Bu çalışma Washington Üniversitesi, Programı Projesi Hibe NS032636 (BJS) ile NIH Neuroscience Blueprint Çekirdek hibe (P30 NS057105, BJS) tarafından ve Sinir Hastalıkları Umut Merkezi tarafından desteklenmiştir.

1. Lentiviral Vektörler Ambalaj Lentiviral vektörlerin, bir lentiviral transferi vektör ve kalsiyum fosfat transfeksiyonu yöntemi ile 293T hücrelere ambalaj için gerekli olan diğer plasmidlerin kotransfeksiyonu ile üretilmektedir. Bu protokol 10 100-mm doku kültürü tabaklar kullanın. Bu büyütülüyor ya da aşağı uygulamalara bağlı olabilir. 293T hücre hattı% 10 fetal bovin serumu (FBS), 100 ünite / mL penisilin, 37 ° C&#39;de 100 ug / ml streptomisin ile desteklenmiş, yüksek glikoz (4500 mg / L) ile Dulbecco&#39;nun değiştirilmiş kartal besiyeri (DMEM) korunur % 5 CO2 inkübatör. <ol><li> Kültür ortamında 10 100-mm doku kültürü yemekleri (3 x 10 6 hücre / çanak)% 30-40 izdiham Tohum 293T hücreleri. Inkübatöre hücreleri dönün. </li><li> 20-24 saat sonra kültür, hücre yoğunluğu kontrol. Hücrelerinin transfeksiyonu zamanda yaklaşık% 80 birleştiği olmalıdır. </li><li> 50-ml tüp hazırlayın. 4.4 ml TE79/10 (1 mM TrisHCl, 0.1 mM eklemeEDTA, aşağıdaki plazmid DNA eksi toplam hacim pH 7,9). 100 ug lentiviral transferi plazmid (Şekil 1), 58 ug pMDLg / pRRE, 31 ug pCMV-G, 25 ug pRSV-Rev, 600 ul 2 M CaCI2. Ekleme Hafifçe karıştırın. </li><li> Başka bir 50 ml tüp hazırlayın. 5 ml 2x HBS (0.05 M HEPES, 0.28 M NaCl, 1.5 mM Na 2 HPO 4, pH 7.12) ilave edilir. </li><li> 10 ml pipet ile DNA-CaCI2 karışımı almak ve tüp vorteks ederken damla damla 2 x HBS içeren tüp eklemek. </li><li> 30 dakika oda sıcaklığında (RT) azından çöktürme reaksiyon tutmak. </li><li> Inkübatör gelen kültür kaplarına çıkarın. Vorteks tarafından iyi yağış reaksiyon karıştırın. Her 100 mm çanak içeren hücreler için süspansiyon 1 ml ekleyin. Süspansiyon hafifçe çanak orta dönen ederken yavaş yavaş, damla damla ilave edilmelidir. Inkübatör bu yemekleri dönün ve 5 saat bekletin. </li><li> Kültürden orta çıkarın. 6 mM sodyum met içeren 6 ml taze kültür ortamı ekleHer çanak tyrate. Inkübatöre kültürleri dönün. Kurgunun bir floresan muhabir varsa gecede kültürü sonra, floresan mikroskop altında raportör gen ekspresyonu kontrol edin. Bir yerde organizatörü (örneğin CMV organizatörü) tarafından tahrik eğer Genellikle, hücrelerin% 80 &#39;raportör gen ifade. </li><li> İki gün (40-44 saat) transfeksiyon sonrasında, 2 adet 50 ml&#39;lik tüplere-(yaklaşık 30 ml her biri tüp) içine 10 kaplarından supernatant toplamak. -80 ° C derin dondurucuda süpernatant dondurun veya bir sonraki adıma geçin. </li></ol> 2. Vektörler Konsantrasyon ve Arıtma <ol><li> Santrifüj taze süpernatant herhangi bir hücre artıkları çıkarmak için 10 dakika için 900 g (2000 rpm) toplanmış veya süpernatant çözülmüş. </li><li> 0,2-um SFCA şırınga filtresi için bir 60 ml şırınga takın. Şırıngaya 50-ml tüpten süpernatan transfer edin. Bir polyallomer santrifüj tüpüne süpernatant filtreleme. </li><li> Bir 5-pipetle ml kadar 5 ml% 20 sukroz (PBS içinde hazırlanmıştır) alır. EklemekSüpernatant içeren santrifüj tüpüne altına pipetle. Yavaşça vektör süpernatant altında sakaroz çözeltisini ekleyin. Başka bir tüpten süpernatan için bu adımları yineleyin. </li><li> ° C&#39;de 4 saat süreyle Beckman SW28 rotor salınım ile 11.000 rpm ve 4 de süpernatan santrifüjlenir. </li><li> Süpernatantı. Her bir santrifüj tüpüne 150 ul% 4 laktoz (PBS içinde hazırlanmıştır) eklenir. Peletler tekrar süspansiyon. </li><li> Tüm santrifüj tüplerine bir 1.5 ml tüp için konsantre vektör aktarın. 15 dakika süreyle buz üzerinde tüp bırakın. </li><li> Pipetleme tarafından vektör süspansiyon karıştırın. 1 dakika boyunca tam hızda (yaklaşık 16000 g) &#39;de mikrosantrifüj ile Spin. </li><li> Yeni 1.5-ml tüp için süpernatant aktarın. 