Agradecemos ao Dr. Michael R. Sramkoski ajuda com citometria de fluxo, Purnima Dr. Jaiswal e Di Dr. Wu para início de entrada e Aylyarov Ilya ajuda com as ilustrações. Suportado pelo NIH Grant R01GM089872 e Citometria &amp; Imaging Core Facility Microscopia do Caso Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

1. Crescimento Celular haplóide <ol><li> Crescer S. células de Saccharomyces do fundo S288C (BY4741) sob condições padrão 10. </li><li> Transformar haplóides para expressar qualquer uma das duas notáveis ​​marcadores fluorescentes 10. Os marcadores de escolha são GFP solúvel expressa no citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizado com BglII 11) e uma única proteína ribossomal, RPL25, fundido com mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, a partir de A. Johnston). Prevemos que os protocolos equivalentes de duas cores de purificação pode fazer uso de outras proteínas fluorescentes brilhantes que são sintetizadas pelas células haplóides paternos. Em alternativa, a parede celular pode ser rotulado com lectinas fluorescentes. </li><li> No dia anterior ao do zigoto purificação, inocular 5 ml de culturas de cada tipo de célula e crescê-los com agitação durante a noite a 23 ° C até atingir A600 não superior a 1,0. Crescer transformantes GFP (ATY4442) em meio sintético completo incluindo 2% de glicose (CSM-glucose) umnd RPL25-mCherry transformantes (ATY4552) em meio selectivo sintético sem uracilo 10. Manter culturas paralelas de cada tipo de célula com agitação, à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Realização de uma Cruz <ol><li> Ajustar a densidade óptica (A600) de cada amostra para 1,0 em meio fresco. [1 Unidade Densidade Óptica ~ 3 x 10 7 células / ml] </li><li> Mistura de volumes iguais de ambas as culturas, vortex brevemente três vezes, seguido por um tempo de vórtice durante 10 seg. </li><li> Prepare CSM glicose placas. As placas são idênticos aos utilizados para o crescimento de rotina e foram secas 45 minutos após o vazamento e a solidificação do agar 10. </li><li> Distribuir até vinte gotas de 40 ml da mistura a 1 centímetro a partir do bordo da superfície de CSM-glucose placas. Quando as gotas são inicialmente aplicada à superfície de iniciar o temporizador para medir o tempo decorrido. Uma vez que o líquido ter sido absorvido (cerca de 30 min), cobrir as placas e deixar intacta a rooTemperatura m. </li></ol> 3. Preparações de colheita <ol><li> Colheita de amostras após 1,75-2,5 hr a 23 ° C por lavagem repetidamente individuais gotículas secas ao lado da placa com 150 ml de glucose-CSM frio, mantendo-se as placas em gelo. Repetidamente lavar a área de gotículas 10-20 vezes com o mesmo meio para maximizar a recuperação. Recolher em tubos de 15 ml Falcon em gelo. </li><li> Sondar sonicar as amostras 10x em amplitude de 60% com um sonicador Fisher FB120 (120watt, 120Volt, Freq 20KHz) em gelo. </li><li> Verificar em um microscópio de fase que poucos ou nenhuns agregados permanecem. 15-50% das células espera-se que se formaram zigotos neste ponto. </li><li> Deixar o tubo de células numa posição vertical em repouso sobre gelo durante 10 minutos, como medida de precaução adicional (para permitir que os agregados se estabelecer). </li><li> Recuperar os 90% mais alto do volume e filtrá-la através de uma malha de nylon (BD Falcon tubo de polipropileno com filtro tampa (Ref. 352235)). Numa experiência típica, 10 7 célulasrecuperado a partir de uma placa foram neste ponto diluídos em 4 mL de CSM-glucose. </li></ol> 4. Citometria de Fluxo <ol><li> Ordenar células usando o Sony Reflexão ICYT citômetro de fluxo modelo, (altamente automatizado Ordenar Paralela) HAPS1 