Este trabalho foi apoiado ya CIRM comunhão predoctoral (EDK), NARSAD Young Investigator Award (DK) e do NIMH prêmio CÉREBROS (R01MH087495) (DK).

Anestesia e analgesia: Trinta minutos antes da anestesia, injectar no rato com 0,05 mg / kg por via subcutânea a buprenorfina para analgesia. Inicie a anestesia com sódio mg / kg 30-40 intraperitoneal de pentobarbital. Neste ponto, também injectar atropina para evitar a insuficiência respiratória (0,4 mg / kg, subcutânea) e meloxicam como analgésico mais (2 mg / kg por via subcutânea). Se depois de 5 minutos, o rato é ainda móvel ou responsiva à pitada dedo do pé, dar as doses subsequentes de pentobarbital de sódio a 5 mg / kg (via intraperitoneal), até que o rato é insensível à dor. Antes de realizar a primeira incisão, injectar lidocaína (5 mg / kg, intradérmica) no local da incisão para anestesia local. Seis a oito horas após a injecção inicial, injectar no rato com 0,05 mg / kg por via subcutânea a buprenorfina para analgesia. A buprenorfina pode ser injetado a cada 6-8 horas depois, se necessário, embora este geralmente não é necessário. É importante notar que as outras formas de c anestesiaum interferir com lesões excitotóxicas. Por exemplo, embora a cetamina é uma forma geralmente usado de anestesia em roedores, pode interferir com lesões induzidas com NMDA, porque é um antagonista do receptor de NMDA. É importante seleccionar um método de indução de anestesia que não reduz o tamanho da lesão. Se a anestesia de gás for desejado, a maioria dos dispositivos estereotáxicas, incluindo os descritos aqui podem acomodar placas de máscara de gás. Nota: Os materiais são descritos mais na Tabela de reagentes específicos e equipamentos abaixo. 1. Preparação da bomba e Stereotax <ol><li> Encher uma seringa de Hamilton 10 ul com água estéril e montá-lo para o transportador de uma bomba de seringa 6 programável. Fixar a extremidade do êmbolo da seringa no suporte fixada na bomba. </li><li> Prefill gás-esterilizado PE20 tubagem com água estéril usando uma agulha e seringa 1 ml. Deslizar a extremidade aberta do tubo para a seringa de Hamilton, sendo o cuidadoful para evitar a criação de quaisquer bolhas de ar no tubo. </li><li> Prender a 30ga, plana de corte, ponta de agulha 1 polegada de infusão da tubagem para o braço de um dispositivo estereotáxico utilizando um manipulador eléctrodo barril de estilo. Inserir a agulha de infusão entre a braçadeira eo cano estriado. Coloque a braçadeira ao longo de um pedaço de tubo contendo agulha de metal no seu interior, para evitar o achatamento da tubagem e restringindo o fluxo de fluido. </li><li> Ajustar a taxa de bomba para&gt; 5 ul / min e ligar a bomba. Uma gota de água deve aparecer na ponta da agulha de infusão. Verifique o comprimento da tubulação e suas articulações para se certificar de que não há vazamentos. </li><li> Limpe a água do cordão, com um cotonete estéril e definir a bomba para retirar. Retirar a 2 bolha de ar ul. A parte superior da bolha deve ser visível na tubagem. </li><li> Mergulha-se o ponta da agulha de perfusão em uma solução de 20 mg / ml de NMDA no estéril 0,1 M PBS e retirar uL 4-5. Uma bolha de ar deve ser visível entre a água estéril ea solução NMDAna ponta. É importante notar que NMDA é um potente neurotoxina e cuidado deve ser usado na preparação e manuseamento desta solução. Luvas e proteção para os olhos são aconselhados em todos os momentos. </li></ol> 2. Monte o rato no dispositivo Estereotáxica <ol><li> A Figura 1 mostra as partes básicas do dispositivo estereotáxico. Depois de raspar a cabeça do rato a partir da linha dos olhos para as orelhas, coloque os dentes da frente do rato sobre a barra de mordida, com o corpo do rato repousa sobre uma almofada de aquecimento definida em médio prazo. A língua deve ficar abaixo da barra de mordida, com o maxilar inferior. Se disponível, uma temperatura almofada de aquecimento