Este trabalho foi suportado por uma concessão do &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; para SU Eisenhardt (EI 866/1-1).

1. Anestesia e Monitorização <ol><li> Apropriadas ética nacionais e institucionais devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Após a aprovação do Comitê de Ética anestesiam ratos machos Sprague Dawley com peso de 120-180 g. Entregar 2 - 3% vol isoflurano a uma caixa de acrílico através de vaporizador de isoflurano e coloque dentro de rato. </li><li> Logo que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de reacção ao dedo do pé ou pitada cauda) no rato é pesado e raspada na área ventral cervical. </li><li> Colocar o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C e aplicar isoflurano em 2% vol usando uma máscara de silicone. </li></ol> As etapas de preparação que se seguem são melhor realizada usando um microscópio cirúrgico. <ol start="4"><li> Para a preparação da traqueia, a artéria carótida ea veia jugular, executar uma incisão na pele 2 centímetros horizontal na área of fúrcula e mobilizar as glândulas salivares lateralmente. </li><li> Você agora enfrentam os músculos do pescoço ventral. Com cuidado, separe-os na linha média e encontrar a traquéia. Exponha 1 - 2 cm da traquéia e coloca uma pinça micro sob ele, de modo a levantá-lo. </li><li> Agora cortar a meio do lado ventral da traquéia. Tenha cuidado para não cortar todo o caminho, se você fizer isso, o corte final da traquéia vai escorregar de volta para o peito e ser muito difícil de trabalhar. </li><li> Inserir um tubo Abbocath (14G), utilizado como tubo traqueal para a parte inferior da traqueia, a qual tenha sido previamente ligado a um ventilador animal. Dica: fixação firme em grampos magnéticos, bem como a sutura da traquéia ao redor do tubo é essencial para manter o tubo traqueal no local. Geralmente usamos Terylene 5/0 de sutura, o material da sutura no entanto semelhante pode ser usada. </li><li> A respiração pode ser controlada a volume (freqüência, 35 - 45 respirações por minuto, volume corrente, 4,5 - 5 ml; FiO 2 </sub&gt;, 0,35-0,50;. isoflurano 1,5-2% vol) 14 Atelectasia pode ser evitada através da manutenção de um expiratória final positiva pressão de 5 a 10 mm de H2O 15 </li><li> Para a canulação da carótida, o músculo esterno-direito é separado por dissecção romba para localizar a artéria carótida. </li><li> Separe cuidadosamente o nervo vago a partir da artéria carótida e da artéria em montar uma pinça angulada micro para parar o sangue que flui do coração. </li><li> Passar duas peças de comprimento igual de sutura sob a artéria carótida. Em referência ao coração, a sutura mais distai está ligada firmemente para ocluir sangue que flui a partir da região da cabeça enquanto que a sutura proximal está ligado frouxamente em torno da artéria carótida. </li><li> Utilizando uma tesoura micro um pequeno corte é feito na artéria carótida entre as duas ligaduras. </li><li> Inserir um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) cheio com solução salina normal, que está ligado a um transdutor de pressão. </li><li> Remove a pinça micro e fios o cateter ainda mais para dentro da artéria. Em seguida, aperte a ligadura proximal ao redor da artéria e cateter. Dica: A aplicação de uma segunda sutura proximal impede o sangramento após a retirada da pinça micro. </li><li> Amarre a ligadura distal ao redor da carótida eo cateter para ancoragem adicional. </li><li> Monitorar a anestesia continuamente pela taxa de monitorização cardíaca e da pressão arterial. Realizar intermitentes análises de sangue arterial de gás utilizando um analisador de gás do sangue. 16 Uma taxa cardíaca inferior a 300 batimentos por minuto ou superior a 360 batimentos por minuto, bem como uma queda de pressão arterial média inferior a 80 mmHg durante mais de 5 minutos são critérios para exclusão. 17, 18 Manter sangue pH dentro dos limites fisiológicos (7,35 - 7,45). No caso do experimento deve ser finalizado devido a taxas anormais de monitoramento, escarificar o animal por deslocamento cervical ou exanguation. </li></ol> Para a aplicação intravenosa de corantes fluorescentes ou outros fármacos óf interesse, faça o seguinte: <ol start="17"><li> Concentre a área da veia jugular esquerda com o microscópio cirúrgico. </li><li> Com uma pinça em cada mão, rasgar a fáscia fina para revelar a veia jugular. Monte a veia em uma pinça de ângulo micro. O fluxo de sangue, então, parar. </li><li> Usando uma pinça, duas peças de comprimento igual de sutura são passados ​​sob a veia jugular concordante com a canulação da carótida. Amarre a sutura distal bem como a sutura proximal frouxamente em torno da veia jugular. </li><li> Fazer um pequeno corte na veia jugular e