Questo lavoro è stato finanziato con fondi della Fondazione canadese per l&#39;innovazione, Genome Canada, l&#39;Ontario Genomics Institute, il Ministero della Innovazione, e il Canadian Institutes of Health Research sovvenzione JG e AE The Red-esprime E. coli ceppo DY330 è stato un gentile dono da Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).

1. Costruzione di Gene-specifica SPA-tagging in E. coli DY330 Strain <ol><li> Il plasmide che comprende il pJL148 SPA-tag sequenza di DNA e l&#39;antibiotico kanamicina cassetta marcatore di resistenza (Kan R) sono usati come stampo nella reazione a catena della polimerasi (PCR) 7. A 45 nt gene-specifico primer forward, situata immediatamente a monte del codone di stop gene bersaglio in frame con un bp 27 (&#39;5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) innesco tag specifica avanti, e un 45 nt gene-specifico primer reverse, situata immediatamente a valle del codone di stop gene bersaglio in frame con un 27 bp (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;) primer reverse tag specifica, sono utilizzati per amplificare la SPA-tag e Kan cassette R dalla pJL148 utilizzando le seguenti condizioni di ciclo di PCR: 94 ° C per 5 min, 30 cicli di 94 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 min, 68 ° C per 2 min 10 sec, seguito da 68 ° C per 10 min. Queste sequenze amplificate servire uns substrati per la ectopicamente introdotto λ-Red macchine ricombinazione omologa (vedi sotto). </li><li> Il prodotto PCR viene purificato usando un kit di purificazione Qiaquick PCR per rimuovere i sali che possono interferire con l&#39;elettroporazione. Il prodotto di PCR purificato viene successivamente destinato ad integrare alla estremità 3 &#39;(immediatamente a monte del codone di stop nativo) di un gene specifico in DY330 ceppo in cui viene espresso il Red-λ macchine ricombinazione 10. </li><li> Il DY330 λ-Red ceppo che esprime è cresciuto durante la notte in 2 ml di Luria-Bertani (LB) medio a 32 ° C agitando a 180 giri al minuto. 1 ml della coltura overnight viene successivamente inoculato in 70 ml di terreno LB fresco in beuta da 500 ml. L&#39;inoculo è cresciuto a 32 ° C agitando a 180 rpm fino OD 600 raggiunge ~ 0,8. </li><li> La coltura viene trasferito in una nuova beuta da 250 ml, in cui le cellule sono indotte incubando il pallone in un bagno di acqua a 42 ° C agitando delicatamente a180 rpm per 15 min. Immediatamente dopo l&#39;induzione, il pallone viene incubato in un bagno di ghiaccio slurry acqua per almeno 30 minuti con agitazione. </li><li> La gelida coltura viene immediatamente trasferito in pre-raffreddata tubo da 50 ml in polipropilene e sottoposta a centrifugazione a 3993 xg per 6 minuti a 4 ° C. Il pellet viene risospeso in 50 ml di acqua ghiacciata sterile e centrifugato di nuovo a 3993 xg per 6 minuti a 4 ° C. Il pellet viene risospeso in 1 ml di acqua fredda e trasferito in una provetta 1,5 ml Effendorf, e centrifugato a velocità massima per 20 sec a 4 ° C. Dopo due o tre fasi di lavaggio con acqua gelata, il pellet viene risospeso in 700 finalmente pl di acqua ghiacciata sterile, con conseguente elettro-cellule competenti. </li><li> Tramite elettroporazione, uno microlitri dell&#39;amplicone purificato viene introdotto in 40 ml di elettro-cellule competenti. Le cellule sono elettroporazione in un Bio-Rad GenePulser II con le seguenti impostazioni: 2,5 kV, 25 uF con polsocontrollore di 200 Ω. Dopo ricombinazione omologa e integrazione, i trasformanti che ricombinano con successo il tag / cassetta nel cromosoma sono selezionati in base alla resistenza a Kan (Figura 1A). Trasformanti più sono selezionati per Western blotting per verificare la corretta generazione (cioè segnale positivo) di SPA-tagged proteine ​​di fusione con anticorpo anti-FLAG M2 che è selettiva contro gli epitopi di bandiera della SPA-tag. </li><li> Confermato carbossi terminale SPA-tag ceppo di fusione viene coltivato su larga scala per isolare complessi proteici solubili da cellule raccolte utilizzando il protocollo di purificazione SPA. Lo schema delle fasi coinvolte nella procedura di purificazione di affinità tag è mostrato in Figura 1B. </li></ol> 2. Coltura e sonicazione <ol><li> Inoculare 100 pl di una SPA-tag E. glicerolo magazzino coli in 50 ml di brodo di