Este trabalho foi financiado pelo NIH Neuroscience Blueprint Núcleo de subvenção (P30 NS057105, BJS) para Washington University, programa, projeto Grant NS032636 (BJS) e pelo Centro de esperança para distúrbios neurológicos.

1. Embalagem de lentivirais Lentivirais são produzidos por co-transfecção de um vector de transferência lentiviral e outros plasmídeos necessários para a embalagem em células 293T pelo cálcio método de transfecção de fosfato. Usamos 10 100-mm pratos de cultura de tecidos neste protocolo. Ele pode ser escalado para cima ou para baixo dependendo de aplicações. A linha de células 293T é mantida em Dulbecco modificado por Eagles (DMEM) com glucose elevada (4500 mg / L), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades / penicilina ml, estreptomicina 100 ug / ml em 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. <ol><li> Semente 293T células em confluência de 30-40% a 10 100-mm pratos de cultura de tecidos (3 x 10 6 células / prato) em meio de cultura. Retornar as células a incubadora. </li><li> Após 20-24 h de cultura, verificar a densidade celular. As células devem ser de cerca de 80% de confluência no momento da transfecção. </li><li> Preparar um tubo de 50 ml. Adicionar 4,4 ml TE79/10 (1 mM TrisHCl, 0,1 mMEDTA, pH 7,9) menos o volume total do DNA de plasmídeo seguinte. Adicionar 100 ug de transferência lentiviral plasmídeo (Figura 1), 58 ug pMDLg / pRRE, ug de pCMV-G 31, 25 ug pRSV-Rev, 600 uL 2M de CaCl2. Misture delicadamente. </li><li> Preparar um outro tubo de 50 ml. Adicionar 5 ml 2x HBS (HEPES 0,05 M, 0,28 M de NaCl, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, pH 7,12). </li><li> Tomar a DNA-CaCl 2 por mistura de 10 ml pipeta e adicionar ao tubo contendo 2 x HBS, gota a gota, enquanto o tubo de vórtice. </li><li> Mantenha a reacção de precipitação à temperatura ambiente (RT) durante 30 min. </li><li> Remover os pratos de cultura de incubadora. Misturar a reacção de precipitação bem em vórtice. Adicionar 1 ml de suspensão de células a cada 100-mm prato contendo. A suspensão deve ser adicionado lentamente, gota a gota enquanto suavemente agitando o meio no prato. Retornar estes pratos para a incubadora e deixar durante 5 h. </li><li> Remover o meio a partir da cultura. Adicionar 6 ml meio de cultura fresco, contendo 6 mM de sódio butyrate para cada prato. Retornar as culturas de incubadora. Após cultura durante a noite, se houver um repórter fluorescente no construto, verificar a expressão do gene repórter sob microscópio de fluorescência. Geralmente, mais de 80% das células expressam o gene repórter, se for conduzido por um promotor ubíqua (por exemplo, promotor de CMV). </li><li> Dois dias (40-44 h) após a transfecção, recolher o sobrenadante a partir de 10 pratos em 2 50 ml tubos (cerca de 30 ml cada tubo). Congelar o sobrenadante em -80 ° C congelador ou ir para a próxima etapa. </li></ol> 2. Concentração e purificação dos Vectores <ol><li> Centrifugar a recentemente colhido ou descongelado sobrenadante a 900 g (cerca de 2000 rpm) durante 10 min para remover todos os detritos de células no sobrenadante. </li><li> Anexar uma seringa de 60 ml de uma 0,2-uM filtro de seringa SFCA. Transferir o sobrenadante a partir de 50-ml tubo para a seringa. Filtrar o sobrenadante para um tubo de centrífuga de polialómero. </li><li> Tome 5 ml de sacarose a 20% (preparada em PBS) para cima em uma pipeta de 5 ml. Inserira pipeta para o fundo do tubo de centrífuga contendo sobrenadante. Lentamente, adicionar a solução de sacarose sob o sobrenadante vetor. Repita essas etapas para o sobrenadante de outro tubo. </li><li> Centrifugar o sobrenadante a 11.000 rpm e 4 ° C durante 4 h com rotor Beckman SW28 balanço. </li><li> Remover o sobrenadante. Adicionar 150 uL Lactose 4% (preparado em PBS) a cada tubo de centrífuga. Ressuspender as peletes. </li><li> Transferir o vector concentrado a partir de todos os tubos de centrifugação para um tubo de 1,5 ml. Deixar o tubo em gelo durante 15 min. </li><li> Misture a suspensão vetor por pipetagem. Girar com microcentrífuga a toda a velocidade (cerca de 16.000 g) durante 1 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml nova. Divida a amostra final em alíquotas de 20 ul e guardou no congelador -80 ° C. </li></ol> 3. Titulação dos Vectores <ol><li> Semente 5 x 10 4 / poço de células HT1080 em 12 poços da placa em meio DMEM 1 ml suplementado com FBS 10%. </li><li> Depois overnight cultura, contagem