inserir um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) que foi lavada com solução salina. Marcar que incisão e canulação pode ser mais exigente e demorado do que a da carótida. </li><li> Passe o cateter para o coração e apertar a ligadura mais próximo do coração em torno da veia e do cateter. </li><li> Depois de permeabilidade conforme, amarre ligadura distal ao redor do cateter. Dica: fixação adicional de boª cateteres com fita pode impedir o deslocamento. </li><li> Lavar cateteres com freqüência para evitar a coagulação intraluminal. </li></ol> 2. Preparação do músculo cremaster <ol><li> Nós usamos um estágio de alumínio de 1,5 - 2 cm de espessura para imagens cremastérico. A fase rapidamente adopta a temperatura desejada da almofada de aquecimento assim aliviando controlo térmico do tecido cremastérico. Isso é fundamental para estudos de inflamação. Alternativamente, uma plataforma de Plexiglas podem ser utilizados embora a regulação da temperatura cremastérico é mais difícil. Coloque o escroto no centro da fase. </li><li> A incisão inicial é feita na pele e fáscia espermática externa acima do escroto no final distal seguido de dilatação cuidado com o espaço subcutâneo com uma tesoura fina. Evite tocar o tecido subjacente com os instrumentos. </li><li> Logo que o tecido é exposto é humedecido com pré-aquecido (37 ° C) solução salina tamponada com fosfato wicálcio e magnésio th. Aplicar a solução regularmente para qualquer tecido exposto. </li><li> O tecido conjuntivo entre a fáscia espermática externa eo músculo cremaster é cuidadosamente removida para liberar o músculo cremaster do tecido circundante. </li><li> A superfície exterior do músculo cremaster é, então, cautelosamente limpo de tecido conectivo. Superfusão contínua durante hidratos de dissecação do tecido conjuntivo, facilitando a visibilidade e remoção. </li><li> Suturar a extremidade distai do saco cremaster para segurar para baixo e ligeiramente estender a extremidade do saco. </li><li> Faça uma incisão na extremidade distal do saco na face ventral e alongar a incisão proximalmente com uma tesoura micro. Cuidadosamente cauterizar vasos sangrantes ao longo das linhas de incisão utilizando um termo-cautério. Evite a cauterização desnecessária para limitar adicionais estímulos inflamatórios. Dica:. Dinâmica do fluxo sanguíneo perto da periferia da preparação são alterados por este dano tecidual 19 Portanto, para minimizar oSE afecta a recolha de dados, os vasos sanguíneos, perto do centro da preparação deve ser usado para geração de imagens. </li><li> O cremaster aberto fica encostado ao pedestal de alumínio embora ainda ligados por um ligamento fino para o epidídimo debaixo do testículo. Refletindo o testículo de um lado expõe esse ligamento, incluindo uma pequena artéria e veia que liga ao epidídimo. Use o cautério para selar os vasos e empregar as tesouras micro para cortar o ligamento conectivo entre testículo e tecido cremastérico. </li><li> Com cuidado, empurre de volta ao testículo isolado dentro do canal inguinal. Outros autores ressecção do testículo após a ligadura proximal (orquiectomia), juntamente com a almofada de moda associada inguinal 20. Em um modelo sensível como IRI ativação induzida leucócitos tentamos evitar todos os estímulos adicionais cirúrgicos, portanto, abster-se de ressecção do testículo, que normalmente não é necessária para obter uma exposição suficiente do músculo cremaster. </li><li> Além da primeirasutura de fixação quatro arestas de tecido (duas de cada lado) e unem os segmentos para fitas a cautelosamente espalhar o tecido cremastérico radialmente sobre a fase de alumínio. Deixando uma lacuna entre o estágio de alumínio e entrada externa do canal inguinal simplifica recorte cremastérico subseqüente para isquemia. </li><li> Coloque duas extremidades do cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) próximo ao tecido cremastérico para a configuração superfusão. Assegure-se que o lúmen é livre de ar para evitar bolhas de ar na câmara de fluido eventual. </li><li> Desenhar uma linha de vaselina (vaselina) em torno do músculo cremaster usando uma seringa. A linha deve estender-se o tamanho da lâmina de cobertura que é usado para a cobertura. </li><li> Para criar uma câmara de fluido, colocar uma lamela quadrado (32 × 32 mm) sobre o tecido cremastérico e firmemente ligar as pontas para a linha de vaselina. </li><li> No caso de o tecido não está cremastérico superfused com uma droga específica, a substituição contínua da gripe circundanteID não é essencial. Uma única aplicação de solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio para dentro da câmara criada pode então ser suficiente. Estimulação local com drogas no entanto deve ser realizada