Estes estudos foram financiados, em parte, pela Boston das Crianças Urologia Hospital Fundo Receita Endowment e do National Institutes of Health bolsas NIBIB P41-EB002520 (Kaplan); NIDDK T32-DK60442 (Freeman); NIDDK 1K99-DK083616 (Mauney). Reconhecemos Dr. Peter Zvara da Universidade de Vermont para a assistência no estabelecimento da técnica de colocação de tubos de cistostomia e cistometria.

Os métodos cirúrgicos 1. Preparação Cirúrgica e Anestesia <ol><li> Configure o campo cirúrgico estéril com os instrumentos necessários cirúrgicos: tesouras de barbear, pinças com dentes, finas pinças atraumáticas, motorista agulha fina, gaze, tesoura, tesoura Metzenbaum tenotomia, lâmina de bisturi, agulha hipodérmica calibre 30, encheu salina seringa de 1 mL, quatro 6-0 de polipropileno, poliglactina 7-0 sutura, sutura poliglactina 4-0. </li><li> Anestesiar o animal com a inalação de isoflurano na câmara de indução. Confirme indução completa do animal antes de transferir para o campo cirúrgico. Assegure-se que o tubo de anestesia por inalação está na posição apropriada para ter anestesia contínua. </li><li> Coloque o animal em decúbito dorsal a cortina estéril. [Para a análise cistométrica, consulte a seção abaixo na tunelização do cateter de cistostomia.] </li><li> Use a tesoura de corte para remover a pele da parte inferior do abdômen. </li><li> Preparação do abdômen com atadine e etanol a 70%. </li><li> Antes da incisão, um analgésico tal como buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) pode ser injectado por via subcutânea para controlo da dor perioperatória. </li></ol> 2. Incisão e exposição da Bexiga <ol><li> Fazer um centímetro 1-2 (dependente do tamanho do animal e se rato ou ratinho) incisão na linha média inferior com o bisturi através da pele. Aprofundar a incisão na porção inferior da incisão através do músculo rectus tomando cuidado para não ferir o intestino subjacente ou da bexiga. </li><li> Utilizando uma pinça dentada, elevar o músculo reto e dissecar a superfície livre posterior do músculo com uma tesoura Metzenbaum finas. </li><li> Incisão no restante do músculo na linha média para o comprimento de toda a sua incisão da pele. </li><li> Entregar a bexiga através da ferida incisional (Figura 1). A bexiga é geralmente o órgão mais dependente na pelve. (No homem, a próstata é realmente mais dependente e é maior do que obexiga descomprimido.) </li><li> O local de estadia sutura uma através da parede posterior da bexiga, e em seguida uma outra através da parede anterior da bexiga usando 6-0 fio de polipropileno. Coloque pontos adicionais lateralmente. Não amarrar essas suturas. Quando as suturas são mantida esticada, a bexiga terá uma configuração quadrada medindo aproximadamente 1 cm 2 (Figura 2). Tenha cuidado para não ter muita tensão sobre estas suturas como eles podem facilmente ser puxado através do tecido da bexiga. </li><li> Incisão da bexiga longitudinalmente através da parede anterior da bexiga (apenas inferior à cúpula da bexiga) na linha média para cerca de 1 cm (1,5-2 cm na bexiga de rato). </li></ol> 3. Anastomose do andaime <ol><li> Com uma tesoura fina, cortar o andaime de seda para a área aproximada da lesão da bexiga. </li><li> Usando sutura de poliglactina 7-0, começar em um canto do andaime e sutura da bexiga em um processo contínuo, executandomoda para criar uma vedação estanque a toda a volta do defeito (Figura 3). </li><li> Testar a integridade da anastomose por enchimento da bexiga com uma solução salina estéril por incutir-lo através da parede da bexiga com uma agulha hipodérmica de calibre 30. Se um vazamento for encontrado, este pode ser fechado com uma sutura de poliglactina adicional interrompido 7-0 para fechar a lacuna. </li><li> Reduzir a volta da bexiga reconstruída no abdômen. </li></ol> 4. Encerramento Incisional <ol><li> Antes do encerramento da parede abdominal, injectar o músculo rectus e tecido subcutâneo com bupivicaine para anestesia local (&lt;3 mg / kg de 0,25%). </li><li> O músculo reto Reapproximate com uma sutura contínua de poliglactina, correndo por 4-0. </li><li> Feche a pele com uma sutura contínua de poliglactina, correndo por 4-0. </li><li> Limpar e secar a incisão (Figura 4). </li><li> Transfira o animal em uma gaiola, morna limpa para o despertar da anestesia. </li></ol&gt; Os passos para a colocação do cateter cistostomia para análise cistométrica são como se segue: 5. Tunelização do cateter de cistostomia <ol><li> Configure o campo cirúrgico estéril com os instrumentos necessários cirúrgicos: tesouras de barbear, pinças com dentes, finas pinças atraumáticas, motorista agulha fina, gaze, tesoura Metzenbaum, tesoura tenotomia, pinça curva pequena, lâmina de bisturi, de polipropileno 6-0, 4-0 poliglactina sutura, 3-0 sutura de seda (sutura de seda 4-0 para ratos), agulha 18G, 22G a ponta da agulha romba, agulha 25G, 1 mL de seringa preenchida salina, tubagem de polietileno 50 (PE-50) cortada para um comprimento de 10 ~ cm. </li><li> Incendiar o final do tubo de PE-50 por suavemente expondo-o a uma chama. Tenha cuidado para não derreter o final desligado ou ocluir a luz (isto pode ser verificado pela injeção de solução salina através de uma agulha 25G conectado ao &quot;não-queimado&quot; final e garantindo o fluxo). Isto serve como uma âncora para manter o tubo dentro da bexiga (Figura 5). </li><li&gt; Anestesie o animal, tal como acima no passo 1.2. </li><li> Use as tesouras de corte para remover o pêlo, tanto do dorso do animal entre a escápula e parte inferior do abdómen na ventrum. </li><li> Prep as áreas com betadine e etanol a 70%. Coloque o animal deitado no pano. </li><li> Faça uma incisão de 1 cm no dorso entre a escápula. Usando o tesoura Metzenbaum, desenvolver um plano entre a pele eo músculo subjacente, colocando as pontas dos tesoura no plano e espalhando-los para criar um túnel em torno do abdómen