Agradecemos ao Dr. Randy Chitwood pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Whitehall e Alfred P. Sloan Foundation subsídios para HJK.

1. Configuração óptica (Figura 1) <ol><li> Por dois fótons de excitação de um sistema de laser infravermelho pulsado com pulsos de femtossegundos é usado. Um laser de alta potência de saída (em alguns casos&gt; 2W em 890 nm de comprimento de onda) é necessária para compensar as perdas de grandes introduzidos pelos componentes ópticos do sistema. </li><li> Um sistema prechirper consistindo de dois prismas transmite uma dispersão da velocidade de grupo negativo (GVD) sobre os pulsos de laser antes de os deflectores acústico-ópticos (EOA), para compensar a dispersão temporal introduzido pelo EOA 1. </li><li> Dois EOA com aberturas grandes (de 10 mm para um objectivo de 40x de imersão em água com NA 0,8) desviar o feixe de laser em duas dimensões. </li><li> A grade de difração reflexivo com 100 bosques / mm é colocado 13 centímetros atrás dos EOA para compensar a dispersão espacial introduzida pela EOA ao usar pulsos de laser. </li><li> O feixe de laser é dirigido com dois telescópios de retransmissão para a porta da câmara de uma posição vertical microscopiape. </li><li> Íris são colocadas a intervalos regulares, para o alinhamento dos componentes ópticos. </li><li> Um divisor de feixe dicróico em frente da objectiva transmite a luz de excitação para a amostra de infravermelhos e reflecte a luz de fluorescência da amostra a um detector. </li><li> Detectores de Epi e transfluorescence (fotomultiplicadores, PMT) coletar sinal de fluorescência através da objetiva e - se for o caso - através do condensador. </li><li> Filtros de vidro de cor (BG-39, 3-5 mm) são colocados em frente dos detectores para evitar que a luz de excitação atingir os detectores. </li><li> Os ângulos de deflexão AOD são controlados por um computador equipado com uma placa de digital-analógico conversor (156,25 kHz taxa de relógio), o qual por sua vez conduz a tensão osciladores controlados. </li><li> O sinal dos fotomultiplicadores é retransmitido através de um filtro passa-Butterworth filtro (frequência de corte de 100 kHz) e digitalizado por um conversor analógico-digital do conversor (156,25 clock kHz), antes de ser armazenado emum computador para análise. </li><li> Alinhamento e ruído eléctrico são testadas através da gravação da distribuição de sinais de fluorescência com, e sem luz laser, com um ganho baixo e elevado dos fotomultiplicadores, bem como com e sem indicador. O scanner está correctamente configurar e blindado quando a largura da distribuição dos sinais de fluorescência de alto ganho e de indicador é muito maior do que as larguras das outras distribuições de sinais de fluorescência (Fig. 2). </li></ol> 2. Procedimentos experimentais <ol><li> Digitalização de acesso aleatório Rasterizado depende de detecção de aumentos intracelulares em cálcio. Um grande número de neurónios podem ser coradas utilizando injecção de bolus de éster sob a forma de um indicador de cálcio (por exemplo, verde Oregon 488 BAPTA-1 AM) no tecido neural 5. </li><li> Vários locais de cada neurônio soma são registrados, cada um para um curto período de tempo (&quot;dithering&quot;, 4 locais, 6,4 mS para cada local = 25,6 mS de tempo de gravação para each neurónios em cada ciclo, Fig. 3C). Para seleccionar os neurónios de interesse de um quadro completo que consiste em 256x256 pixels é adquirida (Fig. 3A). O centro de cada neurónio soma a ser gravada é seleccionada manualmente dentro desta imagem. O software de controle adiciona automaticamente três pontos em 2 mM distância em torno deste centro. </li><li> Em cada ciclo, o sinal de fluorescência é registada a partir de cada um dos 40 neurónios (Fig. 3B). Este processo é repetido durante todo o período de uma gravação (5 de gravação segundo = 3255 ciclos, 1 ciclo = 1,536 ms). </li></ol> 3. On-line ferramentas de software para maximizar a eficiência de detecção pico <ol><li> Detecção de pico de sinais de fluorescência de cálcio somáticas depende de uma alta relação sinal-ruído (S / N) do sinal de fluorescência do cálcio somáticas. Um elevado S / N pode ser conseguido através do aumento da intensidade de excitação. Intensidade de excitação, no entanto, só pode ser aumentada até um certo limite, por causa de fotodanos. Detecção espiga é elevada dentro de uma muito pequena window de intensidades de excitação único, onde os sinais de fluorescência