de células de um bem e marcar o número de células. </li><li> Fazer 5-vezes diluição em série (1:5, 1: 25; 1:125; e 1:625) do vector concentrada com meio de cultura. Adicionar I uL de cada vector diluído aos poços separados. As amostras podem ser repetido para aumentar a precisão. </li><li> Adicionar 1 ml de 4 mg / ml de polibrene (Hexadimetrina Brometo) em cada poço contendo vector e para dentro de um poço sem vector. Misturar agitando a placa. Retornar à incubadora durante 48 h. </li><li> Remover meio dos poços de cultura de células. Lavar cada poço com PBS. Adicionar 250 uL 1x solução tripsina-EDTA para as células. Quando as células são separadas (3-5 min), adicionar 1 ml meio de cultura. Ressuspender as células por pipetagem. Transferir suspensão de células a 1,5 ml de tubos de centrifugação. </li><li> Centrifugar a 900 g durante 6 min. Para vetores com um gene repórter fluorescente (GFP, por exemplo), vá para o passo 3.7 para análise FACS. Para vetores sem um repórter, vá para o passo 3,8 para qPCR em tempo real. </li><li> Para vectores contendo um fluogene repórter fluorescentes, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 300 uL de formaldeído de 3,7% em PBS. Determinar a percentagem das células positivas repórter por análise de FACS. O título será representado como unidades de transdução por mililitro concentrada vector (TU / ml). </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> Por exemplo, se 1 x 10 5 células foi transduzida com 1/25 uL (0,04 uL) vector e células de 30% são repórter positivo, a título será: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> Apenas utilizar as diluições cair em uma relação linear entre a percentagem de células positivas ea quantidade de vector adicionado para calcular título. O título final deve ser uma média de os títulos obtidos a partir de transduções de pelo menos 2 diferentes quantidades do vector. <ol start="8"><li> Para vectores semgene repórter fluorescente, extrair o ADN genómico de células HT1080, utilizando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Amplificar sequência do vector no DNA genómico usando ABI Prism 7000 Sistema de Detecção de Sequência (Applied Biosystems) com primers (em HIV-1 região PBS / psi 17) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;e 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;, e TaqMan sonda 5 &#39;-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3&#39;. Gene de albumina que é um gene de cópia única no genoma (2 cópias / célula) foi também amplificado com os iniciadores 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &#39;e 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&#39;, e sonda 5&#39;-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 &quot;como um controle interno. Determinar os números de cópias do vector e de albumina por PCR em placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabrico com o seguinte programa: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, e 35 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 2 min. Dez diluições em série de plasmídeos de concentração conhecida (representado como cópianúmero) contendo as sequências do molde deve também ser amplificado para criar uma curva padrão para quantificação de amostras desconhecidas. O título será representado como unidades de integração por mililitro concentrada vector (UI / ml). </li></ol><img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. Transdução de Culturas neocortical Culturas neocorticais contendo ambos os neurónios e glia são preparados a partir de córtices rato usando um processo de revestimento de dois passos, como descrito anteriormente 18. Neocórtices obtidos a partir de ratos fetais em 14-16 dias de gestação são plaqueadas sobre uma monocamada previamente estabelecido glial em MEM suplementado com 10% de FBS, 20 mM de glucose e 2 mM de glutamina em 24 poços da placa de cultura de tecidos. <ol><li> Após 5 dias in vitro, adicionam-se 10 uM de citosina arabinósido (Ara-C) no neoccultura ortical para inibir não neuronais a divisão celular. Continuar a cultura das células durante 2 dias. </li><li> Meio de cultura quente em 37 ° C banho de água durante 5-10 min. Substituir Ara-C contendo o meio com meio de cultura fresco (500 ul / poço). </li><li> Adicionar vector com desejado MOI (multiplicidade de infecção; a razão entre o número de partículas de vector com o número de células alvo) à cultura. Continuar a cultura