20 ul kısma son örneği Böl ve -80 ° C derin dondurucuda onları saklanır. </li></ol> 3. Vektörler Titrasyon <ol><li> Tohum 5 x 10 4 / çukur% 10 FBS ile desteklenmiş 1 ml DMEM ortamı içinde 12-kuyulu plakalı in HT1080 hücre. </li><li> Overnig sonraht kültürü, iyi birinden hücreleri saymak ve hücre sayıda gol. </li><li> Kültür ortamı ile konsantre vektörü: 5-kat seri seyreltme (ve 1:625;; 1:125 25 1:05, 1) edin. Ayrı kuyu her seyreltilmiş vektör I ul ekleyin. Örnekleri doğruluğu artırmak için çoğaltılabilir. </li><li> Her oyuğa içeren vektör içinde ve vektör olmadan bir kuyuya 1 ul 4 mg / ml Polybrene (Hexadimethrine Bromür) eklenir. Yavaşça plaka sallayarak karıştırın. 48 saat kuluçka dönün. </li><li> Hücre kültürü kuyulardan orta çıkarın. PBS ile her iyi yıkayın. Hücrelere 250 ul 1x trypsine-EDTA solüsyonu eklenir. Hücrelerinin (3-5 dakika) ayrılır zaman, 1 ml kültür ortamına ilave edin. Pipet ile tekrar süspansiyon hücreleri. 1.5 ml santrifüj tüplerine hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 6 dakika boyunca 900 g&#39;de santrifüje. Bir floresan raportör gen (örn. GFP) ile vektörler için FACS analiz için 3.7 adıma geçin. Bir muhabir olmadan vektörler, gerçek zamanlı qPCR 3.8 adıma geçin. </li><li> Bir fluo içeren vektörler içinflüoresan raportör gen, süpernatant kaldırmak ve PBS içinde% 3.7 formaldehit 300 ul pelletini. FACS analizi ile raportör pozitif hücrelerin yüzdesi belirlemek. Titresi mililitre konsantre vektör (TU / ml) başına iletim birimi olarak temsil edilecek. </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> Örneğin, 1 x 10 hücre 5 1/25 ul (0.04 ul) vektörü ile% 30 hücreleri ile transdük edildi raportör pozitif, titresi olacaktır: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> Sadece dilüsyonları pozitif hücrelerin yüzdesi ve titresi hesaplamak için eklenmiştir vektörün miktarı arasında doğrusal bir ilişki içinde kalan kullanabilir. Nihai titresi vektörü, en az 2, farklı miktarlarda transductions elde titreleri bir ortalama olmalıdır. <ol start="8"><li> Bir olmayan vektörler içinflüoresan raportör geni, üreticinin protokolüne göre QIAamp DNA Mini Kiti (Qiagen) kullanılarak HT1080 hücrelerinden genomik DNA özü. Primerleri (HIV-1 PBS / bölge 17 psi olarak) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;ve 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39; ile ABI PRISM 7000 Serisi Detection System (Applied Biosystems) kullanılarak genomik DNA vektörü sekansı amplifiye ve TaqMan prob 5 &#39;-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3&#39;. Genom içerisinde tek bir kopyası geni (2 kopya / hücre) Albumin geni de primerler 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &#39;ve 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&#39; ile büyütüldü ve prob 5&#39;-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 edildi &#39;iç kontrol gibi. Aşağıdaki programı ile üreticinin talimatlarına uygun olarak 96-kuyulu plakalı içerisinde kopyalama vektörünün numaraları ve PCR ile albümini belirlenmesi: 15 saniye 50 ° C&#39;de 2 dakika, 95 ° 10 dakika ve 95 ile 35 döngü süresince C ° C ve 60 ° C&#39;de 2 dakika süreyle. Bilinen konsantrasyon plazmidlerin on kat seri seyreltme (kopya olarak temsilnumarası) şablonu sekansları da bilinmeyen örneklerin ölçümü için standart bir eğri oluşturmak için amplifiye edilmelidir içeren. Titresi mililitre konsantre vektör (IU / ml) başına entegrasyon birimleri olarak temsil edilecektir. </li></ol><img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. Neokortikal Kültürlerin İletimi Nöronları ve glia hem içeren neokortikal kültürler, daha önce tarif edildiği gibi 18 iki aşamalı bir prosedür kullanılarak kaplama fare korteksleri hazırlanır. 14-16 gün gebe fetal farelerde elde Neocortices% 10 FBS, 24-sıra doku kültürü plakası 20 mM glukoz ve 2 mM glutamin ile desteklenmiş MEM daha önceden kurulan glial tek tabaka üzerine kaplanır. <ol><li> In vitro 5 gün sonra, neoc içinde 10 uM sitozin arabinozid (Ara-C) ilaveortical kültürü non-nöronal hücre bölünmesini inhibe etmek için. Kültürü 2 gün süreyle hücreleri devam etmektedir. </li><li> 5-10 dakika için 37 sıcak kültür ortamı ° C su banyosu. Taze kültür ortamı (iyi 500 ul /) ile orta içeren Ara-C değiştirin. </li><li> Kültüre; istenen MOI (hedef hücrelerin sayısı vektörü parçacıkların sayısı oranı enfeksiyon çokluğu) ile vektör ekleyin. 