A irradiação gama é um tratamento amplamente utilizado para o câncer colorretal. E embora seja terapeuticamente eficaz, tem efeitos negativos sobre o trato gastrointestinal. O protocolo apresentado descreve um método eficiente para estudar a ativação, diferenciação e migração de células durante a regeneração após lesão por radiação.
Este protocolo descreve um modelo robusto e reprodutível de lesão por radiação. É importante ressaltar que este modelo permite rastrear o destino das células intestinais após a lesão e, assim, fornece uma melhor compreensão da capacidade regenerativa de uma subpopulação celular específica. Esta técnica pode empregar modelos animais distintos de rastreamento de linhagem para estudar o comportamento em tempo real e a interação de várias subpopulações de células pós-lesão.
Pequenas modificações neste protocolo devem permitir a investigação das relações entre a microbiota e diferentes populações epiteliais, estromais e de células imunes após a lesão por radiação. Para começar, ressuspenda o pó de tamoxifeno em óleo de milho estéril a uma concentração de 30 microgramas por microlitro. Sonicate por três minutos em ciclos de liga-desliga de 30 segundos com 60% de amplitude.
Misture por rotação no escuro durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, prepare EdU adicionando DMSO estéril ao pó de EdU. Adicione 1/5 do volume total e adicione lentamente o volume restante de água ultrapura estéril.
Quando completamente dissolvido, alíquota e armazenar a 20 graus Celsius. Preparar reagentes para coleta e fixação de tecidos, como etanol 70% em água, DPBS resfriado a quatro graus Celsius, tampão fixador de Bouin e formalina tamponada a 10%. Em seguida, prepare os equipamentos necessários, como um kit de dissecção de camundongos, placas de Petri, uma agulha de gavagem de calibre 16 acoplada a uma seringa de 10 mililitros e histológicas.
Dois dias antes da exposição à irradiação gama, preparar os animais experimentais para a injeção de tamoxifeno. Pesar cada animal e calcular a dosagem necessária. Desinfetar a região abdominal com etanol 70%.
Em seguida, administrar uma dose única de tamoxifeno por via intraperitoneal usando uma agulha de calibre 27 acoplada a uma seringa de um mililitro para induzir a recombinação mediada por Cre. Observar os animais nas próximas 48 horas para excluir toxicidade potencial do tamoxifeno. Após 48 horas, transferir os animais para a sala de irradiação.
Desinfetar a câmara de amostras no irradiador gama com solução de etanol a 70%. Coloque a esteira absorvente e os animais dentro da câmara de amostras. Coloque a tampa e feche a câmara.
Programar o irradiador gama para expor os animais à irradiação corporal total de 12 cinzas. Em seguida, vire a tecla para a posição inicial e pressione start para iniciar a exposição. Deixe a sala para o tempo de exposição ativa.
Após o tempo predefinido, a máquina irá parar automaticamente e começará a apitar. Desligue a máquina girando a chave na posição de parada. Abra a câmara de amostra e retire a tampa.
Transferir os animais para a gaiola e desinfetar a câmara de amostra com etanol 70%. Transfira os animais de volta para o alojamento convencional e observe sua condição pós-tratamento. Monitore o peso dos animais todos os dias.
Três horas antes da eutanásia planejada, desinfete a área abdominal e injete os camundongos intraperitonealmente com 100 microlitros de solução estoque de EdU usando uma seringa de insulina de calibre 28. Após a eutanásia do animal, coletar os intestinos proximais em diferentes momentos pós-irradiação. Disseque a parte proximal do intestino delgado e remova os tecidos anexados.
Lave o tecido com DPBS fria usando uma agulha de alimentação reta de calibre 16 conectada a uma seringa de 10 mililitros e fixe o tecido com o tampão fixador de Bouin. Corte os intestinos abertos longitudinalmente e enrole os intestinos proximais usando a técnica Swiss-roll. Colocar os tecidos em um histológico em um recipiente com formalina tamponada a 10% e incubá-lo por 24 a 48 horas à temperatura ambiente.
Após a incubação, transferir as histológicas para etanol 70% e incorporar o tecido em parafina. Após a incorporação, colocar os histológicos no gelo por pelo menos uma hora. Em seguida, corte seções horizontais de cinco mícrons de espessura usando um micrótomo.
Transfira as seções de tecido para um banho-maria aquecido a 45 graus Celsius e coloque as seções em lâminas carregadas. Deixe as corrediças em um rack durante a noite em temperatura ambiente para secar. Imagens de hematoxilina e eosina de espécimes do intestino delgado mostraram um epitélio intestinal homeostático em zero hora, seguido pela perda de células dentro dos compartimentos das criptas durante a fase apoptótica.
Seguiu-se a fase regenerativa em que células altamente proliferativas povoaram as criptas, levando à fase de normalização no sétimo dia. O rastreamento de linhagens por EYFP mostrou que, durante a homeostase, as células originárias de células-tronco de reserva positivas para Bmi1 foram restritas às posições de mais quatro a mais seis dentro das criptas. As colorações de EdU e Ki-67 mostraram homeostase intestinal normal em camundongos sham irradiados, estendendo-se de células-tronco ativas através da zona de amplificação de trânsito.
Durante a fase apoptótica, o número de células positivas para EYFP diminuiu, acompanhado por uma perda de células proliferativas causada por danos por radiação. Na fase regenerativa, observou-se ativação de células-tronco de reserva e rápida proliferação de células positivas para Bmi1. A proliferação e migração posteriores restauraram a integridade do epitélio intestinal.
A coloração TUNEL mostrou que as células apoptóticas estão ausentes durante a homeostase. Um aumento na coloração TUNEL foi observado tardiamente na fase apoptótica. Durante a fase regenerativa, a coloração TUNEL diminuiu constantemente dentro das criptas regeneradoras e quase esteve ausente quando as criptas normalizaram.
Esta técnica pode ser combinada com sequenciamento de RNA, sequenciamento de RNA de célula única, classificação de células ativadas por fluorescência ou análise proteômica para obter conhecimento mais aprofundado sobre o papel de linhagens celulares específicas durante a regeneração intestinal após lesão. Os pesquisadores podem investigar as interações entre a microbiota e as populações de células epiteliais, estromais e imunes na regeneração intestinal para expandir a compreensão da capacidade regenerativa do epitélio intestinal.
