Queremos agradecer Monte Westerfield, Makoto Kobayashi e Jacek Topczewski para os presentes de plasmídeos para a hibridização in situ e microinjeções de mRNA. Somos gratos a Steph Erhard para aparecer no vídeo. Gostaríamos também de agradecer a ajuda de William Goossens com a microscopia confocal mostrado no vídeo. Tyler Schwend fornecido as imagens usadas no vídeo, e Rodney Dale assistida com a preparação para o vídeo. Reconhecemos também a equipe de cuidados de CMRC animal para seu trabalho com a criação de peixe-zebra. Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão R21 AA13596 a SCA.

1. O tratamento de etanol de Embriões <ol><li> Embriões derivados de peixe-zebra de tipo selvagem acasalamentos foram levantadas a 28 ° C em 5 ml de água embrião. (Água Milli-Q com 60 mg / L instantânea Oceano). Diferentes cepas de tipo selvagem embriões têm tolerâncias ligeiramente diferentes para etanol exposição 9. </li><li> A exposição ao etanol foi iniciada a fase de cúpula (~ 4,3 fertilização pós horas, HPF) para o período de tempo desejado, até a um pulso de 24 horas. Esta fase inicial é aproximadamente equivalente à fase de implantação de embriões de mamíferos, pouco antes da gastrulação. As concentrações de etanol utilizado gama de 0,2% -2,5%, em volume / volume. Testes demonstraram que entre 25-50% da solução na água acaba no embrião em desenvolvimento 10, 11. Os embriões são mantidos a 28 ° C durante o período de tempo desejado. Após o comprimento desejado de exposição ao etanol, a solução de etanol-água é removido e substituído com três lavagens de água de peixe zebra regular e mantida for do comprimento de tempo desejado. A especificidade do defeito depende do tempo de início, a dose, eo comprimento do impulso de etanol. </li></ol> 2. Colecção de embriões para RNA, a hibridização in situ, Anticorpo e coloração Cartilagem <ol><li> Para a coleta de mRNA para qPCR, idade embriões encontrados são coletados em tubos de eppendorf. Após a remoção da água do peixe-zebra, tampão de lise com TCEP é adicionado. Um pulverizador motorizado é utilizado para dissociar fisicamente os embriões na solução de lise. Este é então passada através de uma coluna preclear, que remove todos os pedaços não dissolvidas grandes. A solução resultante contém todas as macromoléculas libertada pelo processo de lise. O RNA é então extraída através da execução desta solução sobre uma coluna, seguido por lavagens e tratamento de DNAse. A eluição é então realizado utilizando água ou uma solução de eluição fornecido pelo fabricante (5&#39;-Prime). O RNA pode ser convertido em ADNc utilizando técnicas padrão para qPCR ou utilizados em microA análise de matriz. </li><li> Para hibridação in situ e coloração do anticorpo, os embriões de 6 a 24 hpf foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C. Isto é seguido por 3 lavagens em PBS + 0,1% de Tween (PBT), para manter os embriões colem. Os embriões são então transferidos através de uma série de metanol a 3: PBT lava em metanol a 100%, ponto em que eles podem ser armazenados a -20 ° C. Estes embriões podem ser utilizados para hibridação in situ ou a coloração do anticorpo. Alguns anticorpos não funcionam após o tratamento de metanol, de modo que este ressalva precisa de ser tidas em conta eo seu anticorpo específico testado para determinar se ele vai trabalhar após o tratamento metanol. </li><li> Para a coloração de cartilagem, os embriões precisam de ser aumentado para 5 ou 6 dias pós fertilização (dpf). Eles são em seguida fixados em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C, seguido de 3 lavagens em PBT. </li></ol> 3. Avaliando induzidas por etanol Gene alterações de expressão e consequências desenvolvimentais <ol><li&gt; Para determinar quais os níveis de expressão de genes foram alterados, genes alvo são examinadas pelo qPCR e hibridação in situ. qPCR é conseguido usando primers desenhados com Integrated DNA Technologies (IDT), software, então validado com 3 diferentes amostras biológicas. Uma vez que os primers foram validadas, qPCR é realizada em cDNA produzido a partir de amostras recolhidas de RNA. Cada amostra é executado em triplicata. As reacções de PCR são executados Platinum SYBR Green qPCR Super mistura (Invitrogen) em uma máquina de PCR Chroma-4 (BioRad) ou máquina de PCR semelhante com um sistema de detecção de multicolor. Para além dos genes a ser interrogado, é crítico que um conjunto de iniciadores de controlo é usado para equilibrar pequenas diferenças na preparação de cDNA ou RNA. Para os nossos embriões do zebrafish, usamos GAPDH: 5&#39;GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3 &#39;e 5&#39;TTGCACCACCCTTAATGTGA3&#39;. Genes sendo analisadas são, então, normalizada para níveis de GAPDH uma quantificação relativa de expressão do gene é calculada usando a variação do método Pfaffl em 2 <sup&gt; - Ct, exibindo dados como diferença vezes em relação ao tipo selvagem experimental 12. O cálculo normais assume que todos os genes são duplicar o DNA duas vezes para cada ciclo e, portanto, expressa os dados como a razão entre a mudança no gene experimental sobre a mudança no gene de referência, expresso como cálculos de potência durante o inteiro &quot;2&quot;, que é a eficiência de duplicação da população de DNA por ciclo visto numa reacção de PCR perfeito. O método Pfaffl substitui o &quot;2&quot; genérico com o experimentador gerada eficiência verdadeiro para o primers PCR escolhido. Isto reflete uma reflexão mais precisa da diferença nas reacções de PCR. A fórmula completa é: <table border="0"><tbody><tr><td> (Eficiência do gene experimental) (Ct do controle de amostra-Ct da amostra tratada) </td></tr><tr><td> -------------------------------------------------- ----------------------------------- </td></tr><tr><td> (Eficiência do gene de referência) (Ct deamostra de controlo - Ct da amostra tratada) </td></tr></tbody></table></li><li> Para