ventral. </li><li> Reposicionar o supino animal. Fazer a sua incisão abdominal e expor a bexiga como acima nos passos 2,1-2,4. Reduzir a bexiga volta para o abdômen. </li><li> Coloque um grampo pequeno em seu túnel subcutâneo criado em 5,6 passo a partir de sua incisão na pele dorsal. Usando os dedos para proteger o conteúdo intra-abdominais, perfuram através da parede abdominal com as pontas da pinça no abdômen. </li><li> Segure a sMooth final do tubo de PE-50 com a braçadeira e puxá-lo de volta através da incisão dorsal. Assegurar que a extremidade bulbed não é puxado após a parede abdominal (Figura 6). </li></ol> 6. Colocar o tubo Cistostomia <ol><li> Entregar a bexiga através da incisão. Deste ponto em diante, a bexiga deve ser tratado com pinças finas para evitar trauma à bexiga que poderia causar lesão ou inflamação que pode distorcer os resultados cistometria ou resultar em desconforto adicional para o animal no pós-operatório. </li><li> Anote o local proposto para o tubo de cistostomia. Ele deve ser colocado na cúpula da bexiga (superior ao segmento augment). Isto irá evitar acotovelamento ou oclusão do tubo. </li><li> Usando o fio de polipropileno 6-0, colocar um ponto em bolsa na cúpula da bexiga, da seguinte maneira: lugar a reposição primeiro através da parede da bexiga longitudinalmente, lateral para o local proposto para o tubo de cistostomia. Deixar um grampo pequeno na extremidade solta de modo que a sutura não seja inadvertidamente puxado todo o caminho através. Coloque o próximo lançamento numa direcção transversal, começando primeiro entrar na parede da bexiga ligeiramente lateral para a saída do seu primeiro lance. </li><li> Não puxe o fio esticado. Coloque o seu paralelo sutura ao lado de seu primeiro (longitudinalmente) vai para a bexiga apenas cranialmente ao local de saída de sua sutura, última transversal. A reposição quarto começará lateral à saída do último ponto final e ao lado da entrada para a sua reposição muito primeiro. Feito correctamente, isto forma um quadrado circunferencial em torno do local do cateter proposto (Figura 7). </li><li> Utilizando uma agulha de 18G, perfurar a parede da bexiga, no centro da sutura em bolsa. Tenha cuidado para não furar muito profundamente (apenas o suficiente para ser intraluminal). Coloque as pontas de seus pinça fina na abertura e espalhar suavemente para alargar o buraco. </li><li> Introduza a extremidade bulbed do cateter dentro do defeito nobexiga até que seja intraluminal. Puxe a sutura em bolsa apertada ao redor do cateter e amarrá-lo para baixo. Isto deve cinch da parede da bexiga em torno do cateter, mantendo-o no lugar (Figura 8). </li><li> Pegue uma das extremidades da sutura e envolvê-la em torno do cateter e uma vez amarrar esse baixo para proteger ainda mais o cateter. </li></ol> 7. Testando o cateter e fechar a incisão abdominal <ol><li> Com uma agulha de seringa de 1 mL e 25G, inserir a agulha no tubo e, lentamente, injectar solução salina para distender a bexiga. Observe se há vazamento ao redor do cateter. Depois de ver vazando pela uretra, aspirar o soro fisiológico para descomprimir a bexiga novamente. </li><li> Feche o incisão abdominal como acima nos passos 4.1-4.4. </li></ol> 8. Fechamento da incisão dorsal e protegendo o cateter (para ratos) <ol><li> Reposicionar o animal propenso. </li><li> Cortar o tubo do cateter ao nível da pele com a tesoura. Insira um 22G contundente tip agulha no tubo. </li><li> Feche a pele sobre o tubo com poliglactina 4-0 de uma forma em execução. Deixar o cubo da agulha de extrusão a partir da pele. </li><li> Coloque uma tampa linha intravenosa na agulha sem corte. Utilizando 3-0 sutura de seda, proteger a ponta do cateter para a pele (Figura 9). </li><li> Limpar a incisão. Transfira o rato em uma gaiola, morna limpa para o despertar da anestesia. </li></ol> 8. * Fechamento da incisão dorsal e protegendo o cateter (para camundongos ou ratos) <ol><li> * Ocluir a extremidade distai do cateter por torção ou utilizando uma chama para derreter o fim. </li><li> Bobina * o fim da tubagem e deixá-lo na bolsa subcutânea no dorso do animal (não cortar tubos para o encurtar) (Figura 10). </li><li> * Feche a pele sobre o tubo com poliglactina 4-0 em uma forma de corrida (Figura 11). </li><li> * No dia da cistometria, preparar a incisão dorsal com betadine e etanol a 70%. Abrir a incisão dorsal sob anestesia e remover o tubo enrolado a partir da bolsa subcutânea. Feche o incisão. Desperte o animal de anestesia e executar cistometria quando estiver completamente acordado. </li></ol> 9. Resultados representante - Métodos Cirúrgicos A bexiga reconstituídas deve ser tão estanque a água quanto possível para evitar complicações relacionadas com um vazamento urinária significativa (Figura 3). Dor ou desconforto geralmente se manifestar como tremores ou arranhando e mordendo a incisão abdominal. Isso pode ser gerenciado com injeções diárias subcutâneas de um não-esteróides anti-inflamatórios, como meloxicam (0,5-1,0 mg / kg por via subcutânea). Tipicamente, os animais requerem apenas as injecções para os primeiros 3 dias pós-operatório. Isto pode ser suplementado com um opióide, tal como a buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg por via subcutânea a cada hr 8-12), conforme necessário. Os animais devem ser monitorizados 3 vezes por dia durante os primeiros 3 dias pós-operatório, TWgelo por dia para o pós-operatório 3-5 e, em seguida, depois diariamente para avaliar a dor, sinais de infecção, cicatrização adequada, atividade, grooming, e turgor da pele. Antibióticos (Baytril, 5mg/kg subcutânea cada hr 24 num volume não superior a 0,1 mL) são dadas para a cirurgia hr primeiro 72 a seguir, como profilaxia contra a infecção cirúrgica. Os sinais de recuperação normal são deambulação normal e os níveis de atividade, alimentação adequada e beber, ausência de dor ou desconforto (sem vocalização) e socialização