de forma contínua através de micro-perfusão bomba a uma taxa de 3 ml por hora. </li><li> O tecido cremastérico está agora pronto para a imagem latente microscópica. </li></ol> 3. Configuração intravital A configuração básica intravital pode variar. Para imagens de epifluorescência, os experimentos devem ser executados em um quarto escuro. <ol><li> O animal é transferida para o estágio de um microscópio de epifluorescência intravital equipado com um LED 470 nm fonte luminosa para epi-iluminação. Usar uma objectiva de imersão em água (20 × / 1,0) para atingir a ampliação de cerca de 800 ×. Registre as observações por meio de uma câmera de alta resolução digital e armazenar registros em um computador pessoal para avaliação off-line. </li><li> Para a rotulagem de leucócitos, injetar rodamina6G por via intravenosa através do cateter jugular em concentrações de 0,4 peso corporal mg / kg. </li><li> Escolha uma vênula postcapillary para observação. Tamanho do vaso deve variar entre 20-60 mM e fluxo de sangue deve ser suficiente. Para minimizar a influência da pré-activação do tecido, apenas os vasos em que rolamento de leucócitos é inferior a 20 cells/30 segundo e do número de células aderentes &lt;10 cells/200μm de endotélio venular podem ser utilizados para análise posterior. </li><li> Se possível, até três vénulas pós-capilares podem ser utilizados para observação, contudo eles devem estar localizado numa secção correspondente do tecido cremastérico para evitar confusão dos vasos em pontos de tempo diferentes. </li></ol> 4. Isquemia-reperfusão (IIR) <ol><li> Deixe tecido estabilizar durante 30 minutos. </li><li> Realizar uma gravação de 30 segundos para estabelecer os valores basais de rolamento de leucócitos e aderência. Idealmente, gerar um total de três gravações basais para verificar celularnúmeros e para obter desvios-padrão. </li><li> Suavemente colocar um clipe vaso Biemer em torno da extremidade proximal muito do tecido exposta cremastérico usando os fórceps de aplicação. Estase deve ocorrer imediatamente e pode ser visualizada por microscopia de epifluorescência na secção do vaso observada. </li><li> Uma variedade de cursos de tempo podem ser utilizados dependendo do nível de prejuízo requeridos. Nós aplicamos 30 minutos de tempo de isquemia, como descrito por outros autores. 21-23 Retire o grampo navio depois. Permitir fluxo de sangue para estabilizar durante mais 15 minutos. </li><li> Gravações subsequentes de 30 segundos de duração pode ser feita ao longo do período de reperfusão (por exemplo, 30 segundos cada 15 minutos). Guarde as gravações digitalmente para análise offline. </li><li> Para o fim da experiência, o rato é sacrificado por deslocamento cervical, sob anestesia suficiente premindo um instrumento rombo, tais como a borda monótona de uma lâmina de tesoura na base do crânio. Com a outramão, a base da cauda é rapidamente puxado, causando a separação das vértebras cervicais a partir do crânio. </li></ol> 5. Análise reprodução offline Vídeo <ol><li> Para análise offline reprodução de vídeo é útil para usar o software que permite a seleção de imagens distintas e observação da seqüência de vídeo em câmera lenta. Ajuste o contraste eo brilho de forma adequada. Usamos software fornecido pelo fabricante do microscópio que permite medições de comprimento e de ampliação digital. </li><li> Para a quantificação do rolamento de leucócitos, definem uma linha virtual que intersecta o vaso verticalmente que é consistente em todos os registos. Contar o número de leucócitos de rolamento que passam a linha dentro de 30 segundos manualmente. </li><li> Para a quantificação dos leucócitos aderentes, definem uma secção do vaso 200 iM que é consistente em todos os registos 23 Contar o número de leucócitos claramente visíveis que permanecem estática durante 30 segundos -. Assim definidoresed como aderentes 24. </li></ol> 6. Os resultados representativos IRI do músculo cremaster não tem nenhum efeito sobre a pressão arterial média (MAP), a frequência cardíaca eo pH do sangue Utilizando a configuração acima mencionada (Figura 1), foi investigada a microcirculação em IRI ao longo de um protocolo de duas horas, no entanto um tempo de observação muito mais tempo até 6 horas é possível. Como mostrado na Figura 2, o IRI do músculo cremaster não tem efeitos significativos sobre a circulação macrohemodynamic rato como a pressão arterial média e da frequência cardíaca permanecer estável durante todo o período de investigação. Além disso, monitoramos homeostase por meio de medições freqüentes do pH do sangue arterial, que variaram dentro dos limites fisiológicos e não mostrou significativas entre grupos de diferenças. IRI induz rolamento de leucócitos na circulação