gabarito seria preferível. Monitorar a temperatura retal também seria ideal. </li><li> Segurando o pescoço do rato com o polegar eo indicador, mova o canal do ouvido direito sobre a barra horizontal orelha direita. A barra deve sentir como ele está descansando em um lugar sólido, não como ele afunda muito na cabeça. Segurando o lado direito da cabeça constante, deslize da orelha esquerdabarrar no canal do rato orelha esquerda horizontal. Deve sentir como ele está descansando em um lugar sólido. O orelhas deve olhar simétrico e deve aparecer para deitar-se as barras de ouvido. Upward queima de orelhas indica um posicionamento inadequado das barras de ouvido. A cabeça não deve oscilar em resposta à pressão no pescoço. </li><li> Aparafuse a barra de nariz. Seja gentil. Os ossos do nariz são delicadas e barra de nariz não precisa ser apertado. Verifique se o rato é ainda anestesiado antes de prosseguir. </li></ol> 3. Preparando o Rato para a cirurgia <ol><li> Usando uma zaragatoa estéril, suavemente colocar uma pequena quantidade de pomada oftálmica veterinária lubrificante em cada um dos olhos do rato para protegê-los a partir de secagem e detritos. </li><li> Concentricamente a partir do local da incisão planeada para a borda da região raspada, limpe couro cabeludo do rato com uma solução de clorexidina 2%, seguido de etanol a 70%, três vezes. Esfrega clorexidina pode também ser utilizados se desinfectante mais eficaz for desejado.Termine limpando com solução a 10% iodopovidona. O couro cabeludo é preparada agora estéril e só deve ser tocado com materiais estéreis. </li><li> Luvas estéreis para Don novas medidas porque você vai lidar com o próximo local preparado cirúrgico. </li><li> Colocar uma cortina estéril de modo que a fenestração expõe o local cirúrgico. </li></ol> 4. Criando a janela cirúrgica <ol><li> Usando uma lâmina de bisturi # 10, fazer uma incisão (aproximadamente 2 cm de comprimento) ao longo da linha mediana longitudinal do couro cabeludo. A incisão deve começar posterior em relação à linha dos olhos. Com o polegar eo dedo indicador da mão não-dominante, segurar o couro cabeludo em perpendicular à direcção da tensão da incisão. </li><li> Puxar o fáscia que recobre a superfície do crânio para as bordas do local cirúrgico utilizando estéreis de algodão-dicas. Vai levar um pouco de força para limpar o crânio para que ele possa ser visualizado. </li><li> Use quatro curvas, hemostats estéreis para criar uma janela cirúrgica. Fáscia braçadeira (não de pele) em EAch lado dos aspectos anteriores e posteriores da incisão e, em seguida colocar os grampos ao lado do animal, fazendo assim avançar o incisão aberta e inteiramente expondo o crânio. </li></ol> 5. Nivelamento da Caveira e Criando o orifício piloto <ol><li> Localizar bregma, o ponto anterior em que as três placas principais do crânio se encontram, como representado na Figura 2. Mova a agulha da infusão para a ponta da agulha só toca o crânio, bregma. Observe o dorso-ventral Figura coordenadas. 3 demonstra como ler coordenadas em um dispositivo Stoelting estereotáxica. Nota, neste ponto, as luvas são já não estéril e não deve tocar no local da cirurgia estéril directamente. Nota: Depois de tocar o dispositivo não estéril estereotáxico, o cirurgião não é mais estéril e não deve tocar no local cirúrgico, nem partes do equipamento que irá tocar o local cirúrgico. </li><li> Localizar lambda, o ponto posterior onde os três placas principais do crânio se encontram, como depicted na Figura 2. Levante a agulha da infusão ligeiramente e movê-lo para trás para lambda. Baixe a agulha até que toque o crânio em lambda. Leia a coordenada dorso-ventral. Se o crânio é nível, será de 0,1 mm da leitura bregma. Se for mais longe do que isso, mover a agulha para cima (fora do caminho), solte a barra de nariz, aumentar ou reduzir tanto a plataforma barra de mordida, dependendo do final da cabeça