Agradecemos a Andy Johnson, do Centro de Pesquisa Biomédica da UBC para a assistência com a análise FACS. Financiamento de Pesquisa do Câncer no Laboratório de Wong é fornecido pelo Canadian Cancer Society Research Institute (subvenção de funcionamento # 019250) e de fundos de pesquisa de reinvestimento da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UBC. JMYW é apoiado pelos presidentes de Pesquisa do Canadá ea Fundação Michael Smith para Pesquisa em Saúde programas de desenvolvimento de carreira.

1. Preparação de células <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="Figura 0" /> <ol><li> Células da placa para alcançar uma densidade de aproximadamente 60% de confluência. As células devem estar em fase log, no momento da recolha. Para células MCF7, isto é conseguido por sementeira menos 5 x 10 5 células / placa 10 centímetros nos meios apropriados. HT29 e LS180 células são semeadas a 6 x 10 5 células / placa 6 cm. Utilizou-se meio DMEM suplementado com 10% de FBS, penicilina e 1x / estreptomicina. Certifique-se de placas de sementes para os controles corretos positivos e negativos emAlém de amostras de teste. Eles incluem o seguinte: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Eu </td><td> controlo positivo </td><td> BrdU apenas </td></tr><tr><td> ii </td><td> controlo positivo </td><td> PI só </td></tr><tr><td> iii </td><td> controle negativo </td><td> BrdU negativo, PI negativo </td></tr></tbody></table> (Deve ser notado que uma experiência preliminar com pontos temporais múltiplas, tais como o descrito na presente protocolo pode ser utilizado para diminuir o período de tempo durante o qual a efectuar colecções futuras.) <ol start="2"><li> As células plaqueadas são incubadas a 37 ° C, 5% de CO2 durante 24-48 h, permitindo assim que as células para recuperar e juntar. </li><li> Para pulsar as células de etiquetas com bromodeoxiuridina (BrdU), DMEM é substituído with meio fresco contendo 10 mM de BrdU. As células são incubadas durante 1 h, a 37 ° C, 5% de CO 2 para permitir a incorporação de BrdU no DNA. Certifique-se de deixar um prato cru para atuar como controle negativo. </li><li> Os meios de impulso de rotulagem é removido e as células são lavadas brevemente com PBS 1X. </li><li> Meios de crescimento fresco é adicionado (menos o BrdU) e as células são permitidos para continuar a incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 até que o instante apropriado para a colheita é atingido. </li></ol> 2. Colheita e Fixação <ol><li> Células não tratadas a partir do passo 1,3 são considerados o instante zero. Esta amostra pode ser colhido em conjunto com o 1 h timepoint o qual é recolhido imediatamente após o tratamento BrdU. </li><li> Para a colheita das células, meio é removido e as placas são lavadas uma vez com PBS 1X. </li><li> As células são tripsinizadas, recolhido em meios de cultura e subsequentemente sedimentadas por centrifugação a 1500 rpm durante 5 min Supernatant é descartado. </li><li> Lavar 1-10 x 10 6 células em 5 ml de gelo frio 1X PBS. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 min O sobrenadante é descartado. </li><li> O sedimento celular é então ressuspenso em 100 ul de PBS gelado / 1% de FBS. A adição de FBS a 1% em PBS auxilia na prevenção de agregação celular. </li><li> Adicionar gota estes células por gota a 5 ml de -20 ° C, etanol a 70% para fixar as células. </li><li> Incubar em gelo durante 30 min ou armazenar a 4 ° C durante a noite. Este é um passo no qual ideal para parar a recolha de amostras a partir dos pontos temporais diferentes. As amostras podem ser deixados em etanol durante vários dias, o que lhes permite ser processados ​​simultaneamente através do resto do protocolo. </li></ol> 3. Coloração BrdU e PI <ol><li> Células de pelotas por centrifugação durante 5 min a 1500 rpm. </li><li> Remover o fixador, mas deixam ~ 50 ul em que a afrouxar o sedimento em vórtice. </li><li> Para desnaturar o DNA, adicionar lentamente 1 ml de HCl 2N / Triton X-100gota a gota enquanto vortex. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Células de pelotas por centrifugação amostras durante 5 min a 1500 rpm. Aspirar e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de tetraborato de sódio 0,1 M, pH 8,5, para neutralizar o passo de desnaturação. </li><li> Centrifugar células durante 5 min a 1500 rpm. Aspirar e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 75 ul de BrdU mistura de coloração (50 ul 0,5% de Tween 20/1% de BSA / PBS + 20 uL conjugado com FITC anti-BrdU + 5 ul de 10 mg / ml de RNase). </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 45 min protegida da luz. </li><li> Para células de pelotas, centrifugar as amostras durante 5 min a 1500 rpm. Aspirar e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS contendo 5 ug / ml de iodeto de propídio. </li></ol> 4. Citometria de Fluxo <ol><li> Para analisar as células, um citómetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm eafiltros adequados é necessário. Software de análise, tais como CellQuest é necessário para criar as parcelas descritas abaixo. </li><li> Ao executar a amostra através do citómetro de fluxo, criar uma dispersão para a frente (SSC-H) vs lado de dispersão (FSC-H) trama para assegurar a distribuição de tamanho apropriado de células (Figura 1A). Ambos estes parâmetros são traçados em escala linear. </li><li> Ao mesmo tempo ver um pedaço de FL3-H (PI mancha) versus FL2-W (Figura 1B). Este lote é usado para criar um portão (R3) para isolar a fracção de células que estão dentro do padrão de distribuição normal do ciclo celular. Em geral, este padrão de distribuição é caracterizado por dois grupos de células a partir do conteúdo de DNA 2N e 4N de PI que representa a coloração G1 e G2 fases do ciclo celular, respectivamente. Uma série de células localizadas entre estes 2 aglomerados é representativa de replicação do ADN em curso que ocorre na fase S do ciclo celular. </li><li> Criar um displayi enredong as células gated (R3) a partir do passo 4.3, com FL1-H (FITC, gráfico log) sobre o eixo y e PI (gráfico linear) sobre o eixo X (Figura 1C). Este lote será utilizada para definir os parâmetros restantes usando os vários controlos descritos em 1,1, bem como para recolher dados para análise. </li><li> Coloque o PI apenas uma amostra manchado para o citômetro. Ajustar o ganho G1 para colocar a ~ 200 sobre o eixo x. Este será mais fácil de visualizar em um histograma do PI mancha. </li><li> Um segundo controlo envolve a execução de uma amostra de BrdU-somente no citómetro de fluxo. Ajuste o ganho de modo que as 2 populações de células (BrdU positivo versus negativo BrdU) aparecem na trama. Idealmente, as células BrdU negativos são posicionados para aparecer logo abaixo 10 -1. </li><li> O controlo final é a amostra BrdU / PI negativo. Executar este controlo negativo para assegurar que as células não aparecer em qualquer um dos quadrantes mão superior ou para a direita. </li><li> Uma vez que os parâmetros dos diversos terrenos terem sido definidos, ocitómetro de fluxo é calibrado e pronto para o processamento de BrdU e PI células coradas. Um mínimo de 10.000 células que estão fechado na fração PI correta (veja passo 4.3) deve ser lido por coleção. </li><li> Para analisar os dados coletados, software, tais como FlowJo ou FacsDiva são utilizados. Cada uma das parcelas acima mencionadas podem ser recriados nestes programas e análise quantitativa e estatística realizada. </li><li> O ponto final da análise, envolve várias etapas sucessivas. Criar um gráfico de FITC vs PI com células fechadas como PI positivo do enredo PI versus FL2-W permite distinguir a população andar de bicicleta. Uma segunda porta é criado a partir deste gráfico, isolando a população BrdU positivo. Expressando esta população distintivo num lote histograma com PI sobre o eixo x permite uma para controlar o curso de tempo da progressão do ciclo celular. Isto pode ser ainda mais visualizados através da representação gráfica do número de células positivas para BrdU-com G1 ou G2 conteúdo como uma função do tempo. </li></ol> 5. Os resultados representativos Normalmente, as células de ciclismo coradas com iodeto de propídio têm picos distintos no G1 e G2, que correspondem a células que contêm o conteúdo de DNA 2N e 4N, respectivamente (Figura 2). Pulso marcação com BrdU permite rotulagem selectiva de uma sub-população de células que são activamente síntese de DNA (ou seja, fase S). Pouco tempo depois da remoção do reagente BrdU, todas as células marcadas são em fase S (Figura 3). Ao restringir rotulagem a um pulso curto uma é capaz de seguir esta agora distinta sub-população de células ao longo pontos de tempo numerosos à medida que passam através das fases subsequentes do ciclo celular. Isto pode ser visualizado no ponto de tempo de 1 h na Figura 3 como uma falta distinta de G1 e G2 picos. Informações adicionais podem ser derivadas a partir do passo de rotulagem BrdU. Não só a proporção de células que se dividem activamente ser medido, mas uma estimate de célula de distribuição fase do ciclo entre duas amostras pode ser determinada também. Através da recolha de células em intervalos igualmente espaçados após a remoção do reagente BrdU, as células podem ser rastreados quanto elas continuam a progredir ciclo, para G2 e, finalmente, mover-se através da divisão celular das células originais, finalmente a emergir como células BrdU-positivas filha com G1 O conteúdo de DNA (Figura 4). Um exemplo de célula quantificação fase do ciclo e análise cinética é fornecida na Figura 5. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. (A) Forward Scatter contra Dispersão lateral de uma população de células representante MCF7. (B) em relação PI largura da parcela (FL-W) de uma população de células MCF7 representativa. Gating é mostrado para excluir dupletos de células na análise final (R3). Dupletos célula terá largura maior do pulso do que uma única célula, uma vez que levam mais tempo para passar através do feixe de laser e Therefminério pode ser excluídos da análise. (C) contra PI FITC Lote (BrdU) de uma população de células MCF7 representativa. Gating é mostrado para incluir apenas os FITC (BrdU), as células positivas (R4). <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Parcela representativa do histograma de uma população total de células normalmente ciclismo. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Histograma de células que tenham sido recolhidos 1h após a remoção do pulso BrdU, após gating para FITC (BrdU)-células positivas. BrdU células positivas em um instante precoce após a remoção do rótulo apresentam perfis de PI que correspondem a amostras visualizar o conteúdo de DNA de acordo com células que estão na fase S do ciclo celular, confirmando a rotulagem bem sucedida de células apenas durante a síntese de ADN. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" a<html> lt = &quot;Figura 4&quot; /&gt; Figura 4. Comparação da cinética de progressão do ciclo celular entre as linhas celulares de cancro da, cancros colorrectais HT29 (A) e LS180 (B), bem como o cancro da mama MCF7 (C). As células foram recolhidas a cada hora durante 8 horas, após a remoção do pulso BrdU. Nesta experiência, observou-se um perfil de clara de progressão do ciclo celular acelerado através da fase G2 do ciclo celular na LS180 colorectal linha celular. Comparando a cinética entre os dois perfis de células cancerosas colorectal, o aparecimento de um pico de G1 é evidente a T = 4h de pós-BrdU nas células LS180, em comparação com o ponto de tempo correspondente para a linha de células HT-29 que não possui este pico. Comparado com qualquer uma das duas linhas de células colorrectais, MCF7 células são bicicleta, a uma taxa significativamente reduzida. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">para ver figura maior</a> . <html> re 5 &quot;/&gt; Figura 5. (A) Quantitativa célula análise fase do ciclo de células BrdU-etiquetados cancerosas. O algoritmo de Dean / Jett / Fox foi aplicado a HT29, LS180 e MCF7 (ilustrado em verde). As células resultantes distribuições ciclo de fase de cada amostra são expressos como% total de células positivas para BrdU para cada fase. Apenas seleccionar pontos de tempo para cada linha de células são apresentados, como as análises para alguns dos pontos de tempo anteriores produzido resultados inválidos. Nestes pontos de tempo anteriores, todas as células BrdU-positivas estão em fase S e, por conseguinte, não têm G1 distinta e picos G2, que são necessárias para a aplicação do algoritmo. (B) Os histogramas de células cancerosas mostrando a cinética da progressão através G2 / M fases do ciclo celular. A progressão G2 / M fases é mais rápido para LS180 células, seguido por HT29 e MCF7. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">Clique aqui para ver maior figura</a> . <html> &quot;alt =&quot; jpg Figura S1 &quot;/&gt; Figura S1. Controles de citometria de fluxo. células MCF7 são mostrados como (A) controlo negativo, onde as células não são nem PI nem manchado BrdU. (B) apenas manchada PI. (C) BrdU-FITC amostras. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="Figura S2" /> Figura ilustração. Esquemática S2 mostrando a relação entre espectro de emissão fluorescente de PI contra FITC (BrdU). As janelas de recolha espectrais para o canal fluorescente 1 (FL1, para FITC) e no canal fluorescente 3 (FL3, por PI) são mostrados em caixas correspondentes. Não há sobreposição de espectros fluoróforo entre FL1 e FL3 detecção. Evidentemente, a compensação de fluorescência não é necessário, quando os dados experimentais de PI e FITC-BrdU co-marcadas células são recolhidas nos canais FL1/FL3 respectivamente. Espectros de fluorescência foram obtidos a partir de BD site BioSciences:target = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Através da combinação de citometria de fluxo com incorporação de BrdU, temos as ferramentas necessárias para estudar a cinética do ciclo celular. A propriedade distintiva de BrdU para funcionar como um análogo da timidina é o que permite a quantificação de ADN conteúdo de uma célula de ciclismo. A incorporação de BrdU em uma fita crescente filha ADN durante a fase de síntese do ciclo celular é o que permite uma a seguir uma subpopulação de células de ciclismo através da replicação de ADN em fase S...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> bromodeoxiuridina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> iodeto de propídio </td><td> Sigma </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml estoque </td></tr><tr><td> FITC anti-BrdU </td><td> Becton Dickinson </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> tetraborato de sódio </td><td> Pescador </td><td> S80172 </td><td> 0,1 M, pH 8,5 </td></tr><tr><td> Caliber FACS </td><td> Becton Dickinson </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