eccezionale (TB) liquido integrato con 50 microlitri di 25 mcg / ml of soluzione Kan in una beuta da 250 ml. Far crescere la coltura durante la notte a 32 ° C. Nota: Poiché la temperatura-inducibile cassette λ Red in ceppo DY330 è sotto il controllo di un sensibile alla temperatura 10 repressore, il SPA-etichettato ceppo di E. coli è cresciuto a 32 ° C. </li><li> Trasferire 10 ml della coltura durante la notte in 990 ml TB fresco supplementato con 25 ug / ml di Kan in un pallone 4 litro. La cultura è cresciuta a 32 ° C con agitazione costante a 250 rpm, da 5 a 6 ore, fino a quando la OD 600 raggiunge ~ 2 a 3. </li><li> Trasferire 1 litro E. coli SPA-tag cultura per pulire le bottiglie di centrifugazione e far girare le cellule a 4 ° C in Beckman J6-HC centrifuga @ 3993 xg per 15 min. </li><li> Il supernatante viene rimosso dalle bottiglie di centrifugazione. Risospendere la E. Pellet cellulari coli con 25 ml di tampone di sonicazione. Assicurarsi di mantenere le bottiglie centrifugazione su ghiaccio in ogni momento. </li><li> Il pellet risospeso ètrasferito a tubo da 50 ml in polipropilene Falcon e congelato in azoto liquido. Le cellule vengono congelate a -80 ° C per uso a lungo termine. </li><li> Prima di sonicazione, le cellule congelate scongelare completamente mantenendo i pellets in ghiaccio. I campioni scongelati vengono trasferiti a una tazza sterile acciaio inox posto sul ghiaccio per sonicazione. La sonda è immersa nel campione e sonicata per 3 min. Un ulteriore 2 min si lascia raffreddare il campione dal surriscaldamento. </li><li> Il lisato cellulare viene sonicato trasferita nel pre-raffreddata tubo di centrifugazione sterile, e sottoposta a centrifugazione a 4 ° C in una centrifuga Beckman con rotore JA-17 @ 35.267 xg (16.000 rpm) per 15 min per due volte. Nota: Nel caso della purificazione di proteine ​​di membrana, il lisato cellulare viene centrifugata sonicato solo una volta per 15 minuti perché non sapere in quale frazione delle proteine ​​di membrana sono, cioè, sia in pellet o nel surnatante. Quindi, per evitare la perdita di eccesso di memproteine ​​brane, ruotiamo le cellule per 15 min a centrifugazione ad alta velocità e il supernatante viene successivamente elaborato per la purificazione (vedere i passi sotto) dove 1% detersivo viene utilizzato per solubilizzare le proteine ​​di membrana. </li><li> Il supernatante dal tubo di centrifugazione viene accuratamente trasferita ad una provetta di polipropilene da 50 ml Falcon e congelati in azoto liquido. L&#39;estratto sonicato cella congelato viene immagazzinato per un periodo massimo di 6 mesi a -80 ° C per utilizzo futuro. </li></ol> 3. Affinity Purification <ol><li> Prima dell&#39;uso, 100 pl di perline M2 anti-FLAG sono lavati da 10 volumi di AFC tampone (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% di detergente, e 0,1-0,5 mM TCEP [tris (2-carbossietil) fosfina - acido cloridrico]) senza il detersivo e l&#39;agente riducente TCEP (tris (2-carbossietil) fosfina). </li><li> Il congelato, estratto cellulare viene sonicato scongelato ponendo la provetta in acqua fredda. L&#39;estratto cellulare scongelato è incubato con 3 ml di benzonase nucleasi per 30 min a 4 ° C. A questa miscela, aggiungere detergente non ionico Triton X-100 (concentrazione finale del detersivo dovrebbe essere 0,1%) e 200 microlitri di sospensione anti-FLAG M2 perle agarosio. Nota: Per tutte le purificazioni di proteine ​​solubili, 0,1% Triton X-100 viene usato per minimizzare adsorbimento non specifico, dove, come per purificare una proteina di membrana, diversi lievi detergenti non ionici, come C12E8 (Octaethylene dodecil etere glicole), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltoside) e maltosio-neopentil glicole (MNG) può essere impiegato ad una concentrazione di detersivo 1% per migliorare solubilizzazione. Dal detersivi diversi hanno un diverso grado di efficienza solubilizzazione delle proteine ​​di membrana, si consiglia di eseguire purificazioni di proteine ​​indipendenti utilizzando più di un detersivo. </li><li> Il contenuto viene miscelato delicatamente ruotando il tubo per 3 ore a 4 ° C usando un agitatore LabQuake. Dopo 3 ore di rotazione, il tubo viene centrifugato a 1700 xg per 6 min. Il supernatante è quindi removed attenzione, per quanto possibile, senza