hibridação in situ, digoxigenina (DIG)-rotulados riboprobes são construídos a partir de plasmídeos contendo porções do gene de interesse. Da mesma idade embriões são expostos a riboprobes usando condições padrão 13 e detectado utilizando anticorpos anti-dig anticorpos acoplados com fosfatase alcalina que permite que a localização dos riboprobes rotulados com uma reacção de cor (NBT / BCIP). Os embriões são então visualizada utilizando um microscópio de dissecação Leica (Figura 1B-G). </li><li> Para avaliar o desenvolvimento morfogênica, os embriões são recolhidos no momento desejado e examinadas ao microscópio de dissecação. Para somito forma, embriões vivos são gravadas 14. Para distância ocular inter e comprimento do corpo, os embriões são fixadas em PFA. Em todos os casos, as imagens da região desejada são capturados sobre um microscópio de dissecação com uma ampliação fixa e medições tomadas usando o Adobe Photoshop software 10,14. </li><li> Para examinar os efeitos do tratamento sobre as estruturas de cartilagem em desenvolvimento no peixe-zebra larval, usamos coloração com azul Alcian. Larvas do peixe fixo são tratados com solução de azul Alcian dissolvido em etanol a 80%: 20% de ácido acético glacial (álcool de ácido), durante várias horas ou durante a noite. As larvas são descorados em várias lavagens de álcool de ácido antes de ser transferido para um KOH a 1%: solução de peróxido de hidrogénio a 3% para a compensação adicional de células de pigmento. Zebrafish precisam de ser pelo menos 4 dias de idade para mostrar as estruturas de cartilagem, e estes são melhor definida em peixes que têm 5 ou 6 dias de idade. </li><li> A morte celular em embriões vivos é avaliada através de laranja de acridina (AO). AO não é permeável célula para as células vivas, e se liga ao DNA em células comprometidas com as membranas, incluindo aqueles apoptose e necrose. Embriões vivos são incubadas com 5 mg / AO ml em PBS durante 1 hora, seguido de 3 lavagens em PBS. Os embriões são então trabalhada usando o microscópio confocal. Digital Z-Series imagens são combinadas para criar composições. </li></ol> 4. Manipulação do Embrião Zebrafish <ol><li> Após a identificação de genes que são diminuídos por exposição ao etanol, é possível para tentar substituir-las utilizando a injecção de ARNm concebido para substituir o gene em falta. MRNA capped é transcrito a partir de plasmídeos ADN linearizado usando polimerase de RNA em kits de transcrição in vitro, de acordo com as instruções dos fabricantes (mMessage Machine, Applied Biosystems). Entre 25-200 pg / nl de RNA é injectado 1-2 celulares ovos peixe-zebra fase, em uma solução de 0,1 M de KCl. Os embriões são então deixados a recuperar, antes de ser tratado com etanol como descrito acima (Figura 5). </li><li> Para quaisquer transcritos do gene que são aumentados por exposição ao etanol, eles podem ser reduzidos, ou &quot;bateu-down&quot; usando um anti-sentido tecnologia morfolino. Antisense morpholinos (AMOS) são projetados nas ferramentas Gene da empresa, e bloquear a tradução do RNA em proteína, ou block maturação e splicing de RNA, dependendo da necessidade experimental. Esta acção de morpholinos limitar a quantidade de proteína activa para o gene alvo, um défice que pode ser medido utilizando anitibodies se estiverem disponíveis. A eficiência de morpholinos de splicing de RNA pode ser medido utilizando RT-PCR para detectar as quantidades relativas de transcrições splicing e unspliced. Titulando do morfolino pode resultar em actividade dependente da dose 15. AMOS são diluídas para concentrações de trabalho (titulada pg a concentração ng) em Danieau solução (58 mM de NaCl, 0,7 mM de KCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM de Ca (NO3) 2, 5 mM de HEPES, pH 7,6). Injecção tem lugar na fase 1-2-célula, em seguida, os embriões são permitidos para desenvolver antes de ser submetido a tratamento etanol como descrito acima. </li></ol> 5. Os resultados representativos Exposição de embriões de peixe zebra para os resultados de etanol em um número de defeitos do desenvolvimento e genéticos que estão relacionados comos fenótipos encontrada em outros vertebrados. Temos documentado desenvolvimento anormal de tecidos axiais, incluindo o notocórdio (dados não mostrados 14). O atraso do desenvolvimento produzido por etanol aparentemente leva a perturbações de alongamento notocórdio adequada, conduzindo a um notocórdio encurtado e, ocasionalmente, interrompido (dados não mostrados 14). Este atraso no início e defeito notocórdio provável conduz, em parte, as anormalidades posteriormente nas sómitos (Figura 2), que perderam a sua forma de divisa forte, como visto nos controlos não tratados, e estão mais próximas dos somitos em forma de U característicos de fenótipos observados quando se sónica sinalização é reduzida 14. O ângulo das sómitos pode ser medida utilizando software padrão, e os aumentos do ângulo a partir de 92,1 ± 4,6 ° nos controlos não tratados para 122,6 ± 6,6 ° nos embriões de etanol tratado (p &lt;0,001). Uma outra consequência da exposição ao etanol que pode ser downstream de atraso no desenvolvimento precoce e defeitos posteriores notocórdio é um comprimento reduzido do embrião (Figura 3). Mesmo medindo embriões para ter em conta a curvatura produzida por exposição ao etanol, a exposição ao etanol conduz a um tronco encurtado que é dependente da dose de etanol no embrião foi exposto a (Figura 3E 14). Este achado é semelhante à persistência da pré-puberdade baixa estatura encontrada em crianças expostas à etanol durante o desenvolvimento 16, 17, sugerindo que o modelo de peixe-zebra é relevante para a compreensão do defeito de nascença humano. Uma das características clássicas da FAS é uma fácies clássicos, incluindo uma mandíbula reduzida, a abertura dos olhos pequenos, e um filtro suave. Grande parte