têm uma elevada S / N, mas apenas muito pouco fotodano é observado 3. A fim de assegurar que os sinais são gravados dentro da janela de detecção pico elevado durante gravações monitoramos taxa de fotões (ver equação 3.2) e declínio da linha de base de fluorescência utilizando a análise em linha. </li><li> Taxa de fótons aproximado por neurônio é calculado a partir de uma janela de tempo curto (100-200 ms) de ruído de linha de base. Número de fótons (N λ) e taxa de fotões (λ λ = N / At) é calculado a partir dos valores de fluorescência através do ajuste da distribuição (σ) de alterações de fluorescência em relação com a seguinte equação: </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4052/4052eq1.jpg" /> Esta equação representa a distribuição de Poisson para o ruído tiro fóton com uma mudança de variável para a mudança de fluorescência relativa: Af / F = (G * N λ (t)-G * N &amp; lambda;, 0) / G * N λ, 0 em que G representa o ganho acumulado de fotomultiplicador e todos os outros componentes electrónicos. Note-se que esta equação não determinar correctamente o número de fotões detectados para gravações em in vivo porque existem outras fontes de ruído (artefactos de movimento), além de ruído de disparo de fotões. No entanto, esta equação é útil para em gravações in vivo para estimar o ruído. <ol start="3"><li> Linha de base de fluorescência é calculada a partir da janela ao mesmo tempo e representada graficamente como uma função do tempo, ou ensaios. A redução média da linha de base é mantida abaixo de 0,0002 / s, ajustando a força do laser, pois a detecção pico rapidamente diminui quando superior a este limite. </li><li> Cada 10-20 minutos as posições somata neurônios são verificados por novamente a aquisição de uma imagem full frame. Se necessário, os locais de gravação são ajustados. Localizações pode ser ajustado por todos os neurónios de uma só vez, ou de neurónios individuais. </li></ol> 4. Reconstruction de horários espiga de sinais de fluorescência (deconvolução) <ol><li> Os sinais de fluorescência resultantes da actividade neural frequentemente somam no tempo por causa da deterioração dos transientes de cálcio é longo (várias centenas de milisegundos). Um método de deconvolução reconstrói horários espiga e espiga de sinais de fluorescência. </li><li> Para determinar o mais provável trem espiga subjacente ao sinal de fluorescência registada, modelos diferentes são comparados. Aqui nós usamos um algoritmo genético para determinar o modelo - e, assim, o trem espiga e horários Spike - com a máxima verossimilhança. </li><li> Em populações heterogêneas de neurônios, o ponto-evocado sinal de cálcio pode variar entre os neurônios. Para a análise de conjuntos de dados sem supervisão nós projetamos um algoritmo que leva em conta a variação do sinal de cálcio pico evocadas a partir de neurônio para neurônio. </li><li> Para evitar um grande número de detecções de falsos positivos é útil para constringir a amplitude permitida e tempo de decaimento constante da modelo do sinal de cálcio ponto-evocado. A distribuição conjunta do tempo e amplitude constante de decaimento de uma única espiga transientes de cálcio evocadas são registadas numa série separada de experiências a partir do mesmo tipo de neurónios nas mesmas condições experimentais, utilizando gravações simultâneas electrofisiológicos e óptica. </li><li> Para ter em conta as alterações de linha de base lentos e para reduzir os custos computacionais do deconvolving, gravações mais longas são divididos em vários traços curtos de 1-5 segundos. </li><li> Para cada neurónio e cada gravação, o algoritmo de desconvolução pode testar um grande número de modelos (até 1.000.000 modelos diferentes ou mais). Para acelerar deconvolução, um experimento é deconvolved em até 10 computadores diferentes em paralelo. </li><li> Depois de desconvolução, o espigão de dados é analisado e inspeccionado. Um histograma tempo peri-estímulo, a probabilidade de espiga, e taxa de disparo (pico médio por neurónios) são calculadas de uma forma automatizada. </li></ol> 5.Resultados representativos Sucesso espiga dobradiças de detecção de uma relação sinal-para-ruído elevado de fluorescência registados os sinais de cálcio somáticas. Simplesmente usando taxas de excitação elevados (laser de alta potência) pode resultar em um impacto adverso de photoeffects em material biológico (fotoenvelhecimento). Em photodamage digitalização pontilhada de acesso aleatório se