Diese Arbeit wurde von den NIH Neuroscience Blueprint Core-Zuschuss (P30 NS057105, BJS) nach Washington University, Program Project Grant NS032636 (BJS) und von der Hoffnung, Zentrum für Neurologische Störungen unterstützt.

1. Die Verpackung der lentiviralen Vektoren Lentivirale Vektoren sind durch Co-Transfektion eines lentiviralen Transfervektor und andere Plasmide für die Verpackung in 293T-Zellen durch Calciumphosphat-Transfektion Verfahren erforderlich hergestellt. Wir verwenden 10 100-mm Zellkulturschalen in diesem Protokoll. Es kann skaliert oder unten, je nach Anwendungen. Die 293T-Zelllinie wird in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt (4500 mg / L) gehalten wird, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. <ol><li> Seed 293T-Zellen bei 30-40% Konfluenz bis 10 100-mm-Gewebekulturschalen (3 × 10 6 Zellen / Schale) in Kulturmedium. Senden Sie die Zellen, um Inkubator. </li><li> Nach 20-24 h Kultur, überprüfen Sie die Zelldichte. Die Zellen sollten etwa 80% Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion werden. </li><li> Bereiten Sie eine 50-ml-Tube. In 4,4 ml TE79/10 (1 mM Tris-HCl, 0,1 mMEDTA, pH 7,9) abzüglich der Gesamtmenge der folgenden Plasmid-DNA. In 100 ug lentiviralen Transfer-Plasmid (Abbildung 1), 58 pg pMDLg / pRRE, 31 pg pCMV-G, 25 ug pRSV-Rev, 600 ul 2M CaCl 2. Vorsichtig mischen. </li><li> Bereiten Sie einen anderen 50-ml-Tube. 5 ml 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 7,12). </li><li> Nehmen Sie die DNA-CaCl 2-Gemisch von 10-ml-Pipette und fügen Sie das Röhrchen mit 2 x HBS, tropfenweise unter Vortexen die Röhre. </li><li> Halten der Fällungsreaktion bei Raumtemperatur (RT) für 30 min. </li><li> Entfernen Sie die Kulturschalen aus Inkubator. Mischen Sie die Fällungsreaktion, durch Vortexen mischen. 1 ml Suspension in jeden 100-mm-Schale enthaltenden Zellen. Die Suspension muss langsam zugegeben, tropfenweise unter leichtem Schwenken des Mediums in der Schale werden. Kehren diese Gerichte in den Inkubator verlassen und für 5 Stunden. </li><li> Entfernen des Mediums aus der Kultur. 6 ml frisches Kulturmedium mit 6 mM Natrium-butyrate zu jedem Gericht. Zurück zu den Kulturen-Inkubator. Nach Übernacht-Kultur, wenn eine fluoreszierende Reporter in dem Konstrukt, überprüfen die Expression des Reportergens unter Fluoreszenzmikroskop. Normalerweise exprimieren über 80% der Zellen das Reportergen, wenn sie von einer allgegenwärtigen Promotor (zB CMV-Promotor) angetrieben wird. </li><li> Zwei Tage (40-44 h) nach der Transfektion Überstand zu sammeln von 10 Geschirr in 2 50-ml-Röhrchen (etwa 30 ml Röhrchen). Frieren Sie den Überstand in -80 ° C Gefrierschrank oder gehen Sie zum nächsten Schritt. </li></ol> 2. Konzentration und Reinigung der Vektoren <ol><li> Zentrifuge die frisch gesammelten oder aufgetaut Überstand bei 900 g (etwa 2000 UpM) für 10 min auf eine beliebige Zelle Trümmern in dem Überstand zu entfernen. </li><li> Bringen Sie einen 60-ml-Spritze auf eine 0,2-Spritze um SFCA Filter. Überstand von 50-ml-Tube mit der Spritze. Den Überstand in ein Zentrifugenröhrchen Polyallomer. </li><li> Nimm 5 ml 20% Saccharose (hergestellt in PBS) in einer 5-ml-Pipette. Einfügendie Pipette auf den Boden der Zentrifugenröhrchen mit Überstand. Langsam die Saccharose-Lösung unter dem Vektor Überstand. Wiederholen Sie diese Schritte für Überstand aus einer anderen Röhre. </li><li> Zentrifugieren Sie den Überstand bei 11000 rpm und 4 ° C für 4 h mit Beckman SW28 Rotor Schwung. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 150 ul 4% Laktose (hergestellt in PBS) zu jedem Zentrifugenröhrchen. Resuspendieren der Pellets. </li><li> Übertragen des Vektors aus konzentrierter alle Zentrifugenröhrchen in ein 1,5 ml-Röhrchen. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis für 15 min. </li><li> Mischen Sie den Vektor Suspension durch Pipettieren. Spin mit Mikrozentrifuge bei voller Geschwindigkeit (ca. 16000 g) für 1 min. </li><li> Überstand in ein neues 1,5-ml-Tube. Teilen Sie die letzte Probe in 20 ul Aliquots und lagerte sie in -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 3. Titration der Vektoren <ol><li> Samen 5 x 10 4 / Vertiefung von HT1080-Zellen in 12-Well-Platte in 1 ml DMEM-Medium mit 10% FBS. </li><li> Nach overnight Kultur, Zählen von Zellen aus einer gut punkten und die Zellzahl. </li><li> Make 5-fache serielle Verdünnung (1:5, 1: 25; 1:125 und 1:625) der konzentrierten Vektor mit Kulturmedium. Fügen ich ul der verdünnten Vektor zu trennen Brunnen. Die Proben können dupliziert, um die Genauigkeit zu erhöhen. </li><li> Fügen Sie 1 ul 4 mg / ml Polybren (Hexadimethrinbromid) in jede Vertiefung mit Vektor-und in einen Brunnen ohne Vektor. Mischen Sie durch leichtes Schütteln der Platte. Zurück zum Inkubator für 48 Stunden. </li><li> Entfernen Medium aus den Vertiefungen Zellkultur. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS. In 250 ul 1x Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen. Wenn die Zellen abgelöst werden (3-5 min), 1 ml Kulturmedium. Die Zellen durch Pipettieren. Übertragen Zellsuspension in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren bei 900 g für 6 min. Für Vektoren mit einem fluoreszierenden Reporter-Gen (zB GFP), gehen Sie zu 3,7 für FACS-Analyse fort. Für Vektoren ohne einen Reporter, gehen bis 3,8 für die Echtzeit-qPCR fort. </li><li> Für Vektoren, die eine fluostofflampen Reporter-Gen, der Überstand entfernt und das Pellet mit 300 ul 3,7% Formaldehyd in PBS. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Reporter-positiven Zellen durch FACS-Analyse. Der Titer wird als Transduktion Einheiten pro Milliliter eingeengt Vektor (TU / ml) dargestellt werden. </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> Wenn beispielsweise 1 × 10 5 Zellen wurde mit 1/25 ul (0,04 ul) Vektor und 30% transduzierte Zellen sind Reporter positiv ist, wird der Titer sein: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> Verwenden Sie nur die Verdünnungen fallen in einem linearen Zusammenhang zwischen dem Anteil der positiven Zellen und der Menge der Vektor-Titer hinzugefügt, um zu berechnen. Die Endtiter sollte ein Mittelwert der Titer von Transduktionen von mindestens 2 unterschiedliche Mengen des Vektors erhalten wird. <ol start="8"><li> Für Vektoren, ohne dass einfluoreszierenden Reporter-Gen, Extrahieren genomischer DNA aus HT1080-Zellen unter Verwendung QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) gemäß den Hersteller-Protokoll. Verstärken Vektorsequenz in genomischer DNA unter Verwendung des ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) mit den Primern (HIV-1 in PBS / psi Bereich 17) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;und 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;, und TaqMan-Sonde 5 &#39;-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3&#39;. Albumin-Gen, das eine einzelne Kopie-Gen im Genom (2 Kopien / Zelle) ist, hat auch mit den Primern 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &#39;und 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&#39; amplifiziert und Sonde 5&#39;-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 &#39;als interne Kontrolle. Bestimmen der Kopienzahl des Vektors und Albumin durch PCR in 96-Well-Platte nach der Bedienungsanleitung des Herstellers mit dem folgenden Programm: 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 10 min und 35 Zyklen von 95 ° C für 15 Sekunden und 60 ° C für 2 min. Zehn-fache serielle Verdünnungen von Plasmiden bekannter Konzentration (dargestellt als Kopieangegeben wurde) mit der Template-Sequenzen sollten auch verstärkt, um eine Standardkurve für die Quantifizierung von unbekannten Proben zu erzeugen. Der Titer wird als Integration Einheiten pro Milliliter eingeengt Vektor (IU / ml) dargestellt werden. </li></ol><img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. Transduktion neokortikaler Kulturen Großhirnrinde Kulturen, die sowohl Neuronen und Glia aus Maus-Kortex unter Verwendung eines Zwei-Schritt-Beschichtungsverfahrens wie vorstehend 18 beschrieben hergestellt. Neocortices aus fötalem Mäusen 14-16 Tage der Schwangerschaft gewonnen werden auf einem vorher festgelegten glialen Monoschicht in MEM mit 10% FBS, 20 mM Glucose und 2 mM Glutamin in 24-Well Gewebekulturplatte ausplattiert. <ol><li> Nach 5 Tagen in vitro, fügen Sie 10 uM Cytosinarabinosid (Ara-C) im NAZortical Kultur zu hemmen, nicht-neuronalen Zellteilung. Weiter Kultur die Zellen für 2 Tage. </li><li> Warm Kulturmedium bei 37 ° C Wasserbad für 5-10 min. Ersetzen Ara-C-haltigem Medium mit frischem Kulturmedium (500 ul / Vertiefung). </li><li> In Vektor mit gewünschten MOI (Multiplizität der Infektion, wobei das Verhältnis der Anzahl von Vektor-Partikeln auf die Anzahl der Zielzellen) zu der Kultur. Die Kultur für 24 Stunden. Wir verwenden MOI von 1-10 (meist 5) in primären kortikalen Kulturen. </li><li> Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium. Weiter Kultur. Wenn es ein Reporter-Gen im Vektor-Konstrukt, überprüfen Zellen unter fluoreszierenden Mikroskop 2 Tage nach Transduktion. Die Expression des Reportergens wird in Neuronen 2-7 sichtbar nach Transduktion, abhängig von der Vektor-Design, und die Dosis. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die Titer der lentiviralen Vektoren mit diesem Protokoll hergestellt Bereich 10 8 -10 10 IU / ml, seit M.h geeignet sind für die Transduktion von einer Vielzahl von Zelltypen CNS sowohl in vitro und in vivo. Tabelle 1 und 2 zeigen ein repräsentatives Ergebnis unter Verwendung der Vektoren, die dieses Protokoll hergestellt. Wir transduzierten murinen Neocortex Kulturen mit lentiviralen Vektoren, die grün fluoreszierendes Protein (GFP), die durch Synapsin (SYN)-Promotor oder gliales fibrilläres saures Protein (GFAP)-Promotor. Sieben Tage nach der Transduktion, führten wir Immunfärbung zur Kennzeichnung von Neuronen und Astrocyten mit Anti-NeuN und Anti-GFAP Antikörper. Wie in Tabelle 1 und Abb. 2A, nach der Transduktion mit dem Vektor, der das Synapsin-Promotor, über 90% der Neuronen (NeuN +-Zellen) exprimieren GFP und keine Astrozyten (GFAP +-Zellen) exprimieren diese Reportergens. Wenn GFAP-Promotor in den Vektor-Konstrukt (2B) verwendet wird, etwa 80% der Astrozyten (GFAP +-Zellen) Ausdrucks GFP; alle GFP +-Zellen sind Astrozyten durch Kolokalisation mit GFAP und Abwesenheit von GFP-Expression in NeuN-markierten Zellen bestätigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass lentivirale Vektoren sehr effizient Transgene Zellen aus ZNS und Zell-spezifischen Genexpression liefern können erreicht werden, wenn geeignete Promotoren verwendet werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der HIV-basierte lentivirale Vektoren und der Verpackungen Plasmide. Die HIV-1-Provirus ist an der Oberseite angezeigt. Die Elemente für Vektor-Produktion sind in vier verschiedenen Plasmiden getrennt. Lentivirales Übertragung Plasmid enthält ein Hybrid-5&#39;-LTR, in dem die U3-Region mit dem Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, der Verpackung Signal (ψ), der RRE-Sequenz, die zentralen Polypurin-Trakt (cPPT), einem Gen von Interesse (zB ersetzt eine fluoreszierende Reporter) zusammen mit einem Promotor der Wahl, und der 3 &#39;LTR, in dem diecis-regulatorischen Sequenzen werden vollständig von der U3-Region entfernt. pMDLg / pRRE enthält die gag und pol-Gene und RRE-Sequenz von HIV-1 unter der Kontrolle des CMV-Promotors. pRSV-Rev enthält die codierende Sequenz des Rev vor der RSV-Promotor angetrieben wird. pCMV-G enthält das VSV-G-Protein-Gens unter der Kontrolle des CMV-Promotors. PA gibt die Polyadenylierungssignal aus humanen β-Globin-Gen. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Expression von Reporter-Gene in der Maus neokortikalen Mischkultur transduziert mit lentiviralen Vektoren, die Zelltyp-spezifische Promotoren. Die Kulturen mit NS-SYN-GFP (A) oder LV-GFAP-GFP-Vektoren (B) bei einer MOI von 5 wurden transduziert. Sieben Tage nach der Transduktion wurden die Zellen mit anti-NeuN oder Anti-GFAP-Antikörper immungefärbt. Oberen Felder zeigen GFP-Fluoreszenz, zeigen mittleren und unteren Platten Immunfärbung Paneele sind Bilder fusioniert (GFP: grün; NeuN oder GFAP: rot). </p&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Vektor </td><td> GFP +-Zellen in Neuronen </td><td> GFP + in Astrozyten </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92,2 ± 7,3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78,3 ± 11,5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Vergleich der GFP-Expression in murinen Neocortex Kulturen transduziert mit lentiviralen Vektoren, die verschiedenen Promotoren ein. einem Maus-neokortikalen Kulturen (5 x 10 5 / Well in 24-Well-Platte) wurden mit LV-SYN-GFP-oder LV-GFAP-GFP-transduzierte bei einer MOI von 5. Sieben Tage nach der Transduktion wurden die Kulturen fixiert und immunhistochemisch für NeuN oder GFAP. Die Anzahl an GFP und NeuN / GFAP exprimierenden Zellen wurden in Bilder von 10 Feldern pro experimentellen Bedingungen gezählt. Die Werte stellen den Prozentsatz der Neuronen (NeuN +-Zellen) oderAstrozyten (GFAP + Zellen), die auch zum Ausdruck, die das GFP-Reportergen. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten.