normal com cagemates. Um tempo de recuperação de pelo menos 5-7 dias deve ser dada antes da análise cistométrica, para permitir a cura da bexiga e diminuição da inflamação que poderiam potencialmente afectar os resultados. Análises cistométricos 10. Análise cistométrica Awake <ol><li> Configuração descrita com MLT844 ADInstruments com captura de dados e análise com LabChart v6 (ADInstruments) e infusão com uma bomba de seringa Harvard 22 (Harvard Apparatus, Holliston, MA), embora outros sistemas comparáveis ​​estão disponíveis (Figura 12). </li><li> Calibrar o volume e pressão com base nas especificações do sistema cistométrica usado. </li><li> Colocar os animais em gaiolas metabólicas (gaiolas com um chão de rede de arame), que são suspensas sobre uma escala. A escala é ligada a um transdutor. </li><li> Purga-se o sistema de quaisquer bolhas de ar e assegurar o fluxo contínuo a partir da bomba de infusão. </li><li> Ligue o sistema de captação de dados para um computador e observar os traçados de dados. Ajuste a escala em conformidade. A pressão da bexiga e do volume de urina será continuamente registrado. </li><li> O acesso dos cateteres suprapúbicas com uma agulha de 27G ligado através de um tubo em T para o transdutor de pressão e da bomba de infusão. Iniciar a infusão de solução salina fisiológica a 12,5 mL / min para o rato e 100 uL / ​​min para o rato. </li><li> Permitir que o padrão de micção rastreio para estabilizar (aumento da bexiga pressão, seguido por um vazio). Isso normalmente leva aproximadamentemadamente 10-20 minutos. Registre os ciclos de micção para 45-120 minutos ou, pelo menos, ciclos de esvaziamento 3-4. </li><li> Observar procedimento completo em tempo real para solucionar problemas de complicações que levam ao artefato (ou seja, acotovelamento cateter, obstrução, etc, veja abaixo discussão). </li><li> Parar a infusão, desligar o cateter a partir do sistema, e devolver o animal para a sua gaiola. </li></ol> 11. Análise cistométrica Inconsciente (Nenhum cateter suprapúbica) <ol><li> Anestesiar o animal com uretano (1-2 g / kg) de injecção intraperitoneal (IP). </li><li> Expor a bexiga como acima nos passos 1.3-2.4. </li><li> Calibrar o sistema como no passo 9.2. Prepare o sistema como no passo 9,4-9,5. </li><li> Inserir uma agulha 27G ligado através de um tubo em T para o transdutor de pressão e uma bomba de infusão no aspecto lateral da bexiga. </li><li> Registre os ciclos de micção para 45-90 minutos. </li><li> Parar a infusão, remover a agulha da bexiga e euthanize do animal. &lt;/ Li&gt; </ol> 12. Resultados representativos - Análises cistométricos Traçados urodinâmicos podem ser analisados ​​para derivar parâmetros, tais como volumes anulados, conformidade, picos de pressão miccional, intervalo entre a contração, o tempo de ciclo de micção e volumes pós vazios residuais. Cystometrogram pode ser dividido em um recheio e uma fase de esvaziamento. Uma fase de enchimento normal é a porção do ciclo em que a micção bexiga enche-se com muito pouca alteração na pressão intravesical. Uma fase de esvaziamento normal do traçado consiste de um aumento constante da pressão intravesical correspondente à contracção do detrusor. A maior pressão alcançada durante a fase de esvaziamento do traçado é chamado de pressão miccional pico. A pressão miccional elevado pico poderia sugerir um padrão miccional obstrutivo, uma bexiga hipercontrátil ou uma torção no cateter SP. A conformidade pode ser calculada através da aquisição de a razão entre o volume instilado during a fase de enchimento e da mudança de pressão (respeito = AV / AP). A bexiga hypocompliant é aquele que é incapaz de acomodar adequados volumes urinários a baixas pressões. O intervalo de intercontraction pode ser calculada através da análise do tempo entre duas contracções como visto na cystometrogram. Um intervalo curto intercontraction é sugestivo de uma bexiga irritável. O tempo de ciclo de micção refere-se ao tempo que leva para um enchimento completo ea micção fase para completar e pode facilmente ser verificado por análise do traçado. Na conclusão do cistometria, pós-void residual (PVR) pode ser obtido. Isto é feito por aspiração do cateter suprapúbica após a conclusão de uma contracção do detrusor. Estes parâmetros ajudar o investigador objetiva estudar a dinâmica da bexiga como a bexiga enche e esvazia. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografia da incisão abdominale extrusão da bexiga. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig2.jpg" /> Figura 2. Incisão da bexiga com a exposição do lúmen da bexiga. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig3.jpg" /> Figura 3. Integração do implante para a parede da bexiga. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig4.jpg" /> Figura 4. Fotografia da incisão fechada. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig5.jpg" /> Figura 5. Extremidade alargada do tubo PE-50. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig6.jpg" /> Figura 6. PE-50 tubagem (cateter) através da incisão dorsal. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig7.jpg" /> Figura 7.Sutura em bolsa. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig8.jpg" /> Figura 8. Fixação do cateter para a bexiga. <img alt="A Figura 9" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig9.jpg" /> Figura 9. Hub cateter Secured. <img alt="A Figura 10" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig10.jpg" /> Figura 10. Coiled tubo na bolsa subcutânea. <img alt="A Figura 11" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig11.jpg" /> Figura 11. Fechamento incisional dorsal. <img alt="A Figura 12" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig12.jpg" /> Figura 12. Exemplo cistométrica set-up. <img alt="A Figura 13" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig13.jpg" /> Figura 13. Cistometria Representante de rastreamento.