com uma ponta mícron 100. Para a excitação da GFP, use o azul argônio-ion, 250 miliwatts de laser a 488 nm. Para excitação mCherry, use o laser de 100 miliwatts a 561 nm. Apesar de não ter experiência com outras máquinas, esperamos que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx ou Beckman Coulter MoFlo XDP ficaria bem quando equipado com os lasers corretas. </li><li> Base de dados de parâmetros de classificação em um gráfico de dispersão para a frente contra volta, a fim de porta em células viáveis. Estabelecer um plano de emissão de 615 + / - 30 nm filtro passa-banda (mCherry) versus 525 + / - 25 nm filtro passa-banda (GFP) para dividir os eventos em quatro quadrantes, &quot;Red + Verde&quot;, &quot;Vermelho + Verde +&quot;, &quot;Red- Verde-&quot;e&quot; + Red-Green &quot;(Figura S2). Utilização de células não fluorescente como um padrão fou determinação do &quot;vermelho-verde&quot; quadrante. </li><li> Ordenar as células com uma pressão de 21,5 psi bainha, uma frequência de 43.400 gota gotas / seg, e uma pressão da amostra de 20,5 psi. </li><li> Ordenar inicial (&quot;modo de recuperação&quot;): Recolha de amostras em tubos refrigerados Eppendorf contendo 250 ml de frio CSM-glicose. Sedimento 10 seg a velocidade máxima numa microcentrífuga refrigerada (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) e aspirar a solução de fluxo (fluxo de solução de revestimento de citometria (PBS com EDTA 1 mM) Catalog No. BioSure 1027). Ressuspender em 500 ml frio CSM-glucose. </li><li> Ordenar segundo (&quot;Modo de Pureza&quot;): Conduzir a espécie como para a classificação inicial, usando a &quot;pureza&quot; modo opção. O sedimento. Purificada células e ressuspender as pastilhas em 500 ml e 1,0 ml de glucose-CSM Agitar durante 15 minutos em placas de 24 poços a 23 ° C para permitir a recuperação metabólica. </li></ol> 5. Microscopia DeltaVision <ol><li> Preparar almofadas de agarose, como se segue: Leve uma suspensão de agarose 1,5% (UltraPureAgarose, Invitrogen, Catalog # 15510-07) em CSM-glucose a ferver, de forma breve vórtice, e depois aplicar 0,3 ml de amostras da solução de agarose para a superfície de lâminas de vidro horizontais normais e cobri-los de uma só vez com uma segunda corrediça (sem a aplicação de pressão). </li><li> Depois de arrefecimento durante 10 minutos, remover suavemente a corrediça superior, deslizando-a na horizontal, tendo o cuidado de deixar uma superfície lisa e não perturbar a camada de agarose. (Quando a lâmina superior tenha sido removido, a amostra de células deve ser aplicado dentro de 1-2 min. Quando mantido numa câmara húmida à temperatura ambiente, sem a remoção da lâmina superior, as almofadas podem ser armazenados durante até um dia antes do uso.) </li><li> Amostras de sedimentos e depósitos alíquotas de 1 ml da pelota em almofadas de agarose (sem tocar na superfície). Cobrir imediatamente a amostra com um quadrado No. 1 lamela. Aparar agarose excesso com uma lâmina de barbear única gumes. Selar as preparações com vaselina dispensados ​​a partir de uma seringa. </li><li> Imagem usando Deltavision (Applied Precision) com um objetivo 100x óleo de imersão sem binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Deconvolve z pilhas usando o programa softWoRx 5.0.0 ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) e processar minimamente. Sucessivas z-aviões eram geralmente coletados em intervalos de 0,2-0,4 mícron. </li></ol> 6. Resultados representativos Os níveis de intensidade de fluorescência em células haplóides transformadas: O nível de fluorescência nas haplóides é ilustrado na Figura S1. Antes da inquirição, epifluorescência demonstrado que essencialmente