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-Protein+Signaling-10+Negatively+Regulates+NF-{kappa}B+in+Microglia+and+Neuroprotects+Dopaminergic+Neurons+in+Hemiparkinsonian+Rats.">Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats.</a> J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).</li><li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoters+and+serotypes:+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo.">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Protokoll haben wir die Herstellung von lentiviralen Vektoren und Anwendung dieser Vektoren in neokortikalen Kulturen gezeigt. Wir haben gezeigt, effiziente und Zelltyp-spezifische Transduktion mit den Vektoren durch diese Verfahren hergestellt. Wenn der Synapsin-Promotor verwendet wird, ist die GFP-Expression streng neuronenspezifische. Wenn der GFAP-Promotor verwendet wird, ist die GFP-Expression ausschliesslich in Astrozyten. Wenn kein Zelltyp-spezifische Expression erforderlich ist, kann eine ubiquitäre P...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21 bis 040-CM </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> Natriumbutyrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimethrinbromid (Polybren) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> 293T-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> HT1080-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> Falcon 100 x 20 mm Gewebe-culturE Gericht </td><td> BD Biosciences </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 1 x 3 ½ in polyallomoer Zentrifugenröhrchen </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 326823 </td></tr><tr><td> 0,2-Mikron-Spritzenfilter </td><td> Corning </td><td> 431219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 51304 </td></tr></tbody></table>