<ol>
	<li>Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+for+bladder+substitution.">Tissue engineering for bladder substitution.</a> World. J. Urol. 18, 364-370 (2000).</li><li>Roehrborn, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+lower+urinary+tract+symptoms+(LUTS)+and+benign+prostatic+hyperplasia+(BPH).">Male lower urinary tract symptoms (LUTS) and benign prostatic hyperplasia (BPH).</a> Med. Clin. North Am. 95, 87-100 (2011).</li><li>Niknejad, K. G., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+augmentation+techniques+in+women.">Bladder augmentation techniques in women.</a> Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. 11, 156-169 (2000).</li><li>Hensle, T. W., Gilbert, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+metabolic+consequences+and+long-term+complications+of+enterocystoplasty+in+children.">A review of metabolic consequences and long-term complications of enterocystoplasty in children.</a> Curr. Urol. Rep. 8, 157-162 (2007).</li><li>Somani, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bowel+dysfunction+after+transposition+of+intestinal+segments+into+the+urinary+tract:+8-year+prospective+cohort+study.">Bowel dysfunction after transposition of intestinal segments into the urinary tract: 8-year prospective cohort study.</a> J. Urol. 177, 1793-1798 (2007).</li><li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367, 1241-1246 (2006).</li><li>Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonhuman+primate+model+for+urinary+bladder+regeneration+using+autologous+sources+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">A nonhuman primate model for urinary bladder regeneration using autologous sources of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 29, 241-250 (2011).</li><li>Chung, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+reconstitution+with+bone+marrow+derived+stem+cells+seeded+on+small+intestinal+submucosa+improves+morphological+and+molecular+composition.">Bladder reconstitution with bone marrow derived stem cells seeded on small intestinal submucosa improves morphological and molecular composition.</a> J. Urol. 174, 353-359 (2005).</li><li>Ashley, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variations+in+small+intestinal+submucosa+evoke+differences+in+inflammation+with+subsequent+impact+on+tissue+regeneration+in+the+rat+bladder+augmentation+model.">Regional variations in small intestinal submucosa evoke differences in inflammation with subsequent impact on tissue regeneration in the rat bladder augmentation model.</a> BJU Int. 105, 1462-1468 (2010).</li><li>Zhang, Y., Frimberger, D., Cheng, E. Y., Lin, H. K., Kropp, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+a+larger+bladder+replacement+with+cell-seeded+and+unseeded+small+intestinal+submucosa+grafts+in+a+subtotal+cystectomy+model.">Challenges in a larger bladder replacement with cell-seeded and unseeded small intestinal submucosa grafts in a subtotal cystectomy model.</a> BJU Int. 98, 1100-1105 (2006).</li><li>Gomez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+manipulation+of+silk+scaffold+fabrication+parameters+on+matrix+performance+in+a+murine+model+of+bladder+augmentation.">The effect of manipulation of silk scaffold fabrication parameters on matrix performance in a murine model of bladder augmentation.</a> Biomaterials. 32, 7562-7570 (2011).</li><li>Mauney, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gel+spun+silk-based+biomaterials+in+a+murine+model+of+bladder+augmentation.">Evaluation of gel spun silk-based biomaterials in a murine model of bladder augmentation.</a> Biomaterials. 32, 808-818 (2011).</li><li>Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+and+peripheral+mechanisms+contributing+to+hyperactive+voiding+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Spinal and peripheral mechanisms contributing to hyperactive voiding in spontaneously hypertensive rats.</a> Am. J. Physiol. 275, 1366-1373 (1998).</li><li>Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micturition+in+rats:+a+chronic+model+for+study+of+bladder+function+and+effect+of+anesthetics.">Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics.</a> Am. J. Physiol. 251, 1177-1185 (1986).</li><li>Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystometric+evaluation+of+bladder+function+in+non-anesthetized+mice+with+and+without+bladder+outlet+obstruction.">Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction.</a> J. Urol. 164, 1385-1389 (2000).</li><li>Soler, R., Fullhase, C., Lu, B., Bishop, C. E., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+dysfunction+in+a+new+mutant+mouse+model+with+increased+superoxide--lack+of+nitric+oxide.">Bladder dysfunction in a new mutant mouse model with increased superoxide--lack of nitric oxide.</a> J. Urol. 183, 780-785 (2010).</li><li>Matsuura, S., Downie, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+anesthetics+on+reflex+micturition+in+the+chronic+cannula-implanted+rat.">Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat.</a> Neurourol. Urodyn. 19, 87-99 (2000).</li><li>Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+urodynamic+investigation.">Rodent models for urodynamic investigation.</a> Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).</li><li>Soler, R., Fullhase, C., Santos, C., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+bladder+dysfunction+in+a+rat+model+of+dopaminergic+brain+lesion.">Development of bladder dysfunction in a rat model of dopaminergic brain lesion.</a> Neurourol Urodyn. 