O controle preciso do início e progressão subseqüente através das diversas fases do ciclo celular são de suma importância na proliferação das células. Divisão do ciclo celular é uma parte integrante do crescimento ea reprodução e desregulação de componentes de ciclo-chave de células têm sido implicados nos eventos precipitantes de 1,2 carcinogénese. Agentes moleculares em terapias anti-câncer freqüentemente alvo vias biológicas responsáveis ​​pela regulação e coordenação da divisão celular ciclo 3. Embora cinética do ciclo celular tendem a variar de acordo com o tipo de célula, a distribuição das células entre as quatro fases do ciclo celular é bastante consistentes dentro de uma linha de células particular devido ao padrão consistente de mitogénio e expressão do factor de crescimento. Eventos genotóxicos e outros estressores celulares pode resultar em um bloqueio temporário de progressão do ciclo celular, resultando em prisão ou uma pausa temporária em uma fase particular do ciclo celular para permitir a instituiçãogação de o mecanismo de resposta apropriada. A capacidade de experimentalmente observar o comportamento de uma população de células com referência à sua fase de progressão do ciclo celular é um avanço importante na biologia celular. Procedimentos comuns, tais como mitótico sacudir, centrifugação diferencial ou a triagem de citometria de fluxo com base são usadas para isolar células em fases específicas do ciclo celular 4-6. Estes fraccionado, do ciclo celular fase enriquecidas populações são então submetidas a tratamentos experimentais. Pureza, o rendimento ea viabilidade das fracções separadas podem muitas vezes ser comprometida usando estes métodos de separação física. Como assim, o lapso de tempo entre a separação das populações de células e do início do tratamento experimental, no qual as células fraccionadas pode progredir a partir da fase seleccionado do ciclo celular, pode representar desafios significativos na aplicação bem sucedida e interpretação destas experiências. Outras abordagens para stestágios do ciclo de UDy celulares incluem o uso de produtos químicos para sincronizar as células. O tratamento de células com inibidores químicos de chave processos metabólicos para cada fase do ciclo celular são úteis no bloqueio da progressão do ciclo celular para a fase seguinte. Por exemplo, os ribonucleótidos redutase células hidroxiureia suspende na conjuntura G1 / S através da limitação do fornecimento de desoxinucleótidos, os blocos de construção de DNA. Outros produtos químicos notáveis ​​incluem o tratamento com afidicolina, um inibidor da alfa-polimerase para detenção G1, o tratamento com colchicina e Nocodazole, ambos os quais interferem com a formação do fuso mitótico para suspender as células em fase M e finalmente, o tratamento com o DNA de cadeia terminador 5-fluorodeoxyridine para iniciar S prisão fase 7-9. O tratamento com estas substâncias químicas é um meio eficaz de sincronização uma população inteira de células a uma fase particular. Com a remoção do produto químico, as células se juntar o ciclo celular em uníssono. Tratamento da liberação seguinte teste agentea partir da química do ciclo celular de bloqueio assegura que a resposta à droga eliciada é de um uniforme, do ciclo celular população fase-específica. No entanto, uma vez que muitos dos sincronizadores químicos são conhecidos compostos genotóxicos, provocando além da participação das vias de resposta diferentes (aos sincronizadores contra os agentes de teste) é um desafio. Aqui nós descrevemos um método de marcação metabólica para seguir uma subpopulação de células ativamente de bicicleta através da sua progressão desde a fase de replicação do DNA, através da divisão e separação de suas células filhas. Juntamente com a quantificação de citometria de fluxo, este protocolo permite para a medição da progressão cinética do ciclo celular na ausência de qualquer mecanicamente ou quimicamente induzida celular salienta geralmente associado com outras células metodologias de ciclo de sincronização 10. Nas seções seguintes vamos discutir a metodologia, bem como algumas de suas aplicações em pesquisa biomédica.

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Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Controlando mudanças subtis na progressão e cinética de fases do ciclo celular pode ser conseguida pelo uso de uma combinação de marcação metabólica de ácidos nucleicos com BrdU e coloração do ADN genómico total de via iodeto de propídio. Este método evita a necessidade de sincronização química de células de bicicleta, impedindo assim que a introdução de não-específica danos no ADN, que por sua vez afecta a progressão do ciclo celular.

Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K visualizações.  University of British Columbia. Controlando mudanças subtis na progressão e cinética de fases do ciclo celular pode ser conseguida pelo uso de uma combinação de marcação metabólica de ácidos nucleicos com BrdU e coloração do ADN genómico total de via iodeto de propídio. Este método evita a necessidade de sincronização química de células de bicicleta, impedindo assim que a introdução de não-específica danos no ADN, que por sua vez afecta a progressão do ciclo celular.

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biologia

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

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Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Medindo intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensão de células

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Combinando optogenética com Citometria de Fluxo

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...