24 saat boyunca kültürün devam etmektedir. Biz birincil kortikal kültürlerde (genellikle 5) 1-10 MOI kullanın. </li><li> Taze aracı madde ile kültür ortamı yerini alır. Kültürü devam edin. Vektör yapı bir raportör geni olması durumunda, 2 gün sonra transdüksiyon flüoresan mikroskop altında hücreleri kontrol. Muhabir gen ekspresyon vektör tasarım ve kullanılan doza bağlı olarak, transdüksiyon sonra nöronlar 2-7 görünür olacaktır. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokol aralığı ile üretilen lentiviral vektörlerin titreleri 10 8 -10 10 IU / ml, kavrayıĢh, in vitro ve in vivo hem de CNS gelen hücre tipleri çeşitli transdüksiyonu için uygundur. Tablo 1 ve Şekil 2, bu protokolü tarafından üretilen vektörler kullanılarak temsili bir sonucu göstermektedir. Biz transdük ifade lentiviral vektörler ile fare neokortikal kültürler yeşil floresan proteininin (GFP) synapsin (SYN) yükseltici ya da glial fibriller asidik protein (GFAP) organizatörü tarafından denetlenir. Yedi gün transdüksiyon sonra, sırasıyla, anti-neun ve anti-GFAP antikorlar ile etiket nöronlar ve astrositler için İmmünoboyama yapıldı. Tablo 1 ve Şek. 2A, nöronların% 90 (Neun + hücreler) üzerinden, synapsin organizatörü taşıyan vektör ile iletimi sonrasında ekspres GFP ve hiçbir astrositler (GFAP + hücreleri) bu muhabiri gen ifade. GFAP promotör astrositler yaklaşık% 80 (GFAP + hücreleri) ekspresyonunu, vektör yapı (Şek. 2B) kullanıldığı zamans GFP, tüm GFP + hücreler GFAP ile kolokalizasyon ve Neun-etiketli hücrelerde GFP yokluğunda tarafından onaylandıktan olarak astrositler vardır. Bu sonuçlar, lentiviral vektörler CNS ve hücre özel gen ifadesi ile hücrelere transgenlerin sağlamak için çok verimli olan uygun arttırıcılar kullanıldığı zaman elde edilebilir olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> Şekil 1.. HIV tabanlı lentiviral vektörler ve ambalaj plazmid şematik gösterimi. HIV-1 provirus üst kısmında gösterilir. Vektör üretimi için elemanları dört farklı plazmidler ayrılır. Plazmid lentiviral transferi U3 bölgesi sitomegalovirüs (CMV) promotöründen, ambalaj sinyali (ψ), HKD sekansı, merkezi polypurine yolu (cPPT), ilgilenilen bir gen (örn. ile değiştirildiği bir hibrid 5 &#39;LTR içerir Bir floresan tercih edilen bir promotörü ile birlikte raportör), ve 3 &#39;LTR hangicis düzenleyici sekanslar tamamen U3 bölgesi kaldırılır. pMDLg / pRRE CMV arttırıcının kontrolü altında, HIV-1 den tıkaç ve pol genleri ve HKD sekansı içerir. pRSV-Rev RSV organizatörü tarafından tahrik Rev kodlama dizisi içerir. pCMV-G CMV arttırıcının kontrolü altında VSV-G-protein gen içerir. PA insan β-globin geni poliadenilasyon sinyali gösterir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> Şekil 2. Fare neokortikal karışık kültüründe haberci gen ifadesi hücre tipinde belirli bir arttırıcılar-taşıyan lentiviral vektörleri ile transdük. Kültürleri LV-SYN-GFP (A) veya (B) bir MOI 5 azından LV-GFAP-GFP vektörleri ile transdük edildi. Yedi gün transdüksiyon sonra, hücreler, anti-Neun veya anti-GFAP antikoru ile boyanmış edildi. Üst panelleri GFP floresans gösteren, orta panelleri immun göstermek ve alt paneller (GFP: yeşil; Neun veya GFAP: kırmızı) görüntüler birleştirilir. </p&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Vektör </td><td> Nöronlarda GFP + hücrelerin </td><td> Astrositlerde GFP + </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92.2 ± 7.3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78.3 ± 11.5 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Mürin neokortikal kültürlerinde GFP tanımı karşılaştırılması farklı yükselticilerde bir taşıma lentiviral vektörleri ile transdük. Bir Mürin neokortikal kültür (5 x 10 5 / iyi 24 de plaka), bir İçişleri Bakanlığı 5 at LV-SYN-GFP veya LV-GFAP-GFP ile transdük edildi. Transdüksiyon sonra yedi gün, kültürleri sabit ve Neun veya GFAP boyama yapıldı. GFP ve Neun / GFAP eksprese eden hücrelerin sayısı deneysel koşul başına 10 alan görüntüleri sayılmıştır. Değerleri veya nöron yüzdesi (Neun + hücreler) temsilAyrıca GFP raportör gen ifade astrositler (GFAP + hücreler). Gösterilen değerler aracı ± standart sapma, üç bağımsız deneyin gelmektedir.