todas as transformantes GFP estavam verdes, e que todas as transformantes mCherry, embora muitas vezes fraca, estavam vermelhos. Para assegurar que todas as células utilizadas para a cruz eram realmente fluorescente, foi utilizada a sub-população mais brilhantes com o sinal fluorescente. Rendimento: Aepois de a classificação inicial, a amostra verde vermelho + + (Figura S2) inclui tipicamente 8-20% do número de células de entrada e um número excessivo de células haplóides, talvez devido à adesão célula-célula persistente. Uma vez que o enriquecimento de alta não é conseguido com uma única espécie, a amostra parcialmente purificada deve ser duas vezes a sonda de ultra-sons 60% de amplitude seguido por re-ordenação. (Tipo de recuperação duram tipicamente entre 1-2 horas, enquanto que o segundo tipo requer apenas 15 min.) Das células submetidas ao segundo tipo, os vermelho + verde + amostras incluíram 23-52% das células de entrada. Exame microscópico fase: Exame por microscopia de contraste de fase revelou que a pureza da preparação final, zigoto em média cerca de 90% ao longo de 21 preparações (variando de 86% a 91%). Os contaminantes ou eram haplóides verde ou vermelha, ou pares de haplóides que estavam em contacto uns com os outros. Figura 3 tabula a percentagem de zigotos que têmnão broto, brotos medial (Med), brotos laterais (Lat) ou botões terminais (Term), o número de haplóides emparelhados da mesma cor (&quot;2Same&quot;) ou de cor diferente (&quot;2Hap&quot;), bem como individuais (haplóides Hap). Quando as células foram colhidas após 1,75 hr, mais do que 50% foram não gemuladas e as outras subcategorias (medial, com gemas laterais ou terminais) foram igualmente representados. Depois de 2,5 horas, havia aproximadamente números iguais de zigotos em cada uma das quatro categorias (não gemuladas, com medial, gomos laterais ou terminais). As observações microscópicas (Figura 4): A estrutura de zigotos parece permanecer inalterado durante a purificação. De acordo com a duração da cruz, a população tinha diferentes proporções de zigotos e não gemuladas enxertada, como explicado acima. Uma vez que ambos os haplóides verdes e vermelhos mostrou uma variação considerável na intensidade do sinal fluorescente, alguns zigotos foram predominantemente vermelha, enquanto os outros foram predominantemente verde, como é observado por Comparing as imagens de uma só cor para as imagens combinadas na Figura 4. Note-se também que a GFP (MW 26kDa) entra no núcleo e pode ser encontrado no núcleo, mesmo quando os núcleos não se fundiram. Vacúolos destacam-se como negros não fluorescentes esferas. O produto final de purificação produz uma população diversa em diferentes fases de desenvolvimento. Zigotos rotulado Uma fusão não tenham sofrido. Zigotos Tipo B são não gemuladas. Tipo C tem um pequeno broto. Tipo D têm uma maior broto, e zigotos Tipo E está prestes a passar por citocinese. Note-se também que muitos dos zigotos anteriores continuam a mostrar um não-fluorescente linha de divisão medial (*), e que a &quot;estrutura de herança&quot; vacuolar (I) 12 podem ser vistos a estender a partir do zigoto para a raiz. Em alguns casos, o sinal verde foi redistribuído para o parceiro de uma extensão muito maior do que o sinal vermelho. Isto reflecte o atraso de transferência, que é característica de polissomas (Tartakoff, em preparação). 