manifesta como uma diminuição de fluorescência basal e diminui os sinais de cálcio ponto-evocados fluorescência. A diminuição do sinal pico-evoked pode rapidamente resultar em falha para detectar picos. Existe apenas uma pequena janela de intensidade de excitação em que a detecção de pico de sinais de fluorescência é elevada. Na extremidade superior desta janela é limitada por fotodano, na extremidade inferior dos sinais de fluorescência têm uma relação sinal-para-ruído baixo. Para neurônios corticais em fatias agudas usamos potência do laser, resultando em taxas de fótons de cerca de 400,000-1,500,000 fótons / s ao gravar em cerca de 100 fim abaixo da superfície da fatia. Quando se utiliza um elevadoAfinidade indicador - aqui Oregon Verde 488 BAPTA - 1 - este sinal é suficiente para detectar picos individuais. Fig. 3E mostra um exemplo de um sinal de fluorescência registada a taxa de excitação muito baixo, um exemplo de uma gravação de detecção dentro da janela, e uma a uma taxa muito elevada de excitação. Comparado com outras técnicas para gravar a atividade neural com a resolução de uma única célula e único ponto, pontilhado de acesso aleatório verificação pode gravar a partir de um número maior de neurônios da população, mesmo local, e é menos invasiva, por exemplo, em comparação com tetrode / multielectrode gravações . Assim, pontilhada de digitalização de acesso aleatório pode ser usada para gravar a atividade neural de muitos neurônios para medir a informação mútua sinalizado por supraliminares atividade 6 (Fig. 4A), as mudanças de atividade neural em uma população de neurônios (plasticidade cortical) e propagação da atividade supraliminares através de populações de neurónios 14 (Fig. 4B) <img<html> alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg /&quot; /&gt; Figura 1. Desenho óptico da configuração de digitalização-pontilhada de acesso aleatório. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig2.jpg" /> Figura 2 alinhamento e testes:. Distribuição de sinais de fluorescência gravados em diferentes condições. A) Sem luz laser e ganho fotomultiplicador baixo, B) Na maior ganho de PMT, mas nenhuma luz laser, a distribuição é maior, devido à corrente escura fotomultiplicador. C) Com o laser e gravado no ganho PMT alta. A diferença entre as distribuições mostradas em B e esta distribuição poderia indicar que a luz de excitação atinge os detectores PMT. D) A distribuição de sinais de fluorescência gravado em alto ganho de neurônio somata. Se nenhuma fonte de ruído outros contributos, esta distribuição surge de fóton tiro ruído apenas. . Jpg &quot;/&gt; Figura 3 A) imagem de quadros total de fluorescência para detectar e seleccionar posições somata neuronais, B) Verificação de percurso de um ciclo, C) Ilustração do princípio pontilhado,. Em cada (círculo) soma vários locais são registadas antes de mover o feixe para o próximo soma, D) Ilustração da saída do D two / A canais. Para cada soma neuronal, o sinal de fluorescência é registada a partir de quatro pontos diferentes em cada soma (S1-S4). A localização de cada ponto é dado por suas posições x e y. A x e y para todas as posições de pontos e todos os neurónios são enviados para o conversor digital-para-analógico de uma forma sequencial. Enquanto que o feixe se move entre dois somata neurónio, nenhum sinal é adquirido (em branco). E) Os exemplos de sinais de fluorescência. Note-se que cada um dos exemplos mostra a resposta a um espigão (como medido com gravação de células-inscritos electrofisiológico). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig4.jpg" /> Figura 4. Estudar cortifunção de cal usando varredura de acesso aleatório pontilhada. A) Medir a informação mútua sinalizado por populações de neurónios. Imagem superior mostra microfotografia de uma fatia cerebral aguda e duas pipetas de estimulação colocados na mesma coluna cortical na camada 4 (L4). Centro gráficos mostram respostas neurais para cada repetição de um estímulo. Gráfico inferior mostra informações mútua de Shannon sinalizado pela população registrada de neurônios. B) a propagação de medição da atividade supraliminares spiking (propagação do sinal) entre populações de neurônios corticais. Gráfico superior ilustra design experimental, imagem central mostra imagem de fluorescência, as linhas tracejadas indicam fronteiras barril, menor gráfico mostra picos detectados em resposta à estimulação elétrica de fibras talamocorticais (triângulos).

