Agradecemos Sean Pelkowski para assistência na otimização do ensaio comportamental. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, R01 HD060647 e do Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental, F32 e R03 ES021342 ES017755.

1. Coleta de embriões Zebrafish e Raising Larvas <ol><li> PYREX pratos com grama &quot;fake&quot; (feito a partir de fios verde) (Figura 1) deve ser inserido nos tanques de madrugada e saiu em duas horas, a fim de coletar embriões de peixe-zebra. Os pratos de vidro e contendo os embriões devem ser derramada sobre uma peneira manual e enxaguado com água desionizada. Os embriões devem ser cultivados em água de ovo. A água de ovo contém 60 mg / L de Instant Ocean em água desionizada e 0,25 mg / L de azul de metileno, que é utilizado como um inibidor de molde. </li><li> Dependendo da hipótese da experiência individual, os embriões podem ser tratados imediatamente ou durante os estágios de desenvolvimento específicos usando substâncias tóxicas ou de produtos farmacêuticos. Os agentes tóxicos e produtos farmacêuticos são geralmente dissolvidos em DMSO (a uma concentração de 1000 X) e deve ser diluído directamente na água do meio ovo. </li><li> Durante o tratamento embrionário e larval com fármacos ou tóxicoss, as larvas e os embriões podem ser alojados em pratos de Petri de profundidade, a uma densidade de cerca de 50-60 larvas por 50 ml até que as análises de comportamento de 7 dpf (solução aquosa de ovo deve ser alterada, pelo menos, a cada dois dias, para evitar o crescimento de fungos / bacteriana a partir de embriões mortos). </li></ol> 2. Preparando Moldes de Análises Comportamentais <ol><li> Especialmente desenvolvido moldes de plástico que medem 11,7 centímetros x 7,6 centímetros x 5 mm foram custom-built in-house. Os moldes são necessários para criar pistas usando agarose que é derramado em placas de plástico bem simples de Thermo Scientific. A única medida placas bem 12,4 centímetros x 8,1 centímetros x 1,2 cm. </li><li> Os moldes contêm cinco pistas em que os lados são inclinadas a 60 °. As pistas nos moldes estão a 3,5 mm de altura, com uma base de 18 mm na parte superior, que é a mais larga que a largura da parte inferior é de 14 mm. Existe uma diferença de 4 mm entre as faixas no molde (Figura 2). </li><li> Para preparar as pistas de deitar 50 ml de agarose fundida (0,8% de agarose em deionized de água com 60 mg / L de Instant Ocean) numa única placa com cavidades. O molde deve então ser colocados de forma muito lenta no topo do líquido de agarose para eliminar qualquer formação de bolhas e pode ser removido quando a agarose foi arrefecida (o que demora cerca de 45 min.) </li><li> As pistas de agarose não deve ser feita no início de um dia antes da experiência de comportamento está a ser executado (para evitar a secagem de agarose) As pistas podem ser armazenadas à temperatura ambiente, com as tampas dos pratos para até cerca de 36 horas. As pistas de agarose deve ser usado apenas para uma experiência e deve, então, ser descartado. </li></ol> 3. Captura de Imagem <ol><li> Até 20 larvas podem ser colocados em cada pista das placas. Tipicamente 5 larvas por cada pista são utilizados para facilitar o rastreamento mais preciso da velocidade de mergulho e para reduzir o número de larvas que são necessárias por ensaio. As pistas podem ser cheios com água de ovo com ou sem fármacos ou substâncias tóxicas, dependendo da experiência. No entanto, as pistas não deve ser filled por todo o caminho até que sejam colocados nos armários de imagem, o que irá evitar transbordamento. Por razões de consistência, as larvas devem ter um período de aclimatação de 10 minutos depois de serem colocados nos moldes de agarose e posicionado na parte superior do ecrã do computador portátil. Eficientemente mover as larvas a partir da placa de Petri para a agarose pista vai ajudar a reduzir o estresse larvas. Isto é mais fácil quando as larvas estão alojados em tanques rasos ou em placas de Petri. </li><li> Os armários de imagem incluem uma câmera digital Canon usado para a fotografia time-lapse e um laptop. A câmara deverá ser colocada na parte superior do armário e dirigido para a parte inferior do armário em que uma tela de 15,6 polegadas portátil deve ser colocado com a tela voltada para cima (figura 3). Quatro placas devem ser posicionados à mão diretamente no topo da tela do laptop. Neste momento, as pistas podem ser recheados com água ovo ou tratamento químico de modo que é nivelado com o topo da pista (para eliminar as sombras sobre as bordas do lanes nas imagens). </li><li> Uma apresentação PowerPoint é usado como um estímulo aversivo para as larvas. Nos últimos móveis bolas vermelhas foram mostradas para larvas de peixe-zebra em 6 ou 12 multi-bem placas 15,17,18. A corrente PowerPoint inicia com um fundo em branco durante 15 min, seguido por 15 min de uma barra vermelha em movimento na metade de cima da placa (Figura 4). A fim de eliminar o superaquecimento das larvas, é melhor comprar um laptop com uma temperatura de tela que não vai acima de 28 ° C. Para evitar a evaporação do líquido no interior das pistas de agarose, o tempo de imagem máxima deve ser mantida abaixo de uma hora. </li><li> A câmera digital deve ser programada para a fotografia time-lapse, tirando fotos a cada 6 segundos para um total de 300 imagens por experiência. No entanto, a frequência e duração podem ser ajustados dependendo da experiência e quantificação comportamental. Nos últimos tempos imagiologia extensas foram empregues usando intervalos mais longos entre cada imagem. O cameruma pode ser definida em uma resolução mais baixa para imagens em alta velocidade de vídeo (30 frames por segundo). Enquanto a resolução mais baixa limita as gravações para uma única chapa vários poços, as gravações de vídeo são apropriados para imagens rápidas eventos de natação 15. </li></ol> 4. Análise de Imagem <ol><li> As imagens devem ser abertos com ImageJ e usado com uma macro que foi escrito especificamente em casa. A macro automaticamente separa os canais de cor de modo a que a cor vermelha podem ser removidos, subtrai do fundo, aplica-se um limiar, e identifica as larvas através de análise de partículas. O macro mais atual para cinco análise larval pista é Zebrafish_macro25k. Use as instruções na macro para definir o número de imagens, cor a ser subtraído, o limiar de imagem, etc </li><li> Depois que todas as imagens são executados através da macro ImageJ, um arquivo de resultados serão apresentados e conterá coordenadas x, y das larvas individual para cada imagem, juntamente com o número da imagem eo número de pista. </li&gt; <li> O arquivo de resultados devem ser salvos em um formato Excel e classificadas com base em fundo branco contra o fundo móvel bar e, em seguida, o número também. Um modelo do Excel deve ser utilizado que tem equações construídas em que determina automaticamente a colocação das larvas nos poços, a distância entre as larvas, velocidade de movimento, e da quantidade de descanso. O modelo mais atual do Excel é 25ib criado no laboratório Creton, que está disponível mediante solicitação. Os gráficos que mostram os vários grupos de tratamento deve ser construído na folha de Excel, juntamente com os testes t para comparação entre os grupos de tratamento e controle. Posterior análise estatística pode ser realizada usando SPSS. </li></ol>