durante 24 h. Usamos MOI de 1-10 (geralmente 5) em culturas primárias corticais. </li><li> Substituir o meio de cultura com meio fresco. Continuar a cultura. Se houver um gene repórter na construção vector, vá células sob microscópio fluorescente 2 dias após a transdução. A expressão do gene repórter será visível em neurónios 2-7 após a transdução, dependendo do desenho vector e da dose utilizada. </li></ol> 5. Os resultados representativos Os títulos de lentivirais produzidos com esta gama de protocolo 10 8 -10 10 UI / ml, which são adequados para a transdução de uma variedade de tipos de células a partir de CNS tanto in vitro como in vivo. Tabela 1 ea Figura 2 mostram um resultado representativa, utilizando os vectores produzidos por este protocolo. Nós transduzidas murinos culturas neocorticais com lentivirais expressando a proteína verde fluorescente (GFP), controlada pela sinapsina promotor (SYN) ou proteína glial fibrilar ácida promotor (GFAP). Sete dias após a transdução, foi realizada a imunocoloração para neurónios do rótulo e astrócitos com anticorpos anti-NeuN e anti-GFAP, respectivamente. Como mostrado na tabela 1 e fig. 2A, após a transdução com o vector portador do promotor de sinapsina, mais de 90% dos neurónios (NeuN + células) expressa GFP e nenhum astrócitos (GFAP + células) expressar o gene repórter. Quando promotor GFAP é usado na construção vector (Fig. 2B), cerca de 80% de astrócitos (GFAP + células) express GFP; todos GFP + de células são astrócitos como confirmado por colocalização com GFAP e à ausência de expressão da GFP em células NeuN-rotulados. Estes resultados demonstram que lentivirais são muito eficientes para entregar transgenes para as células de CNS e célula-específica expressão do gene pode ser alcançada quando promotores apropriados são utilizados. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática do HIV baseados lentivirais e os plasmídeos de empacotamento. O HIV-1 provírus é mostrado na parte superior. Os elementos para a produção de vector são separados em quatro diferentes plasmídeos. A transferência lentiviral plasmídeo contém um LTR 5 &#39;híbrido no qual a região U3 é substituído com o citomegalovírus (CMV) promotor, o sinal de empacotamento (ψ), a sequência RRE, o tracto polypurine central (CPPT), um gene de interesse (por exemplo um repórter fluorescente), juntamente com um promotor de escolha, ea LTR 3 &#39;na qual osequências reguladoras cis são completamente removidos a partir da região U3. pMDLg / pRRE contém as proteínas gag e pol e genes sequência RRE de HIV-1 sob o controlo do promotor de CMV. pRSV-Rev contém a sequência de codificação de Rev conduzida pelo promotor RSV. pCMV-G contém o gene da proteína VSV-G sob o controlo do promotor de CMV. PA indica o sinal de poliadenilação do gene β-globina humana. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> Figura 2. Expressão de genes repórter em cultura mista rato neocortical transduzidas com vectores que transportam lentivirais de células específicas do tipo promotores. As culturas foram transduzidas com LV-SYN-GFP (A) ou LV-GFAP-GFP vectores (B) com uma MOI de 5. Sete dias após a transdução, as células foram imunocoradas com um anticorpo anti-NeuN ou anti-GFAP. Os painéis superiores mostram fluorescência da GFP, os painéis mostram média de imunocoloração e painéis inferiores são mescladas imagens (GFP: verde; NeuN ou GFAP: vermelho). </p&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Vetor </td><td> GFP + de células em neurónios </td><td> GFP + em astrócitos </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92,2 ± 7,3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78,3 ± 11,5 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Comparação de expressão da GFP em murinos culturas neocorticais transduzidas com vectores que transportam lentivirais diferentes promotores de um. um culturas murinos neocorticais (5 x 10 5 / poço em placas de 24 poços) foram transduzidas com LV-SYN-GFP ou LV-GFAP-GFP a uma MOI de 5. Sete dias após a transdução, as culturas foram fixadas e imunocoradas para NeuN ou GFAP. O número de GFP e NeuN / GFAP células que expressam foram contados em imagens a partir de 10 campos por condição experimental. Os valores representam a percentagem de neurónios (NeuN + células) ouastrócitos (GFAP + células) que também expressaram o gene repórter da GFP. Os valores apresentados são médias ± DP de três experimentos independentes.