6 zigotos, o que é suficiente para muitas imunotransferência, utilizando os procedimentos de detecção quimioluminescente. Usando protocolos de fenol-clorofórmio isolamento extraímos cerca de 1,5 mg de RNA a partir deste número de células. Uma vez que os zigotos purificadas ter sido refrigerada, antes de análise adicional é recomendável a incubação a 23 ° C em meio de crescimento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figura 1. Cronologia da formação do zigoto. Zigotos como um intermediário entre haplóides e diplóides. Este diagrama mostra a activação clássica (shmooing) de haplóides, a sua fusão e a formação da gema inicial. Gemas podem ser tanto medial (M), lateral (L) ou do terminal (T). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg /&quot; /&gt; Figura 2. Esquemática do protocolo de purificação do zigoto. Após a incubação sobre a superfície de placas de agar, em meio completo com glucose, a mistura de células foi recuperado por lavagem e, em seguida, submetido a uma classificação inicial no &quot;modo de recuperação&quot;, seguido de um segundo tipo em &quot;modo de pureza. &quot; A cor amarela indica que tanto mCherry e sinais de GFP foram visíveis nos zigotos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figura 3. Variedades de zigotos nas misturas de acasalamento purificadas frações. Foram colhidas após 1,75 ou 2,5 horas para recuperar frações enriquecidas em zigotos relativamente precoces vs relativamente mais maduro. Oito experimentos independentes, designados pelas cores distintas, foram realizadas para cada ponto de tempo. Os gráficos indicam os números relativos de zigotos que have espacialmente padrões distintos de formação de gemas. Dada a curta duração da incubação (menos de 2,5 h à temperatura ambiente) os botões são observados eventos iniciais zigóticos de brotamento. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figura 4. DeltaVision exame das fracções enriquecidas. Um campo típico foi examinada por microscopia Deltavision. As ilustrações mostram ou cores vermelhas e verde ou único. O vermelho corresponde à etiqueta polissomal (Rpl25p-mCherry) e o verde para GFP citosólica. Note-se a elevada enriquecimento de zigotos, e as características designadas subcelulares: os vacúolos (v), de botões (b), o núcleo (n), vacuolar &quot;estrutura de herança&quot; (i), e a divisória (*) que aparece para separar o parental domínios em zigotos relativamente cedo. A sua cor variável global reflecte a intensidade relativa dos haplóides que se fundiram. Nos casos em que os dois domínios retêm parentaisuma cor distinta, o equilíbrio dos marcadores (GFP citoplasmática, mCherry marcadas polissomas) estava incompleta. Time-lapse estudos em curso mostram que redistribui GFP solúveis antes polissomos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . Legends suplementares <img alt="Figura S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> S1 figura. Fluorescência de células haplóides Extrema esquerda:. Células expressando polissomas mCherry-marcadas foram examinadas para detectar um sinal verde. A janela rectangular foi ajustado para evitar que as células negativas. Gráfico Médio: Células expressando GFP citosólica foram analisados, mostrando a população distintamente brilhante importante de aspectos positivos. Extrema direita: Células expressando polissomos mCherry-marcadas foram analisadas. O rectângulo (idêntico ao do extremo esquerdo) inclui as células brilhantes e permite que todosnegativos devem ser evitados. A designação &quot;R2&quot; indica a percentagem de células recuperadas no interior do rectângulo indicado. <img alt="Figura S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figura S2. Distribuição das células na primeira e segunda classificação. Estes gráficos de duas cores indicam a proporção de verde + vermelho + células no quadrante superior direito (R5). Essa proporção aumenta para 52% no segundo tipo. Eixo horizontal: sinal verde. Eixo vertical: sinal vermelho.