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	<li>Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+functional+imaging+of+single+neurons+using+random-access+multiphoton+(RAMP)+microscopy.">Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy.</a> J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73 (1990).</li><li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+neuronal+spiking+activity+from+unbiased+populations+of+neurons+with+high+spike+detection+efficiency+and+high+temporal+precision.">Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision.</a> J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li><li>Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cortical+plasticity+on+information+signaled+by+populations+of+neurons+in+the+cerebral+cortex.">Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex.</a> J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).</li><li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo.">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li><li>Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+relationships+between+spiking+and+[Ca2+]i+in+neurons+of+the+Xenopus+tadpole+olfactory+bulb.">Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb.</a> J. Physiol. 582, 163-175 (2007).</li><li>Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. 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Methods. 3, 377-383 (2006).</li><li>Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+decrease+with+propagation+of+spiking+activity+in+the+mouse+barrel+cortex.">Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex.</a> Front Neural Circuits. 5, 8 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Digitalização de acesso aleatório Rasterizado indiretamente detecta atividade supraliminares spiking dos aumentos do cálcio intracelular somática associada a cada ponto em um somata neurônio. Os aumentos na concentração de cálcio intracelular são detectados por corantes fluorescentes de cálcio. As limitações da digitalização de acesso aleatório pontilhada surgem em grande parte a partir da relação de sinal-para-ruído limitado de sinais de fluorescência de cálcio. A razão sinal-para-ruído é, por s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Os componentes ópticos são listados em ordem, a partir do laser </td></tr><tr><td> Titã: Safira Laser </td><td> Coerente Inc. </td><td> Chameleon Ultra 2 </td><td> Alta potência de saída recomendada (&gt; 2W a 900 nm) </td></tr><tr><td> Lente acromática f = 30 mm </td><td> Thor laboratórios </td><td> AC254-030-B </td><td> Revestimento anti-reflexo (AR) para 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromática f = 100 mm </td><td> Thor laboratórios </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente F = 75 mm </td><td> Thor laboratórios </td><td> LA1608-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente F = 175 milímetros</td><td> Thor laboratórios </td><td> LA1229-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromática f = 300 mm </td><td> Thor laboratórios </td><td> AC254-300-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromática f = 100 mm </td><td> Thor laboratórios </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromática f = 100 mm </td><td> Thor laboratórios </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Acústico-ópticos defletores </td><td> Intraaction Corp </td><td> ATD 6510CD2 </td><td></td></tr><tr><td> Grade de difração reflexivo </td><td> Newport </td><td> 53-011R </td><td> 100 ranhuras / mm para EOA com 65 MHz de largura de banda e ângulo de leitura de 45 mrad </td></tr><tr><td> 21,6 milímetros Brewster prismas </td><td> Lambda de Pesquisa Óptica Inc. </td><td> IBP21.6SF10 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro colorido </td><td> Schott </td&gt; <td> BG-39 </td><td></td></tr><tr><td> Espelho dicróico </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> Z532RDC </td><td></td></tr><tr><td> Módulos fotomultiplicadores </td><td> Hamamatsu </td><td> H9305-03 </td><td></td></tr><tr><td> DAC-ADC bordo </td><td> National Instruments </td><td> PCI-6115 </td><td></td></tr><tr><td> Verde Oregon 488 BAPTA-1 AM </td><td> Invitrogen </td><td> O-6807 </td><td></td></tr></tbody></table>