disturbare il pellet sciolto tallone. </li><li> Il pellet viene risospeso nel supernatante residuo e quindi trasferita in un 0,8 x 4 centimetri Bio-Rad colonna polipropilene prep. Assicurarsi di rimuovere i tappi scarico di fondo della colonna, per consentire gli eluati di drenare dal flusso di gravità. Lavare la colonna con la fase 5 volte scissione TEV. </li><li> Dopo lo scarico eluati lavate, scarico di fondo della colonna viene chiusa. Alla stessa colonna, clivaggio viene eseguito aggiungendo ~ 5 per 10 microlitri (50 unità) di proteasi TEV e 400 pl di tampone 1X AFC sulla colonna. Garantire per chiudere la parte superiore della colonna con un tappo. La colonna contenente le microsfere vengono ruotate delicatamente la notte a 4 ° C per una notte con un agitatore LabQuake. </li><li> Rimuovere il tappo sulla parte superiore e il tappo di scarico nella parte inferiore della colonna, e drenare gli eluati recuperati dopo clivaggio TEV in una colonna di fresco contenente 200 ml di sospensioni calmodulina-sefarosio perline, che viene lavato con 10volumi di tampone calmodulin vincolante. </li><li> Sia la parte superiore e la parte inferiore della colonna sono fissate saldamente, e il contenuto della colonna sono mescolati delicatamente ruotando per 3 ore a 4 ° C usando un agitatore LabQuake. </li><li> Dopo 3 ore di rotazione, l&#39;eluato viene drenato rimuovendo il tappo superiore e il tappo di fondo della colonna. La colonna viene lavata quattro volte con 200 pl di tampone 1X calmodulina vincolante seguito da un lavaggio stringente con 400 microlitri di tampone di lavaggio calmodulina. </li><li> La proteine ​​viene eluita in quattro frazioni di 50 pl in una nuova provetta Eppendorf con 1X tampone di eluizione calmodulina. La frazione eluita è distribuito in due provette Eppendorf puliti in volumi uguali. Entrambi i tubi vengono successivamente essiccate utilizzando un vuoto velocità. </li><li> L&#39;eluato essiccato da una provetta viene utilizzato per l&#39;esecuzione di un gel colorazione con argento, mentre l&#39;altro è memorizzato in -80 ° C, prima di utilizzare la spettrometria di massa. </li></ol> 4. Argento colorazione <ol><li> Per argento staining, metà del volume 3X SDS (sodio dodecil solfato) tampone campione viene aggiunto a 50 ml di eluato essiccato. Dopo l&#39;ebollizione della miscela per 5 minuti, i campioni vengono caricati su un gel di poliacrilammide SDS. </li><li> Dopo che il gel ha terminato l&#39;esecuzione, viene accuratamente messi in soluzione di fissaggio (50% metanolo e 10% di acido acetico) e agitata delicatamente su un agitatore rotante per 20 min. Il gel viene lavato in etanolo al 20% per 10 min. </li><li> Il gel viene lavato due volte fissa accuratamente con 500 ml di acqua bidistillata per 10 min per garantire un basso background uniforme. </li><li> Il gel viene poi agitate leggermente in 500 ml di sodio-tiosolfato per 1 min, seguito da due lavaggi con acqua distillata per 20 sec. </li><li> L&#39;acqua viene scartato, e il gel viene incubato in 200 ml di nitrato d&#39;argento 0,1% per 30 min. Dopo questo periodo, il nitrato d&#39;argento viene rimosso e il gel viene lavato con acqua distillata per 20 secondi per rimuovere l&#39;eccesso di nitrato d&#39;argento. </li><li> Il gel viene infine mano agitato in 75 mldella soluzione di sviluppo. Quando l&#39;intensità desiderato è raggiunto, la soluzione di sviluppo è scartato e 80 ml di acido acetico viene aggiunto per arrestare la reazione. Garantire incubare il gel in acido acetico per un minimo di 20 minuti per la visualizzazione corretta di bande di gel. </li></ol> 5. Proteolisi e preparazione del campione per Spettrometria di Massa <ol><li> Al campione essiccato, aggiungere 50 microlitri di tampone di digestione e 0,9 ml di 100 mM TCEP-HCl (tris (2-carbossietil) fosfina - acido cloridrico) e incubare la miscela per 45 min a temperatura ambiente per la fase di riduzione. Successivamente, 1 ml di 500 mM iodoacetamide viene aggiunta e incubata in un altro buio per 40 min per permettere alchilazione campione. </li><li> Dopo la seconda fase di incubazione, aggiungere 1 ug di tripsina immobilizzata alla miscela e incubare sia a 37 ° C per 5 ore o per una notte a temperatura ambiente. Garantire per arrestare la reazione aggiungendo 1 ml di acido acetico. </li><li> Pre-bagnare la Millipore Zip-Tip puntale aspirando 10 ml della soluzione di bagnatura e di equilibrio. Dispensare la soluzione ai rifiuti. Successivamente aspirare 10 pl della soluzione di lavaggio e di erogare la soluzione ai rifiuti. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Per il legame efficace della miscela peptide alla punta, pipetta mescolare la miscela peptidica 20 volte. La miscela peptide che aderisce alla punta viene lavato via da aspirare e dispensare la soluzione di lavaggio. Ripetere questa procedura due volte per il legame efficiente della miscela peptide alla punta. </li><li> Con la punta contenente il peptide legato, aspirare 10 pl della soluzione di bagnatura e di equilibrazione, e distribuire in una provetta eppendorf pulita. Ripetere questa operazione due volte. Dopo essiccazione i campioni eluiti a vuoto velocità, i campioni possono essere analizzati immediatamente mediante spettrometria di massa o conservati a -80 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol> 6. L&#39;identificazione delle proteine ​​da LTQ Orbitrap Velos spettrometro di massa Thcomponenti elettronici polipeptidiche dei complessi isolati sono identificati utilizzando un LTQ Orbitrap Velos ibrido spettrometro di massa tandem. Il Orbitrap ha eccezionale potere di risoluzione (&gt; 60.000 completa Mezza Larghezza massima, o FWHM) e accuratezza di massa (&lt;2 ppm), che riduce al minimo MS / MS di campionamento di irrilevanti non specifici contaminanti sfondo rilevati in purificazioni di controllo, mentre l&#39;elevata velocità Velos trappola di ioni componente in grado di rilevare e peptidi abbondanza frammento bassi utilizzando sia il trasferimento di elettroni e dissociazione indotta da collisione modalità di dissociazione. Incontri di alta fiducia tra conseguente MS / MS sono mappati di riferimento E. sequenze proteiche coli con algoritmo di ricerca di database come SEQUEST e ogni sequenza di corrispondenza valutato nel corso di un algoritmo di probabilità come STATQUEST 11. Il numero totale di spettri, unicità sequenza peptidica e contaminanti sfondo comuni rilevati nel controllo negativo (vale a dire. Finto) purificazioni sono considerati per ottenere una bassa empirico falso-discupero tasso. Le seguenti operazioni vengono eseguite per l&#39;identificazione delle proteine: <ol><li> Le micro-colonne sono confezionati con ~ 10 cm di 3 micron Luna-C 18 e resina sono interfacciati ad una fonte di ioni Proxeon nanoelectrospray che è posto in linea con lo strumento Orbitrap. </li><li> Un flusso Proxeon nano pompa binaria HPLC vengono usati per fornire uno stabile flusso di punta ~ 300 nl min -1 durante le separazioni peptidici. </li><li> Per raggiungere eluizione peptide, un gradiente di tampone organico è impostato in funzione della complessità del campione. Ad esempio, il seguente gradiente è tipicamente configurato per E. campioni SPA coli: solvente B è aumentato dal 2% al 6% in 1 minuto, al 24% in 38 minuti, al 100% nel prossimo 4 min, detenuta al 100% per 1 minuto, per poi scendere al 2% nel 1 min, e finale premuto al 2% per 15 min. La fase mobile solvente A ha il 95% di acqua gradiente HPLC e il 5% ACN con 0,1% di acido formico, mentre il solvente B ha il 5% di acqua gradiente HPLC e il 95% ACN con 0,1% formico acid. La portata alla punta dell&#39;ago è impostata a 300 nl min -1 per 60 min. </li><li> Come i cicli di spettrometro di massa eseguito attraverso una scansione completa di massa a 60.000 risoluzioni, 10 concomitanti tandem scansioni di massa di frammentazione sono raccolti per le ioni precursori più intense. Esclusione dinamica, selezione massale monoisotopico, e in tempo reale i dati che dipendono dalla caratteristiche dello strumento di acquisizione sono abilitate. </li><li> Gli spettri sono cercati utilizzando un algoritmo di ricerca del database come SEQUEST contro un database di E. sequenze proteiche coli, e il risultato è statisticamente filtrati utilizzando un algoritmo di probabilità come STAQUEST 11 per garantire un basso tasso di scoperta false. Solo la fiducia elevato (99% di probabilità) i candidati sono selezionati, mentre l&#39;incontro che mostra più di 10 ppm di errore di massa rispetto alla massa peptide teorica vengono eliminati da ulteriori considerazioni. </li></ol>