<ol>
	<li>Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drinks+like+a+fish:+zebra+fish+(Danio+rerio)+as+a+behavior+genetic+model+to+study+alcohol+effects.">Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).</li><li>Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+activity+in+zebrafish+embryos:+A+new+method+to+assess+developmental+neurotoxicity.">Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicol. 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Teratol. 33, 742-751 (2011).</li><li>Stewart, A., Wu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+anxiety-like+phenotypes+in+adult+zebrafish+behavioral+models.">Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).</li><li>Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+provide+a+sensitive+model+of+persisting+neurobehavioral+effects+of+developmental+chlorpyrifos+exposure:+comparison+with+nicotine+and+pilocarpine+effects+and+relationship+to+dopamine+deficits.">Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+assay+to+measure+responsiveness+of+zebrafish+to+changes+in+light+intensities.">A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities.</a> J. Vis. Exp. (20), e923 (2008).</li><li>Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+imaging+system+for+automated+analyses+of+avoidance+behavior+in+zebrafish+larvae.">A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).</li><li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+developmental+toxicity+by+automated+analyses+of+behavior+in+zebrafish+larvae.">Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae.</a> Unpublished observations. , (2012).</li><li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+edge:+pharmacological+evidence+for+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).</li><li>Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+sub-chronic+exposure+to+chlorpyrifos+reduces+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Neurotoxicol. Teratol. , (2012).</li><li>Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish.">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li><li>Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Enquanto estamos melhorando continuamente nosso ensaio comportamental novela, tem sido sempre útil para a detecção de evasão e comportamento tigmotatismo em larvas do peixe 15. Muitos ensaios foram realizados a fim de optimizar os resultados do ensaio, tais como a cor do estímulo utilizada, o número ideal de larvas por pista, e duração de ensaio comportamental. Anteriormente, foram utilizados placas multi-poços (com 6 ou 12 poços) 15,17,18. No entanto, recentemente, criaram a novel pista molde para criar um espaço maior para a natação larvas que nos permite recolher um número maior de medições comportamentais num ensaio de 16 (Figura 5). Outras modificações incluem as variações do PowerPoint mostrado (circulação alterados ou comprimento de ensaio) e o tamanho das vias utilizadas (também temos moldes para pistas mais estreitas). Atualmente, este sistema automatizado de alto rendimento é única em sua capacidade de medir uma grande variedade de comportamentos em ZEBRlarvas afish, ao mesmo tempo, tais como a velocidade, a evasão, a proximidade de outras larvas, e tigmotatismo em placas de multi-lane. Os resultados podem ser obtidos mais rapidamente e de um grande número de larvas podem ser analisados ​​o tempo de imagiologia. O sistema é barata para construir e rápido e fácil de configurar. A limitação deste sistema é que os movimentos 3-D não pode ser avaliada em larvas do peixe-zebra. Os sistemas automatizados que acompanham peixe-zebra adulto tem a capacidade 3-D e pode identificar uma ampla gama de comportamentos tais como o movimento para cima ou para baixo na coluna de água 10,19. Outra limitação é que o nosso sistema de imagem atualmente não é otimizado para análises de alto rendimento em velocidade vídeo. Imaging velocidade vídeo é possível quando se configurar a câmera para uma resolução inferior 15, mas isso restringe a análise a um único prato. Ao utilizar o método recentemente criado &quot;pista&quot;, várias partes do ensaio necessária para ser executada de um modo preciso. Ao colocar as larvas em tele pistas, é fundamental para garantir que o nível de líquido é muito superficial, até as placas estão posicionadas no topo da tela do laptop. Se as pistas estão cheias de líquido, as larvas irão escapar para a periferia da placa. Além disso, quando se insere o molde em que a agarose, os cuidados devem ser tomados para baixar o molde muito lentamente. Se o molde é inserido demasiado depressa, formam-se bolhas de agarose e será identificada pelo J macro imagem como larvas adicional. É aconselhável que se as pistas de agarose tem até algumas bolhas, é melhor fazer novos. No futuro, gostaríamos de otimizar nosso ensaio comportamental para analisar outros comportamentos complexos como a aprendizagem em larvas do peixe e examinar como o aprendizado pode ser afetado pela exposição a substâncias tóxicas e medicamentos no início do desenvolvimento. Estamos atualmente trabalhando em ensaios que podem ser úteis para analisar o comportamento de aprendizagem em que os resultados comportamentais podem facilitar a determinação de quais áreas do cérebro sãoafetados por certas substâncias tóxicas ou de produtos farmacêuticos durante o desenvolvimento. Ensaios automatizados foram desenvolvidos para medir a comportamentos em larvas do peixe 20 e estes ensaios de aprendizagem pode ser modificável para rastreio de alto rendimento, utilizando a resposta evitação robusto em placas de multi-lane. Propomos que este ensaio comportamental poderia ser usada em estudos futuros para testar os efeitos do desenvolvimento de um grande número de produtos farmacêuticos e substâncias tóxicas. Tais estudos fornecem uma riqueza de informações sobre os fatores de risco específicos e contribuir para definir melhor as diretrizes de segurança e saúde para as mulheres grávidas e crianças.