cremastérico Interação endotelial de leucócitos é uma chaveevento na inflamação aguda. Por meio de microscopia intravital foi observado um aumento dependente do tempo no número de leucócitos de rolamento em IRI do músculo cremaster (Figura 3A) concordantes com os dados anteriores 21, 25. Rolamento montado sobre o tempo de observação de duas horas para um máximo de 137,63 ± 22,55% do valor de linha de base após 120 minutos de tempo de reperfusão e, em seguida, atingiram significância estatística em comparação com animais operação simulada (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% do valor de linha de base). IRI induz a adesão de leucócitos na circulação cremastérico Para a avaliação adicional de leucócito-endotelial interacção analisamos a adesão de leucócitos em uma secção do vaso 200 uM. IRI induziu um aumento no número de leucócitos aderentes que excedeu significativamente os valores de operação simulada animais após 60 minutos (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% do valor de linha de base) e ainda mais ASCEnded por 120 minutos de reperfusão (Figura 3B). Em resumo, o descrito no modelo in vivo fornece dados consistentes de ativação leucocitária aguda em IRI sobrevivência animal, enquanto a circulação ea estabilidade é garantida. <img src="/files/ftp_upload/3973/3973fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. A. Fluxograma para o desempenho de microscopia de epifluorescência intravital na isquemia-reperfusão do músculo cremaster de rato. Após os preparativos necessários para anestesia e monitoramento, o músculo cremaster de rato é exposto para a imagem latente. Registros de ativação leucocitária são tomadas antes e depois da isquemia tecidual. Análise de vídeo subsequente é melhor executada offline. B. Figura esquemática da configuração proposta intravital. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3973/3973fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within página = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3973/3973fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. IRI do músculo cremaster não tem nenhum efeito sobre a pressão arterial média (MAP), ritmo cardíaco e pH do sangue. A pressão arterial média (A) e da frequência cardíaca (B) foram monitorizados a cada 30 minutos durante toda a experiência através de transdutor de pressão após canulação da direita da artéria carótida. A medição do pH do sangue arterial-(C) foi realizada após 0, 60 e 120 minutos. Valores são média ± EPM de 6 animais diferentes, variando em níveis fisiológicos, sem diferenças significativas inter-grupos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3973/3973fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3973/3973fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. IRI aumenta leucócitos-Endotelial interacção na circulação cremastérico. Após marcação de leucócitos com rodamina 6G (0,4 peso corporal mg / kg) microscopia de epifluorescência intravital foi utilizado para determinar leucócito-endotelial de interacção em lesão de reperfusão através de um protocolo minutos 120 após 30 minutos de isquemia de tecido. Registos foram tomadas a ampliação de cerca de 800 ×. A. IRI aumenta significativamente o número de leucócitos de rolamento em vénulas pós-capilares do músculo cremaster por 120 minutos de reperfusão Considerando rolamento de leucócitos permanece estável ao longo da experiência no tecido cremastérico que não foi submetido a isquemia. Os valores são média ± SEM de 6 ratos observados. # P &lt;0,05 utilizando o teste t não emparelhado. B. O número de leucócitos aderentes é significativamente aumentada em uma secção do vaso escolhido aleatoriamente 200μm postcapillary após 30 minutos de isquemia cremastérico e subsequentes 60 minutos de reperfusão do tecido. Resultados ficar ainda more pronunciado após um período de reperfusão de duas horas. Os valores são média ± SEM de 6 ratos observados. # P &lt;0,05 utilizando o teste t não pareado. Imagens representativas C. de uma vênula postcapillary antes da isquemia (esquerda) e 120 minutos após o IRI (direita). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3973/3973fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation.">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).</li><li>Mori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+induced+microvascular+responses+in+LDL-receptor+-/-+mice.">Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice.</a> Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).</li><li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Molecular+Changes+Induced+by+Ischemia/Reperfusion+in+Human+Free+Muscle+Flap+Tissue+Samples.">Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples.</a> Ann. Plast. Surg. , (2011).</li><li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+activation-specific+human+anti-{alpha}M{beta}2+single-chain+antibodies+as+potential+diagnostic+tools+and+therapeutic+agents.">Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents.</a> Blood. 109, 3521-3528 (2007).</li><li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+pentameric+to+monomeric+C-reactive+protein+on+activated+platelets+localizes+inflammation+to+atherosclerotic+plaques.">Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques.</a> Circ Res. 105, 128-137 (2009).</li><li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-reactive+protein:+how+conformational+changes+influence+inflammatory+properties.">C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties.</a> Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).</li><li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , 520 (1995).</li><li>Baatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+white+blood+cell+staining+by+intravascular+administration+of+rhodamine+6G.">Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G.</a> Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li><li>Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fluorescent+dyes+on+selectin+and+integrin-mediated+stages+of+adhesion+and+migration+of+flowing+leukocytes.">Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes.</a> J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Leucócito-endotelial interacção, a produção de espécies reactivas de oxigénio e de activação do sistema do complemento são as principais características de IRI induzida por disfunção do tecido. 26 microcirculação A do tecido afectado é considerado como o local integral para o início inflamatória. Para além de experimentações ex vivo, tais como ensaios de câmara de fluxo 27, 28, é obrigatória a existência de modelos bem-estabelecidos de imagem intravital para avalia...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do equipamento: </td><td> Empresa: </td><td> N º de Catálogo: </td><td> Comentários: </td></tr><tr><td> Forene 100% (V / V) </td><td> Abade </td><td> B506 </td><td> API isoflurano </td></tr><tr><td> Terylene Sutura </td><td> Serag Weissner </td><td> OC108000 </td><td></td></tr><tr><td> Portex fina Diâmetro Tubos de polietileno </td><td> Smiths Medical </td><td> 800/100/100 </td><td> 0,28 mm de diâmetro interno </td></tr><tr><td> 0,9% de solução salina </td><td> Fresinus Kabi </td><td> 808771 </td><td></td></tr><tr><td> Mudanças-A ponta de luxo kit cauterização </td><td> Bovie Medical </td><td> DEL1 </td><td></td></tr><tr><td> Abbocath-T 14G </td><td> Venisystems </td><td> G713- A01 </td><td> utilizado como tubo de lente </td></tr><tr><td> Ventilador Servo 900C </td><td> Maquet </td><td></td><td> utilizado como ventialtor animais </td></tr><tr><td> Transdutor de pressão lógico </td><td> Smiths Medical </td><td> MX1960 </td><td></td></tr><tr><td> Sirecust 404 monitor </td><td> Siemens </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ABL 700 bancada Analyzer </td><td> Radiômetro </td><td></td><td> para medição de gás de sangue </td></tr><tr><td> Almofada de aquecimento </td><td> Effenberger </td><td> 8319 </td><td></td></tr><tr><td> Estágio de alumínio </td><td> Alfun </td><td> AW7022 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio cirúrgico OPMI 6-SDFC </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microcirúrgica instrumentos de laboratório set </td><td> S &amp; T </td><td> 767 </td><td></td></tr><tr><td> Biemer clipe de navio </td><td> Diener </td><td> 64,562 </td><td></td></tr><tr><td> Aplicando fórceps </td><td> Diener </td><td> 64,568 </td><td> para Biemer clipe de navio </td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4127 </td><td></td></tr><tr><td> Vaseline branco DAB </td><td> Winthrop </td><td> 2726853 </td><td></td></tr><tr><td> Cubra óculos </td><td></td><td></td><td> 32x32 milímetros </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Configuração intravital </td></tr><tr><td> Zeis Axio Scope A-1 MAT </td><td> Carl Zeis </td><td> 490036 </td><td> microscópio de epifluorescência </td></tr><tr><td> 470 nm LED </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td> fonte de luz de fluorescência </td></tr><tr><td> Colibri Sistema 2 </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td></td></tr><tr><td> W Plano Apochromat-20x / 1,0 DIC </td><td> Carl Zeis </td><td> 421452 </td><td> objetiva de imersão de água </td></tr><tr><td> AxioCam MRM Rev. 3 FireWire </td><td> Carl Zeis </td><td> 426509 </td><td> de alta resolução da câmera digital </td></tr><tr><td> Axio LE visão software </td><td> Carl Zeis </td><td> 410130 </td><td> utilizar para análise offline </td></tr></tbody></table>