destas características estão relacionados com uma redução nos tecidos da linha média. Tem sido demonstrado em modelos animais de que a exposição de etanol grave leva a fenótipos ainda mais pronunciada, incluindo synopthalmia e ciclopia. Quando expocante embriões peixe-zebra a doses crescentes de etanol, a distância intra-ocular (IOD) diminui de uma forma dependente da dose (Figura 4) consistente com a natureza do defeito de nascença humano. Cyclopia é encontrado apenas com doses muito elevadas, mas as doses mais baixas não produzem uma redução significativa na IOD (Figura 4), ​​sugerindo que este modelo animal tem um defeito semelhante em desenvolvimento facial linha média 10. A fim de compreender o mecanismo subjacente aos defeitos de corpo e rosto produzido pela exposição ao etanol, buscou-se estabelecer as alterações de expressão gênica que ocorrem no início do desenvolvimento e que se pode razoavelmente esperar contribuir para defeitos de desenvolvimento posteriores. Fazemos isso de duas maneiras, a extracção de mRNA a partir de embriões permite uma avaliação quantitativa dos níveis de expressão do gene em embriões de etanol tratados em comparação com os controlos (Figura 1A). Além disso, pode-se realizar in situhibridação a olhar para o padrão de genes, independentemente de estar ou não o sinal é diminuída (Figura 1B-G 18). Neste exemplo, dois genes cuja expressão é diminuída após a exposição ao etanol são mostrados, gli1 e six3b. Quando examinámos o padrão em situ para six3b, notou-se uma redução na extensão espacial da expressão deste gene (Figura 1 EG) em embriões expostos ao etanol. Uma redução semelhante foi encontrado no SGC gene (Figura BD). Ambos six3b e gsc são expressos em tecidos destinados a contribuir para craniofaciais tecidos da linha média. Assim, a redução destes genes em 8 hpf é consistente com a redução na IOD encontrado mais tarde, como mostrado na Figura 4. Uma vez que os genes que são afectados por etanol são identificados, existem mecanismos pelos quais a expressão deles pode ser aumentado ou diminuído. Em particular, este example, mostrámos 2 genes que são diminuídos (gli1 e six3b) por qPCR. Optou-se por injetar mRNA para determinar se a inversão dessas alterações genéticas podem melhorar os resultados. Para esta experiência, em vez de injetar gli1, optou-se por injetar shh, um ligante que aumenta gli1 níveis. Para six3b, fomos capazes de injetar six3b si. Não foram encontradas alterações quando injectados six3b (dados não mostrados), mas eram capazes de fundamentalmente resgatar os defeitos bruto em embriões com peixe-zebra suplementar shh injecções (Figura 5). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig1.jpg" /> A Figura 1 exposição ao etanol. Muda o padrão precoce e níveis de expressão dos genes seleccionados genes de desenvolvimento. A) resultados para qPCR embriões em 8hpf. Os resultados de dois genes são exibidas: six3b e gli1. Resultados apresentados como média de três experiências separadas,ea dose de etanol mostrado é de 2,5%. Ambos os genes são reduzidos de uma maneira que é significativo de controlo (teste t, p &lt;0,05). BG) A hibridação in situ de 8 embriões peixe-zebra HPF. Ambos gsc e padrões six3b são alterados neste ponto do tempo em comparação aos controles. (Modificado com a permissão de Loucks et al. De 2007). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig2.jpg" /> Figura 2. Desenvolvimento somito é alterada em embriões tratados. Somito estrutura e os ângulos são examinados em 48 hpf. Em embriões de controlo (A), sómitos têm uma forma Chevron e um ângulo agudo. Zebrafish etanol expostos têm mais ângulos I ou U-shaped somitos, e menos acentuada. (Modificado com a permissão de Loucks e Ahlgren 2009). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig3.jpg" /> 3 A Figura. Tratamento com etanol diminui significativamente o comprimento do corpo em peixes-zebra.O comprimento de embriões não tratados e etanol-exposto foram medidos em 5 dias pós-fertilização. Uma redução significativa de comprimento foi visto em todos os embriões tratados (ANOVA, p &lt;0,001). BD. Houve uma redução ligeira, mas significativa, o comprimento total de embriões tratados com 1,0% e 1,5% de etanol, enquanto que uma maior redução foi observada em embriões doseados com 2,0% e 2,5% de etanol. E. Para controlar as diferenças de tamanho em cada embraiagem, os embriões de controlo para cada experiência foram normalizados para 100, e os embriões tratados com irmãos expresso como uma percentagem de 100. (Modificado com a permissão de Loucks e Ahlgren 2009). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig4.jpg" /> Figura 4. Resultados Etanol de exposição a uma redução na distância intra-ocular (IOD) em embriões de peixe-zebra. A) vista frontal de embriões demonstrar fenótipos olhos normais e fundida. B) doses Diferentes de etanol administrado durante 3 horas durante res gastrulaçãoÜLTS na diminuição IOD quando os peixes são examinados 24 horas depois. Olhos fundido e ciclopia só são vistas na dose mais elevada testada (2,4%). * Indica uma redução significativa na IOD comparativamente aos controlos. (Modificado com a permissão de Ahlgren, 2004). <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig5.jpg" /> Figura 5. Injecção mARN SHH-N resgata os defeitos brutos produzidos por exposição ao etanol de peixe-zebra. Embriões uma-duas células foram injectados com 100 pg / nl mRNA SHH-N e metade dos embriões injectados foram expostas para as doses de etanol padrão de 4,3-24 hpf. Os embriões foram analisadas em 5 dpf. Os embriões tratados com etanol 2,0% exibem dorsalmente curvo caudas mais curtas, eu em forma de somitos e defeitos oculares, incluindo ciclopia. Resgate de estes fenótipos é visto em 71/76 de embriões injectados (93%). Nestes embriões, o corpo é reta, os somitos são chevron em forma, e os olhos estão completamente separadas.