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	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A disponibilidade de zigotos purificadas deve facilitar estudos bioquímicos incluindo transcriptômica, proteômica e lipidómica, bem como de investigação de mecanismos pelos quais se submetem zigotos ciclo celular re-entrada, remodelamento da parede celular, características de brotamento e de herança, etc Alternativamente, os zigotos podem ser gerados a partir com estirpes de portadores de mutações características em um ou ambos os pais. Além disso, os zigotos purificados, assim como para células haplóides ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / Equipamento </td><td> Fonte </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codificando GFP citoplasmática 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, codificação RPL25 fundido a mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher sonicador FB120 </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de polipropileno com filtro tampa </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrífuga refrigerada </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Fluxo da solução bainha citometria </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Reflexão ICYT citômetro de fluxo modelo </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision microscópio deconvolução </td><td> P aplicadorecision </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de epifluorescência ereta </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> Formulação de glucose CSM Notas: Para placas de agar, simplesmente incluir 2% de agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zigotos são intermediários essenciais entre haplóides e diplóides estados do ciclo de vida de muitos organismos, incluindo levedura (Figura 1) 1. S. cerevisiae zigotos resultado a partir da fusão de células haplóides de tipo de acasalamento diferente (MATa, MATalpha) e dar origem aos correspondentes diplóides estáveis ​​que geram sucessivamente até 20 descendentes diplóides, como resultado das suas divisões mitóticas notavelmente assimétricas 2. Formação do zigoto é orquestrado por uma sequência complexa de eventos: Neste processo, os factores de acasalamento solúveis se ligam a receptores de cognato, desencadeando mediados por receptores cascatas de sinalização que facilitam a interrupção do ciclo celular e culmina na fusão célula-célula. Zigotos podem ser considerados um modelo para progenitor ou a função das células estaminais. Embora muito se aprendeu sobre a formação de zigotos e, apesar de zigotos foram utilizados para investigar células-moleculares questões de interesse geral significance, quase todos os estudos fizeram uso de misturas de acasalamento em que os zigotos estão misturadas com uma população de maioria de células haplóides 3-8. Muitos aspectos da bioquímica da formação do zigoto ea vida continua do zigoto, portanto, permanecem sem investigação. Relatos de purificação de zigotos levedura descrevem protocolos baseados nas suas propriedades de sedimentação 9, no entanto, este procedimento de sedimentação baseada não produziram cerca de 90% de pureza em nossas mãos. Além disso, ele tem a desvantagem de que as células são expostas ao sorbitol hipertónica. Por conseguinte, desenvolveram um processo de purificação versátil. Para este propósito, os pares de células haplóides que expressam proteínas de vermelho ou verde fluorescentes foram co-incubadas para permitir a formação do zigoto, colhidas a vários tempos e os zigotos resultantes foram purificadas utilizando um protocolo de triagem de citometria de fluxo com base. Esta técnica fornece uma avaliação visual conveniente de pureza e de maturação. A pureza médiada fracção é de cerca de 90%. De acordo com o tempo de colheita, os zigotos de diferentes graus de maturidade podem ser recuperados. As amostras purificadas fornecer um conveniente ponto de partida para &quot;-OMIC&quot; estudos, para a recuperação da progênie inicial, e para a investigação sistemática desta célula progenitora.

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Para purificar de zigotos<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Células haplóides do tipo de acasalamento oposto foram projetados para expressar vermelho ou verde proteínas fluorescentes, co-incubados, para permitir a formação do zigoto, e fracionado em um fluxo de protocolo de citometria de base. A fração altamente enriquecido permite posterior &quot;-mico&quot; estudos de recuperação, de progênie inicial, e investigação sistemática da morfogênese zigoto.

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

flow-cytometry-based-purification-of-s-cerevisiae-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

12.7K visualizações.  Case Western Reserve University School of Medicine. Para purificar de zigotos S. cerevisiae, Células haplóides do tipo de acasalamento oposto foram projetados para expressar vermelho ou verde proteínas fluorescentes, co-incubados, para permitir a formação do zigoto, e fracionado em um fluxo de protocolo de citometria de base. A fração altamente enriquecido permite posterior "-mico" estudos de recuperação, de progênie inicial, e investigação sistemática da morfogênese zigoto.

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Ensaio para a Adesão e Invasão Agar em S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biologia

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Estudando Idade-dependente Instabilidade Genômica usando o S. cerevisiae Modelo Lifespan cronológica

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;