Este método prático e reprodutível pode ser usado para visualizar as interações de leucócitos endotélio que levam ao recrutamento de leucócitos dentro de um rato intacto. Esta técnica também apresenta uma poderosa ferramenta para o monitoramento de processos fisiológicos e fisiofiológicos dentro da cascata de recrutamento de leucócitos in vivo. O método pode ser aplicado em diferentes modelos inflamatórios e sépticos.
Por exemplo, recentemente destacamos sua relevância no estudo de musculopatias envolvendo infiltração de leucócitos musculares exagerados. Nossa sugestão para colegas cientistas que estão considerando usar essa técnica é obter o máximo de experiência prática possível, pois o método é muito suscetível a pequenos desvios. Demonstrando o procedimento será Simon Kranig, um clínico e cientista sênior do meu laboratório.
Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no animal experimental anestesiado, fixe o rato em uma posição dorsal recumbent em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus e use uma sutura estéril nãoabsorbável para enrolar um simples laço ao redor dos dentes frontais. Tape as extremidades de junção da sutura na almofada de aquecimento e use pinças para levantar suavemente a pele na linha média. Em seguida, faça uma incisão circular de um a dois centímetros de diâmetro sobre o pescoço e o tórax superior e use pinças para dissecar cuidadosamente os tecidos musculares, gordos e conjuntivos circundantes.
Coloque uma sutura sob a traqueia. Use uma pequena tesoura cirúrgica para fazer um corte transverso de aproximadamente 1,3 milímetros na traqueia e introduzir um tubo de polietileno na extremidade caudal da traqueia para proteger as vias aéreas superiores. Fixar o tubo localizado com uma única sutura de nó circular e localizar a artéria carótida ao longo do lado direito da traqueia.
Dissecar o tecido circundante da parede da artéria carótida e passar dois pedaços de sutura sob a artéria. Amarre a primeira sutura craniana proximal à bifurcação das artérias carótidas e posicione a segunda sutura cerca de cinco a oito milímetros distal da primeira sutura sem amarrar. Em seguida, conecte um pedaço de 30 centímetros de tubo de polietileno a uma agulha de seringa de um mililitro cheia de soro fisiológico e use um clipe de vaso de sete milímetros para fixar a artéria carótida distally à segunda sutura.
Faça um corte transverso de aproximadamente 0,5 milímetros na artéria carótida e introduza o tubo de polietileno estéril na artéria. Fixar o tubo com a segunda sutura e remover o clipe do vaso. Em seguida, deprimir suavemente o êmbolo da seringa para jogar soro fisiológico no vaso.
Para preparar o músculo cremaster, transfira o mouse para uma estrutura de microscópio plástico feita sob medida com o escroto voltado para o estágio do microscópio e segure cuidadosamente o escroto em sua extremidade mais distal com pinças. Puxando o escroto suavemente, remova uma seção circular de cerca de cinco milímetros de diâmetro da pele escrotal mantendo o tecido aberto bem hidratado com soro fisiológico. Use duas pinças para dissecar o tecido conjuntivo solto e localizar ambos os testículos.
Compre um teste é distally e suavemente começar a retirar o tecido reprodutivo removendo qualquer tecido conjuntivo circundante passo a passo. Uma vez que o testísta tenha sido exteriorizado, fixar a extremidade distal do tecido ao anel de borracha ao redor do palco e hidratar o tecido com soro fisiológico. Em seguida, remova cuidadosamente o tecido conjuntivo sem prejudicar o músculo cremaster subjacente.
É fundamental remover todo o tecido conjuntivo que resultaria em imagens embaçadas sem prejudicar o músculo cremaster subjacente. Quando todo o tecido tiver sido removido, faça uma incisão transversal de um milímetro para abrir o músculo cremaster antes de fazer uma incisão longitudinal do muito distal à extremidade proximal do tecido. O músculo deve abrir esfericamente.
Espalhe cuidadosamente o músculo sobre a fase de vidro e fixe o músculo no anel de borracha tomando cuidado para não tocar ou prejudicar a região central do tecido. Em seguida, fixar o restante do testígico para o lado para dar acesso à região de interesse e hidratar o tecido com PSS. Para visualização intravital da vasculatura muscular, coloque o músculo cremaster montado no microscópio vertical e selecione o objetivo de 40X.
Realize as gravações sob superfusão contínua com PSS de 35 a 37 graus Celsius através de um pedaço de pequeno tubo que foi colado ao objetivo vertical do microscópio para permitir o gotejamento contínuo de PSS ao lado do objetivo até o músculo e tecido. Identifique as venules pós-capilares. Meça a microcirculação em venules com diâmetro de 20 a 40 micrômetros.
Em seguida, registre imagens de alta resolução da microcirculação do músculo cremaster durante um período de 30 segundos, ajustando continuamente o foco devido a pequenas alterações na contração e relaxamento do tecido muscular. O excesso de tecido conjuntivo pode levar a imagens microscópicas embaçadas. Nesta imagem microscópica representativa, os venules pós-capilares que devem ter entre 20 e 40 micrômetros de diâmetro podem ser identificados pela confluência de dois vasos menores.
Leucócitos aderentes e rolando podem ser visualizados enquanto os leucócitos circulantes só podem ser rastreados em replay em câmera lenta de vídeos gravados. Uma infinidade de parâmetros pode afetar o recrutamento de leucócitos in vivo, incluindo a saída cardíaca, diâmetro do vaso, velocidade central, taxa de corte de parede e número de leucócitos circulantes. Observe que a velocidade central é influenciada pela saída cardíaca, resistência vascular periférica e volume intravasal.
Por exemplo, um grande volume de Rhodamine ou outra substância experimental dada através do cateter carótida aumenta a velocidade central pós-capilar e inibe a captura e rolamento de leucócitos. Pelo contrário, insuficiência cardíaca, anestesia profunda ou hipotermia podem diminuir o fluxo pós-capilar. Para determinar a velocidade da linha central, podem ser usados leucócitos fluorescentes que circulam livremente ou os leucócitos devem ser tingidos com reagentes fluorescentes como Rhodamine.
Observe que cepas de tipo selvagem podem mostrar variância fisiológica. Por exemplo, os camundongos C57BL/6 demonstram claramente melhor rolamento de leucócitos, adesão e transmigração em comparação com animais C57BL/10ScSn. As etapas de planejamento e padronização são importantes para dominar a técnica especialmente durante a preparação do músculo cremaster para microscopia.
Outros métodos para visualizar o recrutamento de leucócitos podem ser conduzidos para produzir informações adicionais e ajudar a dissecar a contribuição individual de leucócitos e células endoteliais para a cascata de recrutamento. Esta técnica fornece uma plataforma para a avaliação pré-clínica de meditadores farmacológicos e novas substâncias modulatórias imunológicas.