Zebrafish estão se tornando um modelo popular de ciências genéticas, comportamentais e de desenvolvimento 1-4. Chocam de seus córions por 2-3 dias após a fertilização (dpf), desenvolver plenamente os órgãos que funcionam por 4-5 dpf, e exibem um grande número de comportamentos por 7 dpf 5,6. Larvas do peixe são ideais para análises de alto rendimento por causa de seu pequeno tamanho 7,8. O software está disponível comercialmente para análises automatizadas de comportamento em larva e adulto zebrafish 9-14. No entanto, este software pode ser caro e possui opções limitadas de medição comportamentos complexos de larvas de peixe-zebra em placas de multi-poços. Criamos um novo sistema de imagem de alto rendimento que é barato para configurar e pode quantificar uma série de comportamentos diferentes em sete dpf larvas do peixe 15,16. O sistema permite testar de forma rápida e eficiente subtis alterações comportamentais após exposição embrionário para uma série deprodutos farmacêuticos e substâncias tóxicas ambientais 16-18. O sistema foi construído com armários de madeira, que abrigam uma câmara digital na parte superior do gabinete. A câmara fique virada para baixo para a parte inferior do armário em que um computador portátil é colocado com a tela voltada para cima 15. Lapso de tempo de imagem é usado para capturar a colocação das larvas nas pistas. As larvas podem ser alojados em até quatro placas de poços múltiplos ou multi-lane que estão posicionados no topo da tela do laptop. Usamos uma apresentação do PowerPoint como um estímulo aversivo para que as larvas responder, afastando-se (esquiva) e nadar para a borda (tigmotatismo) 15,17. As imagens são importadas para ImageJ em que uma macro automática é usado para dividir os canais de cor, subtraia o fundo, e um limiar para identificar larvas individual. As coordenadas são listadas para cada larva em cada imagem e pode ser inserido num ficheiro Excel que usamos para quantificar evitação e thigmotacomportamento xis, peixe a distância dos peixes, nadar a velocidade ea quantidade de repouso 16.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>198262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>214325</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>One well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-493</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon </td>
			<td>EOS Rebel T1i</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Cabinets</td>
			<td>WoodCraft Towers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laptops</td>
			<td>Acer Aspire</td>
			<td>Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera Lens</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic diffuser</td>
			<td>Pendaflex </td>
			<td>52345</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PowerPoint 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae

Nós criamos um novo sistema de imagem de alto rendimento para a análise do comportamento em larvas do peixe de 7 dias de idade, em placas multi-pista. Este sistema mede comportamentos espontâneos ea resposta a um estímulo aversivo, o que é mostrado para as larvas através de uma apresentação de PowerPoint. As imagens gravadas são analisados ​​com uma macro ImageJ, que divide automaticamente os canais de cor, subtrai o fundo, e aplica-se um limite de identificar a colocação larvas indivíduo nas pistas. Podemos, então, importar as coordenadas em uma folha de Excel para quantificar a velocidade de nado, preferência por borda ou na lateral da pista, o comportamento descansar, tigmotatismo, distância entre larvas e comportamento de evitação. Mudanças sutis no comportamento são facilmente detectados utilizando nosso sistema, tornando-o útil para análises comportamentais após a exposição a substâncias tóxicas ou produtos farmacêuticos ambientais.

Nos nossos ensaios anteriores, utilizando a bola que salta estímulo aversivo, larvas tipo selvagem, que são tratadas para responder a bola em movimento, nadando para baixo no poço (comportamento de evasão) e na direcção das bordas do poço (comportamento tigmotatismo) 15. Mais tarde confirmado que o comportamento tigmotatismo neste ensaio é uma medida do comportamento da ansiedade relacionada com larvas do peixe 17. Havia diferenças significativas na circulação larvas longe da bola e de preferência para o bordo, quando comparado com o fundo em branco. Esses comportamentos também foram confirmados em nosso novo ensaio com a barra vermelha que se deslocam e são ainda mais robusta 16. Além disso, podemos agora experimentar um maior número de comportamentos em um único ensaio, incluindo a velocidade de natação, de descanso, de preferência para o final ou no lado do bem, ea distância entre os peixes (Figura 5). Larvas de controlo cultivadas na água ovo mostram um aumento da preferência a ser baixo no prato e na extremidade da pista de umepois eles são apresentados com um estímulo aversivo (movendo barra vermelha). Resultados semelhantes são obtidos quando as larvas são cultivadas em ovos de água contendo 1 ug / ml de DMSO, um solvente, que é normalmente utilizado para dissolver os diferentes produtos farmacêuticos e substâncias tóxicas como soluções de 1,000 X. Os resultados representativos são mostrados na Figura 5 em larvas tratadas com água e DMSO ovo (como controlos) e concentrações variadas de um dos pesticidas organofosforados comumente encontrados em alimentos não biológicos. Os resultados mostrados são de uma amostra a partir de um experimento. No entanto, quando repetida, os resultados indicam que a velocidade de mergulho e comportamento tigmotatismo é alterada por baixas concentrações de pesticidas organofosforados, que imitam os níveis de consumo humano 18. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> Figura 1. Bandejas de cobrança. Pratos de vidro Pyrex são usados ​​para coletar embryos dos tanques de peixes adultos. As tampas dos pratos Pyrex foram cortados e inseridos com grades de plástico e fio verde foi costurado para as grades do plástico. Isto cria uma atmosfera fértil para o peixe-zebra adultos, imitando o meio ambiente natural. <img alt="Figura 2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> Figura 2. Molde plástico e pistas de agarose. A) O molde é mostrado à esquerda. 0,8% de agarose é vertida sobre uma placa de um poço, o molde é introduzido lentamente e em seguida removido quando o agarose arrefecida B) A placa da direita mostra as vias criadas em agarose por o molde de plástico.. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> Figura 3. Armários de imagem. Armários de imagem foram specially construída no nosso laboratório e utilizados para análises de comportamento de alto rendimento. A 15 megapixel câmera digital foi anexado ao topo do gabinete virada para baixo, a fim de reunir imagens de lapso de tempo das larvas em placas multilane colocados no topo da tela de um laptop. Entre as placas e a tela existe um difusor de plástico que é utilizado para evitar padrões ondulados nas imagens recolhidas. <img alt="Figura 4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> Figura 4. Fundo branco e PowerPoint estímulo aversivo. Este é o atual PowerPoint que é usado para evocar mudanças comportamentais em larvas do peixe. Ele fornece as diferenças de comportamento entre os robustos A) o fundo branco e B) a barra vermelha em movimento. <img alt="Figura 5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> Figura 5. Comportamentos quantificados no ensaio de alto rendimento. Exemplo dos comportamentos que são quantificados a partir de nosso ensaio comportamental dentro da folha de Excel que usamos para x, y coordenadas das larvas. As barras brancas mostram os dados de larvas expostas a um fundo branco e as barras vermelhas mostram os dados do larvas expostas ao bar móvel vermelho no PowerPoint. Os gráficos indicam que as medições podem ser obtidas a partir de análise comportamental A) Percentagem de larvas para baixo na pista, B) Percentagem de larvas no final da pista, C) Percentagem de larvas na borda da pista, D) Distância entre peixe (mm), E) Swim velocidade das larvas (mm / min), F) Percentagem resto das larvas. Nos gráficos apresentados, os dados são de Treatment de larvas com controle DMSO e várias concentrações de um pesticida que vão ,001-,1 mM (níveis comumente encontrados na dieta humana). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> .