<ol>
	<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery.">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).</li><li>Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-promoter+lentiviral+vectors+for+constitutive+and+regulated+gene+expression+in+neurons.">Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).</li><li>Hioki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transduction+of+neurons+by+lentivirus+with+enhanced+neuron-specific+promoters.">Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters.</a> Gene Ther. 14, 872-882 (2007).</li><li>Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+promoter+usage+for+lentiviral+vector-mediated+transduction+of+cultured+central+nervous+system+cells.">Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells.</a> J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfer,+integration,+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector.">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li><li>Blomer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector.">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).</li><li>Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+transgene+expression+in+rat+brain+using+lentiviral+vectors.">Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors.</a> J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).</li><li>Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-activator+gene+of+human+T-lymphotropic+virus+type+III+(HTLV-III).">Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III).</a> Science. 229, 69-73 (1985).</li><li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+immunodeficiency+virus+type-1+central+DNA+flap+is+a+crucial+determinant+for+lentiviral+vector+nuclear+import+and+gene+transduction+of+human+hematopoietic+stem+cells.">The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 96, 4103-4110 (2000).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors:+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells.">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).</li><li>Farson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new-generation+stable+inducible+packaging+cell+line+for+lentiviral+vectors.">A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).</li><li>Broussau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture.">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).</li><li>Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titering+lentiviral+vectors:+comparison+of+DNA,+RNA+and+marker+expression+methods.">Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods.</a> Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).</li><li>Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+heat+stress+reduces+excitotoxic+and+apoptotic+components+of+oxygen-glucose+deprivation-induced+neuronal+death+in+vitro.">Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro.</a> J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).</li><li>Mazarakis, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+virus+glycoprotein+pseudotyping+of+lentiviral+vectors+enables+retrograde+axonal+transport+and+access+to+the+nervous+system+after+peripheral+delivery.">Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery.</a> Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).</li><li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+gene+transfer+through+retrograde+transport+of+lentiviral+vector+pseudotyped+with+a+novel+type+of+fusion+envelope+glycoprotein.">Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).