30, 188-193 (2011).</li><li>Streng, T., Santti, R., Andersson, K. E., Talo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+rhabdosphincter+in+female+rat+voiding.">The role of the rhabdosphincter in female rat voiding.</a> BJU Int. 94, 138-142 (2004).</li><li>Malmgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystometrical+evaluation+of+bladder+instability+in+rats+with+infravesical+outflow+obstruction.">Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction.</a> J. Urol. 137, 1291-1294 (1987).</li><li>Smith, P. P., Kuchel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+uroflow+cystometry+in+the+urethane-anesthetized+mouse.">Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse.</a> Neurourol. Urodyn. 29, 1344-1349 (2010).</li><li>Cannon, T. W., Damaser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+anesthesia+on+cystometry+and+leak+point+pressure+of+the+female+rat.">Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat.</a> Life Sci. 69, 1193-1202 (2001).</li><li>Smith, P. P., Hurtado, E., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystometric+methods+in+female+rats.">Comparison of cystometric methods in female rats.</a> Neurourol. Urodyn. 27, 324-329 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Avaliações cistométricos de configurações de biomateriais após a implantação eo aumento da bexiga em modelos animais pequenos representa um passo importante na identificação de validação óptimas características estruturais e mecânicas dos desenhos matriz para uso em situações clínicas. Neste estudo, descrevemos os métodos cirúrgicos para a realização de ampliação vesical em camundongos e ratos, bem como técnicas para determinar as propriedades cistometria urodinâmicos dos órgãos de engenharia para avaliação funcional. Utilizamos estas técnicas em várias experiências que envolvem ambos os camundongos e ratos, com cada experimento consistia de 30 roedores + sem problemas significativos. Nosso laboratório de pesquisa é um conglomerado diversificado de cientistas básicos e cirurgiões médicos e cirurgiões com pelo menos 5-6 anos de formação pós-graduada cirúrgico realizado os aspectos processuais desses experimentos. Independentemente do tipo de biomaterial utilizado, o di principalferença entre aumentando a bexiga em ratos, versus ratinhos é o tamanho da bexiga. Devido ao tamanho mais pequeno da bexiga, a dissecção ea incorporação do biomaterial é tecnicamente mais difícil no rato. Para ajudar na visualização, um microscópio cirúrgico pode ser usado. Uma vez que o tamanho da bexiga em ratos é maior, é mais susceptível a situações em que mais do que um processo tem de ser realizada sobre a bexiga (por exemplo, aumento e colocação do cateter cistostomia). Além disso, o protocolo acima descreve a utilização de tubagem PE-50 para o rato 13, no entanto, cateteres tamanho ainda maiores, até PE-100 foram utilizados, especialmente para estudos de longo prazo 14. Em ratinhos, uma menor calibre, tais como PE-10 tubagem pode ser utilizado 15,16, mas deve ser mantido em mente que os tubos flexíveis menor, mais não pode transmitir mudanças de pressão para o transdutor com precisão. Além disso, o método alternativo de fixação do cateter no dorso (passo 8 acima *) é feito em mice devido ao seu menor tamanho corporal ea agulha ponta romba e cap IV são demasiado pesado. A desvantagem disto é a necessidade de anestesia para extrair o final do cateter na bolsa subcutânea antes da cistometria. Estudos têm demonstrado que nos dias iniciais primeiros (0-4 dias) após a colocação dos cateteres, cistometria revelou pressões elevadas da bexiga e hiperatividade com volumes urinários baixos. Essas descobertas parecem se estabilizar em torno do sexto ao sétimo dia 14,17 e, portanto, é provavelmente o momento ideal para a avaliação cistométrica. No entanto, a maioria dos relatos na literatura executar cistometria nos primeiros 3 dias de cateterismo 18 anos, e isso explica a grande variação nos parâmetros acima em relação ao tempo. Deixando o cateter suprapúbica para uma duração superior a 3 dias traz consigo morbidades, tais como risco de pedras, deslocamento, infecção, hematúria e oclusão do cateter com detritos. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; diferentes velocidades de infusão durante cistometria têm sido descritas a partir de 1-3mL/hr para ratos 15,16 e 10-11mL/hr para ratos 13,19,20. As taxas de infusão suprafisiológicas podem causar pressões falsamente elevados 14. Usamos uma taxa de infusão de 12,5 uL / ​​min (0,75 mL / hr) para ratinhos e 100 uL / ​​min (6 mL / hr) para ratos em nossa configuração, mas taxas mais baixas podem também ser utilizados. A temperatura da solução salina fisiológica deve ser pelo menos a temperatura ambiente, embora salina (37 °) quente é mais optimizada a fim de evitar excesso de actividade da bexiga provocado com instilar solução fria. Em cistometria acordado, é crucial para permitir a estabilização do padrão anular que o animal se torna ajustado para a gaiola, que, na nossa experiência requer um período de ~ 10-20 minutos. Depois disso, ciclos regulares de micção pode ser gravada por 45-120 minutos ou no mínimo ciclos de esvaziamento 3-4. O animal deve ser observado em tempo real, uma vez que o animal é livremente moving, e complicações tais como a torção ou dobras do cateter pode alterar análise cistométrica. Limitando o ruído ambiental durante cistometria se deseja diminuir o movimento de animais e artefatos subseqüentes. Cistometria inconsciente não tem os