optical recording of suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution

Sinalização de informação no sistema central nervoso dos vertebrados é frequentemente realizado por populações de neurónios, em vez de neurónios individuais. Também propagação da atividade spiking supraliminares envolve populações de neurônios. Estudos empíricos que abordam função cortical diretamente, portanto, exigem gravações de populações de neurônios com alta resolução. Aqui nós descrevemos um método óptico e um algoritmo de deconvolução para gravar a atividade neural de até 100 neurônios com resolução de uma única célula e um único ponto. Este método baseia-se na detecção de aumentos transientes na concentração de cálcio intracelular associada com picos somática supraliminares eléctricos (potenciais de acção) em neurónios corticais. Alta resolução temporal das gravações ópticas é conseguido através de um método rápido de acesso aleatório utilizando acústico-ópticos deflectores (EOA) 1. Dois fotões de excitação dos resultados de cálcio sensíveis corante em alta resolução espacial em tis cerebrais opacosprocessar 2. Reconstrução de picos de fluorescência das gravações de cálcio é conseguida por um método de máxima verosimilhança. Simultâneas gravações electrofisiológicos e óptica indicam que o nosso método fiável detecta pontos (&gt; 97% de eficiência de detecção de pico), tem uma baixa taxa de falso positivo de detecção de pico (&lt;0,003 espigas / s), e um de alta precisão temporal (cerca de 3 ms) 3. Este método de detecção óptica pico pode ser utilizado para registar a actividade neural in vitro e em animais anestesiados in vivo 3,4.

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

A compreensão da função do sistema nervoso central, dos vertebrados requer gravações de muitos neurónios porque a função cortical surge no nível de populações de neurónios. Aqui nós descrevemos um método óptico para registrar a atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único ponto, pontilhado de acesso aleatório de digitalização. Este método registra somáticas fluorescência sinais de cálcio de até 100 neurônios com alta resolução temporal. Um algoritmo de máxima verosimilhança deconvolves a actividade neural subjacente supraliminares a partir dos sinais de cálcio somáticas de fluorescência. Este método fiável detecta picos com elevada eficiência de detecção e uma baixa taxa de falsos positivos e pode ser usado para estudar as populações neuronais<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt;.

A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

optical-recording-suprathreshold-neural-activity-with-single-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K visualizações.  The University of Texas at Austin. A compreensão da função do sistema nervoso central, dos vertebrados requer gravações de muitos neurónios porque a função cortical surge no nível de populações de neurónios. Aqui nós descrevemos um método óptico para registrar a atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único ponto, pontilhado de acesso aleatório de digitalização. Este método registra somáticas fluorescência sinais de cálcio de até 100 neurônios com...

Vídeo: Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

Implante cirúrgico de crônicas Eletrodos Neurais para registrar a atividade única Unidade e Sinais eletrocorticográfica

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Neurociência

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbação da atividade neural com Iluminação Laser no Semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Neural Activity Propagação em uma Unfolded Hippocampal Preparação com um penetrante Micro-eletrodo Matriz

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

Fabricação de alta Contact densidade, eletrodos nervosas Plano de Interface para gravação e estimulação Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analisando a atividade Neural e conectividade usando dados de EEG intracraniano com SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Gravação ótica do único-fóton do largo-campo em fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...