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Não temos nada a divulgar.

Os métodos aqui descritos e os resultados mostrados demonstrar apenas a ponta do peixe-zebra como pode ser usado para interrogar defeitos de desenvolvimento. Por causa da acessibilidade do embrião, elevado número de ovos postos por cada embraiagem, e elevada reprodutibilidade dos resultados, estes vertebrados são ideais para estudos teratogénicos. Os peixes podem também ser manipulada para conter moléculas fluorescentes para usar como um repórter visual para um gene particular, ou via de interesse 19. Nos estudos de etanol, as doses utilizadas aparecem bastante elevada em comparação com os níveis de álcool de mamíferos de sangue. No entanto, estes níveis de reflectir o que está presente na água, e não todo o etanol é entregue ao embrião. Tomados em conjunto, os métodos descritos e detalhados acima sugerem que os embriões do zebrafish são muito úteis na modelagem de defeitos congênitos humanos relacionados à exposição ao etanol. Além disso, as alterações da expressão do gene encontrados no peixe-zebra foram confirmados por outrosnos sistemas modelo de mamífero 20, sugerindo que os efeitos no desenvolvimento de etanol são retidos através vertebrados. Muitas das técnicas demonstradas acima pode ser usado com outros insultos ambientais ou farmacêutica para rápida e facilmente detectar teratógenos potenciais e determinar os mecanismos subjacentes que contribuem para a teratogênese de uma substância em particular.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tecido RNA kit: 5-Primeiro-PerfectPure </td><td> Fisher Scientific </td><td> FP2302410 </td></tr><tr><td> Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG </td><td> Invitrogen </td><td> 11733038 </td></tr><tr><td> mMessage rendimento mMachine alta tampado RNA kit de transcrição </td><td> Applied Biosystems </td><td> Depende da RNA polimerase em seu plasmídeo </td></tr></tbody></table>

assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure

Síndrome Alcoólica Fetal (SAF) é uma manifestação grave da exposição ao etanol embrionário. Apresenta-se com defeitos característicos para o rosto e órgãos, incluindo retardo mental devido ao desenvolvimento do cérebro desordenado e danificados. Fetal álcool espectro desordem (FASD) é um termo usado para cobrir um continuum de defeitos congênitos que ocorrem devido ao consumo de álcool materno, e ocorre em aproximadamente 4% das crianças nascidas nos Estados Unidos. Com 50% das mulheres em idade fértil relatar o consumo de álcool, e metade de todas as gestações sendo planejada, a exposição involuntária é uma emissão contínua 2. A fim de melhor compreender os danos produzidos pelo etanol, além de produzir um modelo com o qual para testar potenciais intervenções, foi desenvolvido um modelo de exposição ao etanol de desenvolvimento utilizando o embrião do peixe-zebra. Zebrafish são ideais para este tipo de estudo teratogênico 3-8. Cada par estabelece centenas de ovos, o que pode então ser recolhidos sem prejudicar o adultopeixe. O embrião do peixe-zebra é transparente e pode ser prontamente fotografada com qualquer número de manchas. A análise destes embriões após a exposição ao etanol em doses diferentes e os tempos de duração e mostra aplicação de que os defeitos brutas de desenvolvimento produzidos por etanol são consistentes com o defeito de nascença humano. Aqui descritas são as técnicas básicas utilizadas para estudar e manipular o modelo FAS zebrafish.

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Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

A fim de compreender os mecanismos moleculares dos danos induzida por etanol de desenvolvimento, temos desenvolvido um modelo de peixe-zebra de exposição ao etanol e estão explorando as características físicas, as alterações celulares e genéticas que ocorrem após a exposição ao etanol<sup&gt; 1</sup&gt;. Procuramos então encontrar potenciais intervenções e rapidamente testá-los neste modelo animal.