production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system

Effizienter Gentransfer in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist bei der Untersuchung von Genfunktionen wichtig, Modellierung und Entwicklung von neurologischen Erkrankungen therapeutische Ansätze. Lentivirale Vektoren sind attraktive Kandidaten bei der Transduktion von Neuronen und anderen Zelltypen im ZNS, wie sie sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen, Unterstützung anhaltende Expression von Transgenen transduzieren, und relativ große Verpackungen Kapazität und geringer Toxizität 1-3. Lentivirale Vektoren wurden erfolgreich in Transduzieren viele neuronale Zelltypen in vitro 4-6 und 7-10 bei Tieren verwendet. Große Anstrengungen wurden unternommen, um lentiviralen Vektoren mit verbesserten biologischen Sicherheit und Effizienz für den Gentransfer zu entwickeln. Das aktuelle dritte Generation replikationsdefekt und selbst-inaktivierende (SIN) lentiviralen Vektoren sind in 1 dargestellt. Die erforderlichen Elemente für Vektor-Verpackungen sind in vier Plasmide aufgeteilt. In der lentiviralen transfer Plasmid wird der U3-Region in der 5&#39;-Long Terminal Repeat (LTR) mit einem starken Promotor aus einem anderen Virus ersetzt. Diese Modifikation erlaubt die Transkription der Vektorsequenz unabhängig von HIV-1-Tat-Protein, das normalerweise für HIV-Genexpression 11 erforderlich ist. Das Verpackungssignal (Ψ) ist für die Verpackung und die Rev-reaktive Element (RRE) wesentlich zur Herstellung hoher Titer Vektoren benötigt. Die zentralen Polypurin-Trakt (cPPT) ist für den Kernimport der Vektor-DNA eine Funktion zum Umwandeln nicht teilende Zellen 12 erforderlich wichtig. In der 3 &#39;LTR, werden die cis-regulatorische Sequenzen vollständig von der U3-Region entfernt. Diese Streichung ist auf 5 &#39;LTR nach der reversen Transkription kopiert, was zu einer transkriptionellen Inaktivierung beider LTRs. Plasmide pMDLg / pRRE enthält HIV-1 gag / pol-Gene, die Strukturproteine ​​und Reverse-Transkriptase bereitzustellen. pRSV-Rev Rev codiert, die zur RRE für eine effiziente RNA-Export aus dem Zellkern bindet. pCMV-G codiertdie vesikulären Stomatitis-Virus Glycoprotein (VSV-G), die HIV-1 Env ersetzt. VSV-G erweitert den Tropismus der Vektoren und ermöglicht Konzentration durch Ultrazentrifugation 13. Alle Gene, die für die akzessorischen Proteine, einschließlich vif, vpr, Vpu und Nef sind in der Verpackungs-System ausgeschlossen. Die Herstellung und Manipulation von lentiviralen Vektoren sollte nach den NIH-Richtlinien für die Forschung auf der Basis rekombinanter DNA (durchgeführt werden <a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a> ). Eine Genehmigung von einzelnen Institutionelle Biologische und Chemische Sicherheit Ausschuss kann vor der Verwendung lentiviralen Vektoren erforderlich sein. Lentivirale Vektoren werden häufig durch Kotransfektion von 293T-Zellen mit lentiviralen Transfer-Plasmid und den Helferplasmide die Proteine ​​kodieren für Vektor-Verpackung erforderlich produziert. Viele lentiviralen Transferplasmide und Helferplasmide kann von Addgene, eine nicht erreicht werdenPlasmid-Profit-Repository ( <a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Einige stabile Verpackungs-Zelllinien entwickelt worden, aber diese Systeme bieten weniger Flexibilität und Effizienz ihrer Verpackung in der Regel lehnt im Laufe der Zeit 14, 15. Im Handel erhältliche Kits können Transfektion unterstützen hohe Effizienz der Transfektion 16, aber sie kann sehr teuer für große Vektorpräparationen. Calciumphosphatpräzipitation Methoden bieten hocheffiziente Transfektion von 293T-Zellen und somit eine zuverlässige und kostengünstige Methode für lentiviralen Vektor Produktion. In diesem Protokoll, stellen wir lentiviralen Vektoren durch Co-Transfektion von 293T-Zellen mit vier Plasmide auf die Calciumphosphat-Präzipitation grundsätzlich durch Reinigung und Konzentration Ultrazentrifugation durch ein 20% Saccharose-Kissen nachgegangen wurde. Die Vektortiter durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Anallyse oder durch Echtzeit-qPCR. Die Herstellung und Titration von lentiviralen Vektoren in diesem Protokoll kann mit 9 Tagen abgeschlossen sein. Wir bieten ein Beispiel für diese Vektoren Transduktion in murine neokortikalen Kulturen, die sowohl Neuronen und Astrozyten. Wir zeigen, dass lentivirale Vektoren hohen Effizienz der Transduktion und Zelltyp-spezifische Genexpression in primär kultivierte Zellen von CNS unterstützen.

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Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

In diesem Protokoll beschreiben wir Produktion, Reinigung und Titration von lentiviralen Vektoren. Wir bieten ein Beispiel für lentiviralen Vektor-vermittelte Gentransfer in primär kultivierten Neuronen und Astrozyten. Unsere Verfahren können auch auf andere Bauarten gelten<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em&gt;.

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

production-lentiviral-vectors-for-transducing-cells-from-central

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.9K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. In diesem Protokoll beschreiben wir Produktion, Reinigung und Titration von lentiviralen Vektoren. Wir bieten ein Beispiel für lentiviralen Vektor-vermittelte Gentransfer in primär kultivierten Neuronen und Astrozyten. Unsere Verfahren können auch auf andere Bauarten gelten In-vitro- Und In-vivo-.

Serie: Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Systemischen und lokalen Drug Delivery zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems in Nagermodellen

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Intrathekale Lieferung von Antisense Oligonukleotiden im Zentralen Nervensystem der Ratte

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

Zuverlässige Isolierung von Mikrogefäßen des zentralen Nervensystems über fünf Wirbeltiergruppen hinweg

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...