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un aspetto fondamentale della ZPS approccio APMS descritto qui è che la codifica viene effettuata all&#39;interno del contesto naturale cromosomica, in modo da garantire la normale regolazione genica è mantenuto (ad esempio. Promotore esca nativo conservati, quindi i livelli di espressione non è perturbato) e nativo stabilmente associata a complessi proteici sono recuperati a quasi livelli endogeni. Questioni polarità operone inoltre sono evitati includendo un promotore rivolto all&#39;esterno nel marcatore...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Vendor</td>
			<td>and Catalog Numbers</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>I. Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#KAN201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMP201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Terrific-Broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Tryptone</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRP 402</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#YEX 555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#GLY 002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. Bacterial Strain and Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DY330</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Yu et al. (2000)10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJL148</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Zeghouf et al. (2004)7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. PCR and Electrophoresis Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PCR buffer</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mM MgCl2</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AGA002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#B7021S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># ETB444</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#28355</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRS001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#BOR001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># E6768</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#N3232L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. Plasmid isolation and Clean-up Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Midi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#12143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#28104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. PCR and Transformation Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iCycler</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>GenePulser II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 cm electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>42 &deg;C water bath shaker</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Innova 3100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter TJ-25 centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TS-5.1-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C large Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C plate incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>7. Electrophoresis and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AMP001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># B7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TEM001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#09-806A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean 3 cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#165-3301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot gel transfer device</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#IB1001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#162-0115</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F3165</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>#NA931V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained protein molecular weight standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0363</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence reagent</td>
			<td>PIERCE</td>
			<td>#1856136</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Clonex Corp</td>
			<td>#CLEC810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Draw blotting paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7796</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2 platform rocking shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>8. Sonication Equipment and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonic</td>
			<td>#23395</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOD001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#800-363-5887</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mM TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#20490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>9. Affinity Purification Reagents and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#732-6008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>#70746</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG M2 agarose beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A2220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin-sepharose beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#17-0529-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#12575-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2661</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabQuake Shaker</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>#59558</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>10. Silver Staining Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#MET302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>t#ACE222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-thiosulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-7143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#S181-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#FOR201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOC512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>11. Reagents and Equipment for Protein Identification </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td># V5280</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM NH4HCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMC555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM CaCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#CCL302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A998-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#95304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#16125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Zip-Tip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td># ZTC18M960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>~10 cm of 3 &mu;m Luna-C18 resin</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxeon nano HPLC pump</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>12. Labware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 liter conical flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#89000-372</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene falcon tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml conical flaks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#29140-045</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile culture tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#366052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#479-3221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &deg;C freezer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#13-990-14</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			Buffers and Solutions
			1. 1 liter Terrific Broth (TB) media
			11 g Bio-Tryptone 
			22 g Yeast Extract 
			2% Glycerol 
			50 ml potassium salt stock solution
			2. Potassium Salt Stock Solution
			1.5 M K2HPO4 
			0.35 M KH2PO4
			3. Sonication Buffer
			20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			10% Glycerol 
			Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP
			4. AFC buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			5. TEV cleavage buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			6. Calmodulin binding buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			7. Calmodulin wash buffer
			30 mM Tris-HCl pH 7.9 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1-0.5 mM TCEP
			8. Calmodulin elution buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			100 mM NaCl 
			10 mM EGTA 
			0.1-0.5 mM TCEP
			9. Developing solution (1L)
			37% Formaldehyde 
			30 g sodium carbonate 
			1000 ml distilled water
			10. Digestion buffer
			50 mM NH4HCO3 
			1 mM CaCl2
			11. Wetting and Equilibration solution
			70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid
			12. Washing solution
			100% H2O in 0.1% formic acid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein complexes in escherichia coli using sequential peptide affinity purification in combination with tandem mass spectrometry