Avaliar as alterações teratogênicos em um modelo de Zebrafish de exposição fetal ao álcool

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

26.1K visualizações.  Children's Memorial Research Center. A fim de compreender os mecanismos moleculares dos danos induzida por etanol de desenvolvimento, temos desenvolvido um modelo de peixe-zebra de exposição ao etanol e estão explorando as características físicas, as alterações celulares e genéticas que ocorrem após a exposição ao etanol 1. Procuramos então encontrar potenciais intervenções e rapidamente testá-los neste modelo animal.

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The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick1,2.
Each dead space model has its own limitations based on its material's composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins1. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid2. The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal5. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis2,5.
In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies1,2.
Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

A useful tool to analyze the effects of drugs, growth factors, and/or manipulated cells in an animal model of wound repair is described. This technique utilizes the properties of a polyvinyl alcohol (PVA) sponge to deliver and contain the desired treatment and also provide a platform to be excised and analyzed.

O álcool polivinílico implantação do modelo Esponja

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing ...

Medicina

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo Fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

Ecocardiografia fetal e ultra-som Doppler pulsátil em um modelo de coelho de restrição do crescimento intra-uterino

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

One desirable endpoint of general anesthesia is the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is less straightforward than it is in human patients. A widely used behavioral surrogate for hypnosis in rodents is the loss of righting reflex (LORR), or the point at which the animal no longer responds to their innate instinct to avoid the vulnerability of dorsal recumbency. We have developed a system to assess LORR in 24 mice simultaneously while carefully controlling for potential confounds, including temperature fluctuations and varying gas flows. These chambers permit reliable assessment of anesthetic sensitivity as measured by latency to return of the righting reflex (RORR) following a fixed anesthetic exposure. Alternatively, using stepwise increases (or decreases) in anesthetic concentration, the chambers also enable determination of a population's sensitivity to induction (or emergence) as measured by EC50 and Hill slope. Finally, the controlled environmental chambers described here can be adapted for a variety of alternative uses, including inhaled delivery of other drugs, toxicology studies, and simultaneous real-time monitoring of vital signs.

Loss of the righting reflex has long served as a standard behavioral surrogate for unconsciousness, also called hypnosis, in laboratory animals. Alterations in volatile anesthetic sensitivity caused by pharmacological interventions can be detected with a carefully controlled high-throughput assessment system, which may be adapted for delivery of any inhaled therapeutic.

Avaliar as alterações na volátil Geral Anestésica Sensibilidade de Ratos após intervenção farmacológica local ou sistêmica

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Faz com cistos no peixe-zebra Rins

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Um modelo de pele Rato Fetal de reparação de feridas Scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Model Surgical Training: Skills Acquisition in Fetoscopic Laser Photocoagulation of Monochorionic Diamniotic Twin Placenta Using Realistic Simulators

Fetoscopic laser coagulation of arterio-venous anastomoses (AVA) in a monochorionic placenta is the standard of care for twin-twin transfusion syndrome (TTTS), but is technically challenging and can lead to significant complications. Acquiring and maintaining the necessary surgical skills require consistent practice, a critical caseload, and time. Training on realistic surgical simulators can potentially shorten this steep learning curve and enables several proceduralists to acquire procedure-specific skills simultaneously. Here we describe realistic simulators designed to allow the user familiarity with the equipment and specific steps required in the surgical treatment of TTTS, including fetoscopic handling, approaches to anterior and posterior placenta, recognition of anastomoses, and efficient coagulation of vessels. We describe the skills that are especially important in conducting placental laser coagulation that the surgeon can practice on the model and apply in a clinical case. These models can be adapted easily depending on the availability of materials and require standard fetoscopy equipment. Such training systems are complementary to traditional surgical apprenticeships and can be useful aids for fetal medicine units that provide this clinical service.

Practicing the specific skills required for fetoscopic laser coagulation of monochorionic placental anastomoses on realistic models can aid less experienced surgeons in overcoming the steep learning curve associated with this procedure that is now regarded as the standard of care for twin-twin transfusion syndrome.

Modelo de Treinamento Cirúrgico: Aquisição de Competências em Fotocoagulação Fetoscópica a Laser de Placenta Gêmea Diamniótica Monocoriônica Utilizando Simuladores Realistas

Fetoscopic laser coagulation of arterio-venous anastomoses (AVA) in a monochorionic placenta is the standard of care for twin-twin transfusion syndrome ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.