problemas concomitantes como cistometria acordado, mas anestésicos múltiplos têm sido mostrados para inibir as contracções da bexiga espontâneas. Esta inibição corresponde diretamente à duração esperada da ação dos anestésicos, ou seja, quando os subsídios efeito anestésico, contrações espontâneas retomar 14. Além disso, as pressões medidos quando a bexiga transbordou, foram estatisticamente maior em ratos anestesiados, tanto vivo e post-mortem, indicando um efeito sobre as propriedades de conformidade passivas da parede da bexiga. Este efeito é visto com 21 pentobarbital, cetamina, e cloralose IM / IP, para além de halotano e inalado nesacaine intratecal 14. Um estudo mais extensa de vários anestésicos confirmaçãom este achado com a supressão do reflexo da micção para anestésicos tanto inalatória (isoflurano e metoxiflurano) e barbitúricos (pentobarbital e thiobutabarbital) sob níveis moderados de anestesia 17. Este efeito foi observado com os níveis de luz ou mesmo sedativo da anestesia com medicamentos como o fentanil-droperidol e diazepam-cetamina, e como no estudo anterior, como o efeito de anestesia diminuiu, assim como a inibição 17. Para este procedimento, as injecções intraperitoneais de uretano pode ser utilizado uma vez que foi demonstrado que a micção reflexo é preservada enquanto também permite que para anestesia adequada 17,22. Além disso, nenhum efeito é observado em relação às pressões de micção 23. Colocação do cateter suprapúbica para cistometria é descrito aqui, pois o cateterismo intra-uretral tem sido demonstrado que têm curvas mais elevados de pressão na bexiga e menores taxas de fluxo consistente com obstrução relativa da saída da bexiga 24.Além disso, o cateterismo intra-uretral só é possível em animais anestesiados e, mesmo assim, o cateterismo pode ser difícil, especialmente em roedores machos e ratos. Em conclusão, a escolha de qual o modelo a utilizar para o aumento da bexiga e / ou análise cistométrica é dependente dos objectivos do estudo específico. Do ponto de vista técnico, o modelo de rato claramente tem a vantagem de as razões discutidas acima. No entanto, o modelo de rato pode ser usado em estudos sobre os papéis dos produtos específicos de genes codificados finais em doenças do tracto urinário, devido à sua susceptibilidade para a manipulação genética. Isto não é geralmente possível no rato. Cistometria acordado com mais precisão imita o estado fisiológico normal em que estes animais submetidos a ciclos de seus da micção, e assim, é susceptível de dar uma determinação mais fiável fisiológica de função da bexiga. Além disso, a variável de confusão de efeitos diretos de umanesthetics sobre a função da bexiga é evitado.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiais: </td><td> Descrição / Utilização: </td></tr><tr><td> Tesouras de barbear </td><td> Preparação do rato / mouse para a cirurgia </td></tr><tr><td> Cortinas estéreis, Betadine, etanol 70%, gaze estéril </td><td> Preparação do campo cirúrgico estéril </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Instrumentos: </td></tr><tr><td> Lâmina de bisturi </td><td> Incisão na pele </td></tr><tr><td> forceps com dentes </td><td> Manipulando pele </td></tr><tr><td> Pinça fina </td><td> Atraumático (sem dentes), sem serrilhados ou com serrilhas finas para manipular </td></tr><tr><td> Motorista pequena agulha </td><td> Dissecção aguda do tecido </td></tr><tr><td> Metzenbaum tesoura </td><td> Incisão Bldder </td></tr><tr><td> Tenotomia tesoura </td><td> Para suturas de retracção e de desenvolver subcutânea tunnel (cateter de cistostomia) </td></tr><tr><td> Pequenas pinças curvas </td><td> Subcutânea túnel (cateter de cistostomia) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Suturas: </td></tr><tr><td> 6-0 de polipropileno </td><td> Bexiga e suturas de ancoragem de sutura em bolsa </td></tr><tr><td> 7-0 sutura poliglactina </td><td> Anastomose de andaime para bexiga </td></tr><tr><td> Sutura de poliglactina 4-0 </td><td> Encerramento do músculo / pele </td></tr><tr><td> 3-0 ou sutura de seda 4-0 </td><td> Ponta do cateter Protegendo a pele </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Agulhas e seringas: </td></tr><tr><td> Agulha de calibre 18 </td><td> Perfurar a bexiga por cateter de cistostomia </td></tr><tr><td> 25 e 30 agulhas de calibre </td><td> Teste de vazamento da bexiga </td></tr><tr><td> 1 mL f salinaseringa illed </td><td></td></tr><tr><td> 22 gauge agulha ponta romba </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Cateter de cistostomia: </td></tr><tr><td> PE-50 tubagem </td><td></td></tr><tr><td> Isqueiro </td><td> Queima PE-50 tubos </td></tr><tr><td> Pinça curva Pequeno </td><td> Desenvolvimento de túnel subcutâneo </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Cistometria: </td></tr><tr><td> MLT844 ADInstruments captura de dados e software LabChart </td><td> Aquisição de dados de pressão </td></tr><tr><td> Harvard bomba de seringa 22 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) </td><td> Bomba de infusão de líquidos </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Anestésicos (cistometria Inconsciente): </td></tr><tr><td> Eusoflurane </td><td> Indução / manutenção da anestesia geral </td></tr><tr><td> Uretano </td><td> Cistometria Unconconscious </td></tr><tr><td> Bupivicaine ou equivalente </td><td> A anestesia local </td></tr><tr><td> Meloxicam </td><td> Analgesia pós-operatória </td></tr><tr><td> Buprenorfina </td><td> Analgesia pós-operatória </td></tr></tbody></table>