</li><li>Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production.">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li><li>Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+production+and+concentration+of+HIV-1-based+lentiviral+vectors+using+HYPERFlask+vessels+and+anion+exchange+membrane+chromatography.">Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography.</a> BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).</li><li>Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+butyrate+stimulation+of+HIV-1+gene+expression:+a+novel+mechanism+of+induction+independent+of+NF-kappa+B.">Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B.</a> J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).</li><li>Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+efficient+production+and+transduction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+vectors.">Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors.</a> J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).</li><li>Palsson, B., Andreadis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physico-chemical+factors+that+govern+retrovirus-mediated+gene+transfer.">The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer.</a> Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-Protein+Signaling-10+Negatively+Regulates+NF-{kappa}B+in+Microglia+and+Neuroprotects+Dopaminergic+Neurons+in+Hemiparkinsonian+Rats.">Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats.</a> J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).</li><li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoters+and+serotypes:+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo.">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokolde, bu neokortikal kültürlerde bu vektörlerin lentiviral vektörler ve uygulamanın üretimi göstermiştir. Bu yöntem tarafından üretilen vektörleri ile verimli ve hücre tipinde belirli bir transdüksiyon-göstermiştir. Synapsin promotör kullanıldığında, GFP tanımı katı nöron özgüdür. GFAP organizatörü kullanıldığında, GFP astrositlerde münhasıran. Herhangi bir hücre tipinde belirli-ifadesi gerekli ise, her yerde bulunan bir promotör kullanılabilir. Biz sahipleri neokortikal kültürler 6 yüksek düzeyde gen ekspresyonu sürebilirim ubiqutin ve fosfogliserat kinaz (PGK) hem de bulundu. Lentiviral vektörler ile tahrik Gen ekspresyonu yararlanıcı seçimi (örneğin, her yerde yazın yada özel hücre) tarafından veya belirli doku veya uygulamalar hedef farklı zarf proteinleri ya da vektör pseudotypes kullanarak ifade veya hücre tiplerinin belirli seviyeleri için özelleştirilebilir. Örneğin, kuduz G proteinin veya VSV-G&#39;nin bir füzyon bir sahip pseudotypingd kuduz protein retrograd aksonal transport 19,20 destekler. Geçici transfeksiyon protokol farklı zarf proteinleri ile vektör ambalaj sağlar. Lentiviral vektörler yaygın saflaştırma adımları olmadan ultrasantrifiij ile yoğunlaşmıştır. Bunlar arıtılmadan vektörler birçok hücre tipleri için uygundur. Bununla birlikte, primer kültürler nöronal sitotoksisite için kesikli varyasyona kesikli sonuçlanan, üretici hücre içerisinden kirletici maddelerin duyarlıdır. % 20 sukroz yastık saflaştırma adım vektörler tutarlı toksik olmayan primer nöronlarında yapar. Biz hayvanların içine primer nöron ve enjeksiyon iletimi için saflaştırılmış vektörler kullanmanızı öneririz. Vektör preparatların daha büyük bir ölçekte veya daha yüksek saflıkta istenmesi halinde, örneğin yakınlık kromatografisi 21 ve anyon değişim kromatografisi membranı 22 olarak, diğer saflaştırma teknikleri kullanılabilmektedir. Uzun vadeli transdüksiyon genel primer kültürler olarak nöronal gerekli olduğu, Özel dikkat vektörlerin hazırlanması sırasında kontaminasyonu en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. 