é muito alto, e então re-medida. </li><li> Mova a agulha da infusão sobre bregma e gravar as coordenadas ântero-posterior e medial-lateral. Calcular onde a agulha deve ser movido com base nas coordenadas de a área do cérebro de interesse de acordo com um cérebro atlas 12. Para o BLA, subtraia 2,8 milímetros a partir da coordenada ântero-posterior e adicionar ou subtrair 5,1 mm a / a partir da coordenada medial-lateral, dependendo se você deseja atingir a esquerda ou direita. Mover a agulha de infusão para a posição calculada. </li><li> Balance o needle fora do caminho, tomando cuidado para manter o controle de onde foi localizado e, em seguida, faça um furo de aproximadamente 2 mm de diâmetro em que local usando uma Dremel moto-ferramenta com uma broca dental estéril anexado. Fure com cuidado, quando a broca rompe o crânio, ele tenderá a puxar para baixo, podendo danificar o tecido cerebral e dura por baixo. Resma do buraco para ampliá-la. </li><li> Absorver todo o sangue com um cotonete estéril. </li></ol> 6. A infusão de neurotoxina <ol><li> Balance a agulha de volta para a posição. Baixe a agulha até tocar a superfície do cérebro. Registre a coordenada dorso-ventral. Este é o nível de dura. Subtrair o valor apropriado para alcançar a região do cérebro de seu interesse. Para a amígdala basolateral, subtrair 6,7 mm. </li><li> Baixar a agulha de perfusão para o nível calculado lentamente. Em seguida, levantar-lo de volta, bem acima do crânio. Use um fio de Hamilton limpeza seringa para desobstruir a ponta da agulha de infusão, tomando cuidado para não tai a extremidade do fio que entra em contacto com a agulha de perfusão com não-estéreis luvas. </li><li> Executar a bomba em&gt; 5 uL / ​​min e certifique-se ver uma gota de líquido sair da agulha da infusão. Se não, desentupir com o fio e tente novamente. </li><li> Abaixe a agulha da infusão para o nível desejado dorsal / ventral lentamente. </li><li> Definir a taxa sobre a bomba de infusão a 0,1 ul / min e iniciar a infusão. Infundir durante 2 min. </li><li> Uma vez que a infusão foi iniciado, marcar as duas extremidades da bolha de ar na tubagem com um marcador preto. Se ambas as extremidades não se movem, a agulha está obstruída. Parar a infusão, levantar a agulha, desentupir com o fio, para verificar fluxo com uma taxa de fluxo elevado, re-diminuir a agulha e tentar de novo. </li><li> Uma vez que a infusão está completa, parar a bomba e esperar 5 min para o NMDA para difundir para longe da ponta da agulha. </li><li> Levantar a agulha de 0,5 mm, e infundir novamente durante 1 min. Espere 2,5 min para o NMDA para difundir para longe da ponta da agulha. Esta infusão extra que eleLPS assegurar todo o BLA é coberta pela infusão. Se isto é necessário para outras regiões do cérebro deve determinada experimentalmente. </li><li> Levante a agulha para fora do cérebro lenta e balançar o braço estereotáxico para fora do caminho. </li></ol> 7. Fechamento da incisão <ol><li> Don novas luvas estéreis para fechar a incisão. </li><li> Limpe qualquer excesso de sangue no crânio com algodão estéril de dicas e remover os grampos da fáscia. </li><li> Utilizando uma pinça de Londres, empurrar os dois lados da incisão em conjunto. As arestas interiores da pele deve satisfazer ea borda exterior da pele não deve ser permitido para enrolar na incisão. Enquanto pressiona a incisão fechada, aplicar grampos de sutura para fechar a protrusão firmemente. Continuar a empurrar a pele em conjunto e grampo ao longo do comprimento da incisão. Isso normalmente leva 3-5 grampos de sutura. </li><li> Depois de colocar todos os clipes da ferida, use a pinça para prender os grampos novamente, certificando-se que eles são seguros. O t mais seguroele clips, menor a probabilidade de um rato vai retirá-los antes da incisão tenha cicatrizado. </li><li> Swab a incisão grampeada com solução a 10% iodopovidona e retornar o rato para