real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (iri) of the rat cremaster muscle

Isquemia-reperfusão (IRI) tem sido implicado em uma grande variedade de condições patológicas tais como acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, isquemia intestinal, assim como após o transplante, e cirurgia cardiovascular. 1 reperfusão do tecido isquémico anteriormente, enquanto essencial para a prevenção de irreversível lesão tecidual, elicia inflamação excessiva do tecido afectado. Adjacente à produção de espécies reactivas de oxigénio, activação do sistema do complemento e aumento da permeabilidade microvascular, a activação de leucócitos é um dos agentes princípio na cascata patológico do dano tecidual inflamatória durante a reperfusão. 2, 3 activação dos leucócitos é um processo em várias etapas consistindo de laminagem, adesão firme e transmigração e é mediada por uma interacção complexa entre moléculas de adesão, em resposta a chemoattractants tais como factores do complemento, quimiocinas, ou factor de activação de plaquetas. 4 &lt;p = classe &quot;jove_content&quot;&gt; Enquanto circulante de leucócitos em vénulas pós-capilares é predominantemente mediado pela interacção das selectinas 5 com os seus ligandos de balcão, adesão firme dos leucócitos ao endotélio é-selectina controlada através da ligação a moléculas de adesão intercelular (ICAM) e celular vascular As moléculas de adesão (VCAM). 6, 7 Padrão-ouro para a observação em vivo de leucócito-endotelial interação é a técnica de microscopia intravital, descrita pela primeira vez em 1968 8. Embora vários modelos de IRI (isquemia-reperfusão) têm sido descritos para vários órgãos, 9-12 apenas poucos são adequados para a visualização directa do recrutamento de leucócitos no leito microvascular em um elevado nível de qualidade de imagem. 8 Nós aqui promover a microscopia de epifluorescência intravital digitais da vênula postcapillary na microcirculação cremastéricodo rato 13 como um método conveniente para qualitativamente e quantitativamente analisar o recrutamento de leucócitos para a pesquisa IRI-no tecido do músculo estriado e fornecer um manual detalhado para a realização da técnica. Nós ilustrar ainda mais as armadilhas comuns e fornecer dicas úteis que deverão permitir ao leitor a apreciar verdadeiramente, e executar com segurança o método. Em um passo a passo protocolo que descrevem como começar com anestesia respiração controlada sob monitorização suficiente para manter o animal anestesiado com firmeza por longos períodos de tempo. Em seguida, descrevem a preparação cremastérico como uma folha fina e plana para a resolução óptica surpreendente e fornecer um protocolo para imagiologia de leucócitos no IRI que tem sido bem estabelecidas nos nossos laboratórios.