evaluation of biomaterials for bladder augmentation using cystometric analyses in various rodent models

A função renal e continência de urina são extremamente dependente do bom funcionamento da bexiga, que armazena a urina à baixa pressão e expulsa-lo com uma precisão orquestrada contração. Um certo número de anomalias congênitas e adquiridas urológicas, incluindo válvula de uretra posterior, hiperplasia benigna da próstata e bexiga neurogênica secundárias a espinha bífida / lesão da medula espinhal pode resultar em remodelação do tecido patológico levando ao cumprimento deficiente e reduzida capacidade 1. Obstrução funcional ou anatômica do trato urinário é freqüentemente associada a estas condições, e pode levar à incontinência urinária e danos nos rins de armazenamento aumentou e pressões de esvaziamento 2. O implante cirúrgico de segmentos gastrointestinais para expandir a capacidade de órgãos e reduzir as pressões intravesicais representa a opção de tratamento cirúrgico primário para esses transtornos, quando o tratamento médico falha 3. No entanto, esta abordagem é dificultared pela limitação do tecido doador disponível, e está associada a complicações significativas, incluindo a infecção crônica do trato urinário, perturbação metabólica, formação de cálculos urinários, e malignidade secundária 4,5. A pesquisa atual na engenharia de tecidos da bexiga é fortemente focada em identificar configurações de biomateriais que pode apoiar a regeneração de tecidos em locais de defeitos. Convencional 3-D scaffolds derivado a partir de polímeros naturais e sintéticos, tais como submucosa do intestino delgado e glicólico-ácido poli têm mostrado algum sucesso a curto prazo no apoio regeneração muscular urotelial e suave, bem como para facilitar a capacidade de armazenamento aumentada de órgãos em modelos animais e no clínica 6,7. No entanto, as deficiências em andaime integridade mecânica e biocompatibilidade muitas vezes resultar na fibrose deletério 8, 9 contratura enxerto, e calcificação 10, aumentando assim o risco de falha do implante e precisam de for secundárias procedimentos cirúrgicos. Além disso, a restauração das características urinários normais, utilizando construções padrão de biomateriais para cistoplastia aumento ainda tem de ser alcançado, e, portanto, a investigação e desenvolvimento de matrizes novos que podem cumprir esta função é necessário. A fim de desenvolver com sucesso e avaliar biomateriais óptimas para o aumento da bexiga clínica, a investigação eficácia deve primeiro ser realizada em modelos animais padronizados usando detalhados métodos cirúrgicos e avaliações resultado funcional. Nós previamente relatada a utilização de um modelo de aumento da bexiga em ratos para determinar o potencial de seda fibroína baseados andaimes para mediar a regeneração do tecido e as características de esvaziamento funcionais. 11,12 análises cistométricos deste modelo têm mostrado que variações nas propriedades estruturais e mecânicas de implantes pode influenciar as características resultantes urodinâmicos das bexigas da engenharia de tecidos 11,12. Correlação positivações entre o grau de matriz mediada regeneração do tecido determinada histologicamente e conformidade funcional e capacidade avaliada por cistometria foram demonstrado neste modelo 11,12. Estes resultados sugerem, portanto, que as avaliações funcionais de configurações de biomateriais em sistemas de roedores ampliação vesical pode ser um formato útil para avaliar as propriedades de andaime e que estabelece, em viabilidade vivo antes de estudos com animais de grande porte e implantação de clínica. No presente estudo, vamos apresentar várias etapas cirúrgicas de ampliação vesical em ambos os ratos e camundongos utilizando andaimes de seda e demonstrar técnicas para cistometria acordados e anestesiados.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models at JoVE.com

Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Estádios cirúrgicos de aumento da bexiga são descritos utilizando 3-D andaimes em modelos murinos e de rato. Para testar a eficácia de configurações de biomateriais para utilização no aumento da bexiga, as técnicas para cistometria tanto acordado e anestesiados são apresentados.

Avaliação de Biomateriais para ampliação vesical utilizando análises cistométricos Em modelos de roedores Vários

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

evaluation-biomaterials-for-bladder-augmentation-using-cystometric

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.1K visualizações.  Harvard Medical School. Estádios cirúrgicos de aumento da bexiga são descritos utilizando 3-D andaimes em modelos murinos e de rato. Para testar a eficácia de configurações de biomateriais para utilização no aumento da bexiga, as técnicas para cistometria tanto acordado e anestesiados são apresentados.

Vídeo: Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabricação de Micro-tecidos utilizando Módulos de Colágeno Gel células contendo

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Bioengenharia

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microambientes sanduíche-como aproveitarar Telemóveis / interações materiais

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Síntese de nanotubos de carbono de paredes Multi modificados com nanopartículas de prata e avaliação das suas actividades antibacterianas e propriedades citotóxicas

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Avaliação de comportamentos fotossintéticos por medições simultâneas de reflectância foliar e análises de fluorescência de clorofila

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows assessment of bone substitution materials for oral and craniofacial bone regeneration in terms of bone growth and neovascularization support. Once animals are anesthetized and ventilated (endotracheal intubation), four cylinders made of polyether ether ketone (PEEK) are screwed onto the skull, on both sides of the median and coronal sutures. Five intramedullary holes are drilled within the bone area delimited by each cylinder, allowing influx of bone marrow cells. The material samples are placed into the cylinders which are then closed. Finally, the surgical site is sutured, and animals are awaken. Bone growth may be assessed on live animals by using microtomography. Once animals are euthanized, bone growth and neovascularization may be evaluated by using microtomography, immune-histology and immunofluorescence. As the evaluation of a material requires maximum standardization and calibration, the calvarial model appears ideal. Access is very easy, calibration and standardization are facilitated by the use of defined cylinders and four samples may be assessed simultaneously. Furthermore, live tomography may be used and ultimately a large decrease in animals to be euthanized may be anticipated.

Here we present a surgical protocol in rabbits with the aim to assess bone substitution materials in terms of bone regeneration capacities. By using PEEK cylinders fixed onto rabbit skulls, osteoconduction, osteoinduction, osteogenesis and vasculogenesis induced by the materials may be evaluated either on live or euthanized animals.

Modelo calvarial de aumento ósseo em coelho para avaliação do crescimento ósseo e neovascularização em materiais de substituição óssea

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Esclarecimento Primário do Fluido de Cultura Celular Colhida cho usando um separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...