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Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

O nosso laboratório desenvolveu um novo sistema de imagem automatizado de alto débito, que é útil para a detecção de vários comportamentos diferentes em larvas de peixe-zebra de 7 dias de idade. O sistema pode ser utilizado para detectar alterações subtis no comportamento após as larvas foram expostas a agentes tóxicos ambientais ou de produtos farmacêuticos.

Automatizados análises comportamentais de alto rendimento em larvas do peixe

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K visualizações.  Brown University. O nosso laboratório desenvolveu um novo sistema de imagem automatizado de alto débito, que é útil para a detecção de vários comportamentos diferentes em larvas de peixe-zebra de 7 dias de idade. O sistema pode ser utilizado para detectar alterações subtis no comportamento após as larvas foram expostas a agentes tóxicos ambientais ou de produtos farmacêuticos.

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neurociência

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM Imaging and FIMtrack: Duas novas ferramentas que permitam de alta capacidade e Análise de Custo Efetivo Locomotion

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

Análise comportamental e fisiológica em um modelo de zebrafish de epilepsia

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

Usando larvas de zebrafish para estudar as conseqüências patológicas do curso hemorrágico

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This alternate immersion protocol is a noninvasive, step-wise method of inducing hyperglycemia for up to eight weeks. Adult zebrafish are alternately exposed to sugar (glucose) and water for 24 hours each. The zebrafish begin treatment in a 1% glucose solution for 2 weeks, then a 2% solution for 2 weeks, and finally a 3% solution for the remaining 4 weeks. Compared to water-treated (stress) and mannitol-treated (osmotic) controls, glucose-treated zebrafish have significantly higher blood sugar levels. The glucose-treated zebrafish show blood sugar levels of 3-times that of controls, suggesting that after both four and eight weeks hyperglycemia can be achieved. Sustained hyperglycemia was associated with increased Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and increased nuclear factor Kappa B (NF-kB)&#160;levels in retina and decreased physiological responses, as well as cognitive deficits suggesting this protocol can be used to model disease complications.

This protocol noninvasively induces hyperglycemia in zebrafish for up to 8 weeks. Using this protocol, an in-depth study of the adverse effects of hyperglycemia can be made.

Imersão alternativa em glicose para produzir hiperglicemia prolongada em zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

In vivo Imagens de todo o cérebro de larvas de peixe-zebra

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

Autor em destaque: Imagem in vivo de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...