Dal momento che la maggior parte dei processi cellulari sono mediate da assemblee macromolecolari, l&#39;identificazione sistematica delle interazioni proteina-proteina (PPI) e l&#39;identificazione della composizione subunità di multi-proteina complessi può fornire indicazioni in funzione del gene e migliorare la comprensione dei sistemi biologici 1, 2. Interazioni fisiche possono essere mappati con alta fiducia vialarge scala isolamento e caratterizzazione di complessi proteici endogeni in quasi fisiologiche condizioni basate su affinità purificazione di proteine ​​cromosomicamente-tag in combinazione con la spettrometria di massa (APMS). Questo approccio è stato applicato con successo in organismi evolutivamente diverse, tra cui il lievito, mosche, vermi, cellule di mammifero, e batteri 1-6. In particolare, abbiamo generato un carbossi-terminale di affinità sequenziale Peptide (SPA) a doppio sistema di etichettatura per l&#39;affinità per la purificazione complessi proteici autoctoni coltivati ​​gram-negativi Escherichia coli, con genetically-trattabili ospitanti ceppi di laboratorio che sono particolarmente adatti per genoma indagini della biologia fondamentale e processi di conservazione di procarioti 1, 2, 7. Nostro SPA-tagging sistema è analogo al metodo di purificazione per affinità tandem originariamente sviluppato per il lievito 8, 9, e consiste di un legame peptidico calmodulina (CBP) seguito dal sito di clivaggio per la proteasi altamente specifico tabacco virus etch (TEV) e tre copie del FLAG epitopo (FLAG 3X), che consente per due turni consecutivi di arricchimento affinità. Dopo l&#39;amplificazione cassetta, prodotti lineari sequenza-specifici della PCR che codifica per la SPA-tag e marcatore di selezione sono integrati ed espressi in cornice come carbossi-terminali fusioni in uno sfondo DY330 che è indotto ad esprimere transitoriamente un efficientissimo sistema di ricombinazione eterologa batteriofago lambda 10. Successiva dual-fase di purificazione utilizzando calmodulina e anti-FLAG perline affinità consente altamente selettivoe il recupero efficiente anche di complessi proteici a basso abbondanza di grandi culture. Spettrometria di massa tandem viene quindi utilizzato per identificare i stabilmente co-purificare proteine ​​con elevata sensibilità (bassi limiti di rilevazione nanogrammi). Qui, descriviamo dettagliate passo-passo le procedure usiamo comunemente per la codifica sistematica delle proteine, purificazione e di spettrometria di massa basata su analisi dei complessi proteici solubili da E. coli, che possono essere messe in scala e potenzialmente su misura per altre specie batteriche, tra cui alcuni patogeni opportunisti che sono suscettibili di recombineering. Le interazioni risultanti fisiche possono spesso rivelare interessanti elementi inaspettati e le connessioni che suggeriscono nuovi collegamenti meccanicistici. L&#39;integrazione dei dati PPI con alternate dati di associazione molecolare come genetiche (gene-gene) interazioni e genomico-contesto (GC) previsioni può facilitare spiegazione della organizzazione globale molecolare di multi-proteina complessi all&#39;interno di bipercorsi gici. Le reti generate per E. coli può essere utilizzato al fine di conoscere l&#39;architettura funzionale di prodotti genici ortologhi in altri microbi per le quali le annotazioni funzionali attualmente mancano.

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.co

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Purificazione di affinità di proteine ​​marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine ​​e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il batterio<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Che possono essere utilizzati per isolare e caratterizzare stabili multi-complessi proteici alla quasi omogeneità anche partendo da bassi numeri di copie per cellula.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

identification-protein-complexes-escherichia-coli-using-sequential

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

48.2K Views.  University of Toronto. Purificazione di affinità di proteine ​​marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine ​​e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il batterio Escherichia coli Che possono essere utilizzati per isolare e caratterizzare stabili mult...

Video: Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Ricerca

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Purificazione non-cromatografico di polipeptidi di elastina ricombinante simili e le loro fusioni con Peptidi e Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

I benefici multiforme Protein Co-espressione in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...