exteriorização Rat Mesentério: Um modelo para investigar a dinâmica celulares envolvidos na angiogênese

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Um modelo do rato de obstrução Intestinal parcial

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the active proliferation of intestinal stem cells located at the bottom of intestinal crypts. However, during events of acute intestinal injury, these active intestinal stem cells undergo cell death. Gamma irradiation is a widely used colorectal cancer treatment, which, while therapeutically efficacious, has the side effect of depleting the active stem cell pool. Indeed, patients frequently experience gastrointestinal radiation syndrome while undergoing radiotherapy, in part due to active stem cell depletion. The loss of active intestinal stem cells in intestinal crypts activates a pool of typically quiescent reserve intestinal stem cells and induces dedifferentiation of secretory and enterocyte precursor cells. If not for these cells, the intestinal epithelium would lack the ability to recover from radiotherapy and other such major tissue insults. New advances in lineage-tracing technologies allow tracking of the activation, differentiation, and migration of cells during regeneration and have been successfully employed for studying this in the gut. This study aims to depict a method for the analysis of cells within the mouse intestinal epithelium following radiation injury.

The gastrointestinal tract is one of the most sensitive organs to injury upon radiotherapeutic cancer treatments. It is simultaneously an organ system with one of the highest regenerative capacities following such insults. The presented protocol describes an efficient method to study the regenerative capacity of the intestinal epithelium.

Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Efeitos epiteliais da inflamação intestinal em colonoides murinos estabelecidos

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

Autor em destaque: estudando os efeitos epiteliais da inflamação intestinal in vitro em colonoides murinos estabelecidos  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...