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Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial interação<em&gt; In vivo</em&gt; Na isquemia-reperfusão (IRI) do tecido muscular estriado. Nós aqui fornecer um protocolo detalhado para executar com segurança a técnica e discutir suas aplicações e limitações.

Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

real-time-digital-imaging-leukocyte-endothelial-interaction-ischemia

Research

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Medicine

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

15.0K visualizações.  University of Freiburg Medical Centre. Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial interação In vivo Na isquemia-reperfusão (IRI) do tecido muscular estriado. Nós aqui fornecer um protocolo detalhado para executar com segurança a técnica e discutir suas aplicações e limitações.

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In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

Free tissue transfer is the gold standard of reconstructive surgery to repair complex defects not amenable to local options or those requiring composite tissue. Ischemia reperfusion injury (IRI) is a known cause of partial free flap failure and has no effective treatment. Establishing a laboratory model of this injury can prove costly both financially as larger mammals are conventionally used and in the expertise required by the technical difficulty of these procedures typically requires employing an experienced microsurgeon. This publication and video demonstrate the effective use of a model of IRI in rats which does not require microsurgical expertise. This procedure is an in situ model of a transverse abdominis myocutaneous (TRAM) flap where atraumatic clamps are utilized to reproduce the ischemia-reperfusion injury associated with this surgery. A laser Doppler Imaging (LDI) scanner is employed to assess flap perfusion and the image processing software, Image J to assess percentage area skin survival as a primary outcome measure of injury.

In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

Free tissue transfer is widely employed in reconstructive surgery to restore form and function following oncological resection and trauma. Preconditioning this tissue prior to surgery may improve outcome. This article describes an in situ transverse rectus abdominis myocutaneous flap (TRAM) in rats as a means for testing preconditioning strategies.

In situ transversal reto abdominal miocutâneo: um modelo de rato de miocutâneo Isquemia Traumatismo por Reperfusão

Free tissue transfer is the gold standard of reconstructive surgery to repair complex defects not amenable to local options or those requiring composite ...

Medicina

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

Isquemia-reperfusão modelo de lesão renal aguda e Pós Lesão fibrose em camundongos

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Modelo murino de isquemia-reperfusão

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

Avaliação da reserva de fluxo coronariano após reperfusão de isquemia miocárdica em ratos

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many areas of biomedical research due to its cost-effectiveness and its translation to humans. This protocol describes a method to create a preclinical free skin flap model in rats with ischemia-reperfusion injury. The described 3 cm x 6 cm rat free skin flap model is easily obtained after the placement of several vascular ligatures and the section of the vascular pedicle. Then, 8 h after the ischemic insult and completion of the microsurgical anastomosis, the free skin flap develops the tissue damage. These ischemia-reperfusion injury-related damages can be studied in this model, making it a suitable model for evaluating therapeutic agents to address this pathophysiological process. Furthermore, two main monitoring techniques are described in the protocol for the assessment of this animal model: transit-time ultrasound technology and laser speckle contrast analysis.

Here, we describe a pre-clinical animal model for studying the pathophysiology of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery. This free skin flap model based on the superficial caudal epigastric vessels in the rat may also allow for the evaluation of different therapies and compounds to counteract ischemia-reperfusion injury-related damage.

Um modelo pré-clínico do rato para o estudo da lesão da Isquemia-reperfusion na microcirurgia reconstrutiva

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

Lesão por Isquemia-Reperfusão de Órgãos simulando alterações hemodinâmicas no modelo de transplante de fígado de rato

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

Avaliação em tempo real da microperfusão da medula espinhal em um modelo suíno de isquemia/reperfusão

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...