sua gaiola e monitor até que a mobilidade é restaurada (normalmente 1-2 horas após a anestesia, tempo total de cirurgia de indução ao fechamento sendo 30-45 min). Neste ponto, o rato pode ser retornada para a sala de colónia. Após uma semana, remover grampos com uma ferramenta de removedor de grampos, sob anestesia com isoflurano. </li><li> Use um esterilizador quente talão para esterilizar as superfícies da ponta de todos os instrumentos antes da utilização no rato seguinte. Os instrumentos devem ser imersos nas pérolas para não mais do que 15 segundos, ou podem tornar-se demasiado quente para manipular. Os instrumentos devem ser totalmente resfriado antes usada em outro animal. </li></ol> 8. Recuperação <ol><li> É possível que os ratos serão exibem actividade convulsiva, nos dias após a lesão. Dependendo da região do cérebro danificadas, outros comportamentos, tais como consumo de alimentos ou grooming pode ser afetada. É importante que os animais ser monitorizado numa base diária para assegurar que eles permanecem saudáveis ​​durante a recuperação. O tratamento de suporte, tais como alimentos líquidos, de alto teor calórico dos alimentos, ou analgesia adicional pode ser necessária. A mortalidade por anestesia ocorre em uma baixa percentagem de ratos, geralmente inferior a 5%. A mortalidade por outras causas (infecções, hemorragias) é extremamente raro. Quaisquer sinais de angústia após a recuperação da anestesia pode ser motivo de exclusão a partir de estudos futuros, mas são extremamente raros. Figura 4 mostra a perda de peso durante os primeiros dias após a cirurgia como deveria ser esperado. O peso corporal deve se recuperar dentro de 1 semana. </li></ol> 9. Os resultados representativos Uma semana ou mais após a infusão de NMDA, a lesão pode ser visualizada usando um contracorante cresilo-violeta e microscopia de campo claro. Cérebros deve ser perfundidos com paraformaldeído gelada 4%, equilibrada em sacarose a 30% em 0,1 M de PBS e frozen. Eles devem, então, ser cortado em 30-60 mM, de uma série de 01:06 - 1:12 e montada em lâminas de gelatina revestidos de vidro antes de sofrer uma contracorante violeta de cresilo padrão. A lesão deve corresponder a uma &quot;careca&quot;, ou uma área de diminuição cresil violeta mancha devido à morte celular após lesão. Figuras 5A e B mostram uma lesão representante da AML e CeA. Esta imagem foi obtida utilizando um scanner de mesa com uma varredura de alta resolução (1200 dpi). Para visualizar a lesão, ele ajuda a contracoloração uma série de seções com grande parte do tecido que circunda a área alvo para uma lesão mal colocada pode ser localizado. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig1.jpg" /> Figura 1. Configuração estereotáxica. Esta figura mostra a estereotáxica rato com as partes pertinentes rotulados. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig2.jpg" /> Figura 2. Bregma e lambda na sku ratoll. Esta ilustração mostra os locais de bregma e lambda. Todas as coordenadas são medidas em relação à bregma. Lambda é usado para assegurar que o crânio é nível. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig3.jpg" /> Figura 3. Lendo coordenadas estereotáxicas. Este desenho representa uma leitura padrão estereotáxica. Para obter os dígitos para a esquerda da casa decimal, utilizar os marcadores do lado direito. O dígito rotulado corresponde ao local dezenas (isto é, 1 = 10, 2 = 20). As marcas de hash entre os dígitos marcados correspondem às unidades individuais (1-9). A linha zero indica o que o inteiro stereotax está definido. Aqui, a linha de zero é entre os 10 e 11 marcadores, indicando que a leitura está entre 10 e 11. Para determinar os números para a direita da casa decimal, utilizar os marcadores do lado esquerdo. As marcas de hash à esquerda são numerados de 0 a 10, com cada hash não marcado que representa uma diferença unidade deaqueles ao lado dele. Qualquer que seja o das marcas de hash sobre as linhas de esquerda melhor até com as marcas de hash à direita indica a primeira casa decimal da leitura de coordenadas. Aqui, a marca hash na esquerda correspondente ao número 9 linhas até melhor com as marcas do lado direito de hash para a casa decimal é 9. A leitura final é de 10,9 mm. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig4.jpg" /> Figura 4. Alteração de peso após a cirurgia. Este gráfico mostra o peso (± SEM) média de ratos submetidos a cirurgia estereotáxico (n = 17) ou não ter a cirurgia (n = 6). Dia 0 é o dia da cirurgia. Após a cirurgia, o peso de ratos diminuiu durante 2-3 dias após a cirurgia e, em seguida, aumentou cerca de 5-6 dias. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplo lesão excitotóxica. A) Esta imagem mostra uma violeta cresil contracoloração em uma fatia 30 um coronal com o careca &quot;mancha &quot;de lesão de NMDA da amígdala basolateral. As setas brancas delinear a lesão. Ele pode ser comparado com o lado contralateral da fatia do cérebro que não tem nenhuma lesão. B) Uma lesão semelhante do núcleo central da amígdala.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado estereotáxico permite lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro através de infusão de NMDA. Os métodos básicos estereotáxicas pode ser adaptado para infundir uma variedade de agentes farmacológicos e biológicos de um modo específico do local. Ele também pode ser adaptado para orientar uma variedade de áreas do cérebro, definida pelas suas coordenadas estereotáxicas no cérebro atlas 12. Adaptação a outras espécies tais como ratos pode ser feita com um e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> N-Metil-D-aspártico Ácido 98% </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32919-0500 </td><td></td></tr><tr><td> Dupla Laboratório Padrão Estereotáxica w/45 graus. Barras de ouvido </td><td> Stoelting </td><td> 51653 </td><td> Fornecedor alternativo: Kopf * nota de cautela: garantir a compatibilidade de acessórios estereotáxicas se comprar de vários fornecedores </td></tr><tr><td> 10 ul SYR ESPECIAL (* / * / *) </td><td> Hamilton </td><td> 701SN </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Moto-Ferramenta </td><td> Stoelting </td><td> 58600 </td><td> Fornecedor alternativo: Kopf </td></tr><tr><td> Carbide brocas, peça de mão HP, tamanho 2 </td><td> Schein Dental </td><td> 2284578 </td><td></td></tr><tr><td> Stoelting 6 Programa SeringaBomba programável </td><td> Stoelting </td><td> 53140 </td><td> Fornecedor alternativo: Kopf </td></tr><tr><td> Aço Inoxidável Hypodermic 316 Tubulação parede regular calibre 30 0,0123 &quot;OD x 0,00625&quot; ID x .003 &quot;Wall (agulha de infusão) </td><td> Peças pequenas </td><td> HTXX-30R-06-05 </td><td></td></tr><tr><td> Intramedic PE 20 tubagem (tubo de infusão) </td><td> VWR </td><td> 63019-025 </td><td></td></tr><tr><td> Clipes Reflex, 9mm, não-estéril </td><td> Kent Scientific Corp </td><td> INS500346 </td><td> Vendedor Alternativa: Ferramentas de Ciência Belas </td></tr><tr><td> Aplicador Clipe Reflex para clipes de 9mm </td><td> Kent Scientific Corp </td><td> 12031-09 </td><td> Vendedor Alternativa: Ferramentas de Ciência Belas </td></tr><tr><td> Hemostat Hartman Curvo </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 13003-10 </td><td></td></tr><tr><td> Londres fórceps </td><td> Belas Ferramentas sceince </td><td> 11080-02 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Solução de clorexidina a 2% </td><td> Allivet </td><td> 30159 </td><td> Fornecedor alternativo: PetSolutions </td></tr><tr><td> Solução de iodo de 10% povidona </td><td> CVS </td><td> SKU # 739575 </td><td></td></tr><tr><td> Hot talão esterilizador </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 610183 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tabela de reagentes específicos e equipamentos.

stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat

Muitas funções comportamentais em mamíferos, incluindo roedores e humanos, são mediados principalmente pelos regiões do cérebro discretos. Um método comum para a função o discernimento de várias regiões do cérebro para o comportamento ou outros resultados experimentais é implementar uma ablação localizada da função. Em humanos, as populações de pacientes com lesões cerebrais localizadas são frequentemente estudadas para os défices, na esperança de revelar a função subjacente da área danificada. Em roedores, pode-se induzir experimentalmente lesões de regiões específicas do cérebro. Lesão pode ser realizado de várias maneiras. Lesões electrolíticas pode causar danos localizados mas irá prejudicar uma variedade de tipos de células, bem como fibras que atravessam a partir de outras regiões do cérebro que acontecem para ser próximo do local da lesão. Induzível técnicas genéticas utilizando células tipo promotores específicos pode também ativar site-specific segmentação. Estas técnicas são complexos e nem sempre é prático, dependendo da área do cérebro alvo. Excitotóxico lesão através de cirurgia estereotáxica, pelo contrário, é um dos métodos mais confiáveis ​​e práticos da lesioning neurônios excitatórios sem danificar locais células gliais ou atravessando fibras. Aqui, nós apresentamos um protocolo para infusão estereotáxico do excitotoxina, N-metil-D-aspartato (NMDA), no complexo amígdala basolateral. Usando indicações anatômicas, aplicamos coordenadas estereotáxicas para determinar a localização da nossa região do cérebro alvo e baixar uma agulha de injeção no local um pouco acima do alvo. Em seguida, infundir nosso excitotoxina no cérebro, resultando em morte excitotóxica de neurônios próximos. Embora o nosso sujeito experimental de escolha é um rato, os mesmos métodos podem ser aplicados a outros mamíferos, com os ajustes apropriados em equipamentos e coordenadas. Este método pode ser usado em uma variedade de regiões do cérebro, incluindo a amígdala basolateral 1-6, os núcleos amígdala outro 6, 7, 8 hipocampo, entorhinal córtex 9 e córtex pré-frontal 10. Também pode ser utilizado para infundir compostos biológicos, tais como vectores virais 1, 11. A técnica básica estereotáxico poderia também ser adaptado para a implantação de mais permanentes bombas osmóticas, permitindo a exposição mais prolongada a um composto de interesse.

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Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Ablação alvo de região específica do cérebro (s) por infusão de uma excitotoxina utilizando coordenadas estereotáxico é descrito. Esta técnica pode também ser adaptado para infusão de outros produtos químicos para o cérebro de rato.

Cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

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Research

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Neuroscience

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Vídeo: Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Cirurgia estereotáxica de roedores e animais Melhorias Resultado do Bem-Estar de Neurociência Comportamental

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Neurociência

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the neurosciences. Phylogenetically, these animals are much closer to humans than rodents. They also display complex behaviors, including a wide range of vocalizations and social interactions. Here, an effective stereotaxic neurosurgical procedure for implantation of recording electrode arrays in the common marmoset is described. This protocol also details the pre- and postoperative steps of animal care that are required to successfully perform such a surgery. Finally, this protocol shows an example of local field potential and spike activity recordings in a freely behaving marmoset 1 week after the surgical procedure. Overall, this method provides an opportunity to study the brain function in awake and freely behaving marmosets. The same protocol can be readily used by researchers working with other small primates. In addition, it can be easily modified to allow other studies requiring implants, such as stimulating electrodes, microinjections, implantation of optrodes or guide cannulas, or ablation of discrete tissue regions.

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

This work presents a protocol to perform a stereotaxic, neurosurgical implantation of&#160;microelectrode arrays in the common marmoset. This method specifically enables electrophysiological recordings in freely behaving animals but can be easily adapted to any other similar neurosurgical intervention in this species (e.g., cannula for drug administration or electrodes for brain stimulation).