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-Protein+Signaling-10+Negatively+Regulates+NF-{kappa}B+in+Microglia+and+Neuroprotects+Dopaminergic+Neurons+in+Hemiparkinsonian+Rats.">Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats.</a> J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).</li><li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoters+and+serotypes:+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo.">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo, nós mostramos a produção de lentivirais e aplicação destes vectores em culturas neocorticais. Nós demonstramos eficiente e de células de transdução de tipo específico com os vectores produzidos por estes métodos. Quando o promotor sinapsina é usado, a expressão da GFP é estritamente neurónio específico. Quando o promotor GFAP é usado, expressão da GFP é exclusivamente em astrócitos. Se nenhuma célula expressão de tipo específico é requerido, um promotor ubíqua pode ser usado. En...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CM </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> Butirato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimetrina brometo de (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> As células 293T </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> Células HT1080 </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> Falcon 100 x 20 mm tecido culturprato e </td><td> BD Biosciences </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 1 x 3 ½ em polyallomoer tubo de centrífuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 326823 </td></tr><tr><td> 0,2 mícron filtro de seringa </td><td> Corning </td><td> 431219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 51304 </td></tr></tbody></table>

production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system

De entrega de genes eficiente no sistema nervoso central (SNC) é importante no estudo funções de genes, modelando doenças neurológicas e desenvolvimento de abordagens terapêuticas. Lentivirais são ferramentas atraentes na transdução de neurónios e outros tipos de células no SNC como eles transdução ambas as células em divisão e não-dividindo, a expressão de transgenes apoio sustentado, e têm uma capacidade relativamente grande de embalagem e baixa toxicidade 1-3. Lentivirais têm sido usados ​​com sucesso na transdução muitos tipos de células neurais in vitro e em animais 4-6 7-10. Grandes esforços têm sido feitos para desenvolver lentivirais com segurança biológica melhorada e eficiência para entrega de genes. As correntes de terceira geração replicação defeituosa e auto-inativadora (SIN) lentivirais estão representados na Figura 1. Os elementos necessários para embalagem vetor são divididos em quatro plasmídeos. No trans lentiviralfer plasmídeo, a região U3 na repetição do 5 &#39;terminal longa (LTR) é substituído com um promotor forte de outro vírus. Esta modificação permite a transcrição da sequência de vector independente do HIV-1 da proteína Tat que é normalmente necessária para a expressão do gene HIV 11. O sinal de empacotamento (Ψ) é essencial para a encapsidação e do elemento de Rev-responsivo (RRE) é necessária para a produção de vectores de título elevado. A central polypurine trato (CPPT) é importante para a importação nuclear do ADN do vector, uma característica necessária para transduzir células não-divisórias 12. No LTR 3 &#39;, as sequências de cis-reguladoras são completamente removidos a partir da região U3. Esta supressão é copiado para LTR 5 &#39;após a transcrição reversa, resultando em inactivação transcricional de ambos os LTRs. PMDLg plasmídeo / pRRE contém HIV-1 gag / pol genes, que fornecem as proteínas estruturais e transcriptase reversa. pRSV-Rev codifica rev, que se liga ao RRE para exportação de ARN eficiente a partir do núcleo. pCMV-G codificaa glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), que substitui o HIV-1 env. VSV-G expande o tropismo dos vectores e permite a concentração por meio de ultracentrifugação 13. Todos os genes que codificam as proteínas acessórias, incluindo vif, vpr, Vpu, e Nef são excluídos no sistema de embalagem. A produção e manipulação de lentivirais deve ser realizada de acordo com as orientações do NIH para pesquisa envolvendo DNA recombinante ( <a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a> ). Uma aprovação do Comitê de Segurança Institucional indivíduo Biológica e Química pode ser necessária antes de usar lentivirais. Lentivirais são geralmente produzidas por co-transfecção de células 293T com transferência lentiviral plasmídeo e os plasmídeos auxiliares que codificam as proteínas necessárias para a embalagem vector. Muitos plasmídeos de transferência lentivirais e plasmídeos auxiliares pode ser obtido a partir de Addgene, um nãoFins lucrativos repositório plasmídeo ( <a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Algumas linhas celulares estáveis ​​de embalagem têm sido desenvolvidos, mas esses sistemas proporcionam menos flexibilidade e sua eficiência de embalagem geralmente decresce ao longo do tempo 14, 15. Os kits de transfecção comercialmente disponíveis podem suportar uma elevada eficiência de transfecção 16, mas podem ser muito caro para preparações de vector de grande escala. Métodos de cálcio precipitação de fosfato de fornecer transfecção altamente eficiente de células 293T e, assim, proporcionar uma abordagem confiável e de custo eficaz para a produção de vetor lentiviral. Neste protocolo, que produzem lentivirais por cotransfecção de células 293T com quatro plasmídeos baseados no princípio precipitação com fosfato de cálcio, seguido de purificação e concentração com ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose a 20%. Os títulos de vector são determinados por fluorescência-activated separação de células (FACS) analYsis ou por qPCR tempo real. A produção e titulação de lentivirais neste protocolo pode ser terminado com 9 dias. Nós fornecemos um exemplo de transdução esses vetores em murinos culturas neocorticais que contenham ambos os astrócitos e neurônios. Nós demonstramos que lentivirais suporte de elevada eficiência de transdução e expressão génica em células de tipo específico de células primárias de cultura a partir de CNS.

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Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de células<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt;.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

production-lentiviral-vectors-for-transducing-cells-from-central

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.8K visualizações.  Washington University School of Medicine. Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de células In vitro E In vivo.

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Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Neurociência

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...