0.2 uM filtre ile vektör süpernatant geçen ve vektör konsantrasyonu sırasında otoklavlanabilir polyallomer santrifüj tüpleri kullanılarak bu amaca hizmet edecektir. Süpernatan büyük bir hacim süzüldü gerekiyorsa şişe üstü filtre kullanılabilir. Sodyum butirat arttırıcılar 23 aktivitesini uyarmak için rapor edilmiştir. Üretici hücre sırasında transfeksiyonundan sonra kültür ortamına ilave edilmesi sodyum butirat 10&#39;dan fazla kat 24 vektörü titresi artırabilir. Polybrene (hexadimethrine bromür) yaygın böylece vektör-hücre etkileşimi 25 kolaylaştırılması, negatif yükler nötralize ederek retroviral gen transferi verimini artırmak için gen transferi protokolleri için kullanılmaktadır. Bizim ellerde, polybrene neokortikal kültürlerinde nöronlar için toksiktir. Bu nedenle, polybrene primer nöronal kültürlerde geçirilmesinde kaçınılmalıdır. VarsaVektör olarak bir flüoresan raportör, bu FACS analizi ile vektörü titresi belirlemek için uygundur. Herhangi bir raportör mevcuttur ya da reporter gene hedef hücreler olarak vektör entegrasyonu tespit etmek için bir dokuya özel bir promotör, qPCR tarafından tahrik edilir zaman vektörünün entegrasyon transgen ifadesi bağımsız olarak, daha iyi bir seçimdir. Vektörünün tüm entegre kopyaları fonksiyonel olarak FACS analizi ile belirlendi belirli vektörlerin titresi qPCR göre daha düşük olacaktır. Vektör titreleri de vektör hazırlıklarına QRT-PCR ile ELESA veya vektör genomik RNA tarafından HIV p24 proteini ölçülerek belirlenebilir. Bununla birlikte, bu yöntem nedeniyle kaçınılmaz olarak ambalaj süreci ve başarılı bir hedef hücreler 26 transdüksiyonu yoktur fonksiyonel parçacıklar esnasında üretilen defektif viral partiküllerin önemli sayıda karşı daha az hassas olan. Bu protokol tarafından yapılan vektörler ro in vitro ve in vivo hem de in başarılı bir şekilde kullanılmıştırdent beyin 27. Vektör aracılı gen ekspresyonu hücre kültürlerinde ve hatta aynı hücre tipi 6,28 in vivo sistemlerde zorunlu olarak özdeş değildir gibi Araştırmacılar, tek tek kendi sistemlerinde test etmelisiniz. Lentiviral vektörler yaygın aşırı veya MSS hücre türleri çeşitli ilgi genleri aşağı vurma kullanılmıştır. Sinirbilim araştırmacılar araştırma uygulamalarında lentiviral vektörler geliştirmek için sizleri protokol yardımcı olmalıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CM </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> Sodyum butirat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimethrine bromür (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> 293T hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> HT1080 hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> Falcon 100 x 20 mm doku kültüre çanak </td><td> BD Biosciences </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> X 3 ½ polyallomoer santrifüj tüpünde 1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 326823 </td></tr><tr><td> 0.2-mikron şırınga filtresi </td><td> Corning </td><td> 431219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 51304 </td></tr></tbody></table>

production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system

Merkezi sinir sistemi (MSS) etkili gen teslim nörolojik hastalıklar modelleme ve tedavi yaklaşımların geliştirilmesinde, gen fonksiyonları okuyor önemlidir. Lentiviral vektörler ikisi de bölünmesi ve non-bölünen hücreleri, transgenlerin destek sürekli ifade transdüksiyonu olarak MSS nöronlar ve diğer hücre tipleri iletiminde çekici araçlar ve nispeten büyük paketleme kapasitesi ve düşük toksisite 1-3 var. Lentiviral vektörler başarılı bir in vitro 4-6 birçok sinir hücre tipleri transdüklenmesinden ve 7-10 hayvanlarda kullanılmıştır. Büyük çabalar geliştirilmiş biyogüvenlik ve gen teslimatı için verimlilik ile lentiviral vektörler geliştirmek için yapılmıştır. Mevcut üçüncü nesil çoğaltma-arızalı ve kendini inaktive (SIN) lentiviral vektörler Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Vektör paketleme için gerekli elemanları dört plazmidler ayrılır. Lentiviral transplazmid fer, 5 &#39;, uzun terminali tekrarlama (LTR) içinde U3 bölge başka bir virüs kuvvetli bir promotör ile değiştirilir. Bu normal olarak modifikasyonu HIV gen ifadesi 11 için gerekli olan HIV-1 Tat protein vektörü sekansının transkripsiyon bağımsız sağlar. Ambalaj sinyali (Ψ) encapsidation ve Rev-duyarlı elementi (HKD) için gerekli olan yüksek titresi vektörler üretimi için gereklidir. Merkez polypurine yolu (cPPT) vektörü DNA Nükleer alma, non-bölünen hücre 12 transdüklenmesinden için gerekli bir özellik için önemlidir. 3 &#39;LTR olarak, cis-düzenleyici sekanslar tamamen U3 bölgesi kaldırılır. Bu silme işlemi iki LTR transkripsiyonel inaktivasyonu sonucunda, ters transkripsiyon sonra 5 &#39;LTR kopyalanır. Plazmid pMDLg / pRRE yapısal proteinler ve ters transkriptaz temin HIV-1 GAG / pol genler, içerir. pRSV-Rev çekirdekten verimli RNA ihracat için HKD bağlar Rev kodlar. pCMV-G kodlarHIV-1 Env yerini veziküler stomatit virüsü glikoprotein (VSV-G). VSV-G vektörlerin tropizmi genişler ve ultra-santrifüj ile 13 konsantrasyonu sağlar. Vif, VPR, VPU ve Nef gibi aksesuar proteinleri şifreleyen genler Bütün, ambalaj sistemi içinde tutulur. Lentiviral vektörlerin üretim ve manipülasyon rekombinant DNA (ilgili araştırma için NIH kurallarına göre yapılmalıdır <a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a> ). Bireysel Kurumsal Biyolojik ve Kimyasal Güvenlik Komitesinden bir onay lentiviral vektörler kullanmadan önce gerekli olabilir. Lentiviral vektörleri genellikle lentiviral transferi plazmid vektörü ve ambalaj için gerekli olan proteinleri şifreleyen plazmitler ile birlikte yardımcı 293T hücrelerinin kotransfeksiyonu ile üretilmektedir. Birçok lentiviral transferi ve plazmid helper plazmidler Addgene, bir non elde edilebilirKar plazmid deposu ( <a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Bazı stabil ambalaj hücre hatları geliştirilen, ancak zamanla bu sistemler üzerinden 14 daha az esneklik ve paketleme verimliliği genellikle azalır, 15 sunmak olmuştur. Piyasada bulunan transfeksiyon kitleri transfeksiyon 16 yüksek verimlilik desteği olabilir, ancak büyük ölçekli vektör hazırlıkları için çok pahalı olabilir. Kalsiyum fosfat çöktürme yöntemleri 293T hücrelerinin yüksek verimli transfeksiyon sağlamak ve böylece lentiviral vektör üretimi için güvenilir ve maliyet etkin bir yaklaşım sağlamak. Bu protokolde, bir% 20 sukroz yastık yoluyla saflaştırma ve ultra-santrifüj ile konsantrasyon izledi kalsiyum fosfat çöktürme prensibine dayanan dört plazmit ile 293T hücrelerinin kotransfeksiyonu ile lentiviral vektörler üretirler. Vektör titreleri floresans aktive hücre sıralama (FACS) anal tarafından belirleniranalizden veya gerçek zamanlı qPCR tarafından. Bu protokolde lentiviral vektörlerin üretimi ve titrasyon 9 gün ile bitmiş olabilir. Biz nöron ve astrositlerine içeren fare neokortikal kültürleri içine bu vektörlerin transducing bir örnek sağlar. Biz lentiviral vektörler iletimi ve MSS primer kültürlerinde hücrelerinde hücre tipine özgü gen ekspresyonu yüksek verimlilik desteği göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System at JoVE.com

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Bu protokolü biz üretim, saflaştırma ve lentiviral vektörlerin titrasyonu açıklar. Biz primer kültürlerinde nöronlar ve astrositlerde lentiviral vektör aracılıklı gen aktarımının bir örnek oluşturmaktadır. Bizim yöntemleri diğer hücre türleri için de geçerli olabilir<em&gt; In vitro</em&gt; Ve<em&gt; In vivo</em&gt;.

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

production-lentiviral-vectors-for-transducing-cells-from-central

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.9K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. Bu protokolü biz üretim, saflaştırma ve lentiviral vektörlerin titrasyonu açıklar. Biz primer kültürlerinde nöronlar ve astrositlerde lentiviral vektör aracılıklı gen aktarımının bir örnek oluşturmaktadır. Bizim yöntemleri diğer hücre türleri için de geçerli olabilir In vitro Ve In vivo.

Video: Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Kemirgen Modeller Merkezi Sinir Sistemi Hastalıkları Tedavisinde Sistemik ve Yerel İlaç Taşıyıcı

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Nörobilim

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Sıçan Merkezi Sinir Sisteminde Antisense Oligonükleotidlerin İntinal Teslimi

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...