Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Pesquisa do Câncer de Ontário (OICR), a Terry Fox Foundation e da American Association of Neurological Surgeons.

1. Cultura de tecido de tumor cerebral <ol><li> Adicionar 200 ul de Liberase descongelado (Roche Applied Science) para 15 ml de CSF artificial (aCSF-ver Tabela 1) e colocar em banho de água a 37 ° C. Liberase TM é uma mistura de enzimas proteolíticos utilizadas para dissociar amostras de tecidos primários, assim como tumorspheres cultivadas. Ao contrário de tripsina-EDTA, o método de Liberase preserva o antigénio de superfície da CD133. Para obter uma amostra de tecido de cerca de 0,5 cm 3, usamos 200 ul de Liberase. Se o tecido for menor, usamos 100 ul. </li><li> Traga solução cloreto de amónio (tecnologias de células-tronco) à temperatura ambiente. Solução de cloreto de amónio suavemente lisa os glóbulos vermelhos com um efeito mínimo sobre outras células. Ele não contém um fixador. </li><li> Na cabine de segurança biológica estéril, adicionar 5 ml de aCSF a girar espécime recipiente, para lavar o tecido, em seguida, pipetar fora. Este passo ajuda a remover as células vermelhas do sangue (RBC). </li><li> Transferir o tecido de tumor cerebral a uma estéril 100 milímetros Petri dish. </li><li> Com uma tesoura fina ou bisturis e pinças, desagregar o tecido de consistência da pasta. </li><li> Recolha de amostra, utilizando uma pipeta de 10 ml regular ou fórceps e fragmentos de transferência para dentro do tubo que contém pré-aquecido com aCSF Liberase. </li><li> Lugar em incubadora-agitadora (30 rpm) e ajustado para 37 ° C, durante 15 min. </li><li> Filtrar o lisado de tecido através do filtro 70 uM em células de um tubo de 50 ml Falcon. </li><li> Girar-se o filtrado para baixo a 280 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante com cuidado e avaliar o tamanho ea cor do resultado agregado de células: pelotas, que são cor de rosa ou vermelho indicam aumento do número de células vermelhas do sangue. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS. </li><li> Adicionar uma quantidade apropriada de solução de cloreto de amónio (4-12 ml), com base no tamanho do grânulo e da contaminação de glóbulos vermelhos (solução de cloreto de amónio é muito suave e quantidades aumentadas não são prejudiciais para as células que não sejam de células vermelhas). </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Células de spinpara baixo a 280 xg durante 5 min. </li><li> Lavar uma vez com 10 ml de PBS estéril. </li><li> Ressuspender em 5 ml de meio de NSC completo (Tabela 2) e transferir para um ultra-baixo de ligação placa de 60 mm de cultura de tecidos (Corning). Usamos ultra-baixas placas de cultura com as superfícies de ligação de hidrogel ligados covalentemente que são hidrofílicas e com carga neutra, para minimizar a diferenciação celular mediada por ligação. </li></ol> Para os dias iniciais na cultura, não altere a mídia: top-up só com 1-2 ml de mídia, conforme necessário, em seguida, continuar a observar os meios de cultura e de mudança quando a cor da mídia torna-se um pouco amarelo. 2. Tumorsphere dissociação de Citometria de Fluxo <ol><li> Avaliar tumorspheres sob microscópio: se o tamanho da esfera é&gt; 100 um, a dissociação é recomendada como esferas maiores podem tornar-se no centro necrótico. </li><li> Transferir a cultura para 15 ml tubo cónico. </li><li> Adicionar 2-3 ml estéril PBS para enxaguar a chapa cuidadosamente e adicionar ao tubo cônico. </li><li> Centrifugar a 280 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 - 2 ml de PBS estéril. </li><li> Adicionar 10 ul de Liberase. </li><li> Incubar em banho de água a 37 ° C durante 3 min. Remover e avaliar visualmente a suspensão, se aglomerados várias vistas, tritura-se cuidadosamente com uma pipeta de ponta de 1000 ul. </li><li> Se aglomeração persistir, continuar a incubação de uma min 1-2 adicional. </li><li> Lave as células por adição de 5 ml de PBS estéril e centrifugar a 280 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender em 500-1.000 ul de PBS estéril, 2 mM de EDTA. </li><li> Avaliar o número de células e viabilidade utilizando azul de tripan. </li><li> Ajustar a contagem de células a 1 milhão / ml em PBS 2 mM de EDTA. </li></ol> 3. A coloração da superfície <ol><li> Transferir 100 uL de suspensão de células a 1x10 6 ml / por teste de fluxo de tubos de 12x75 mm. </li><li> Adicionar uma quantidade adequada de anticorpos. Controles isotipo devem ser utilizados para cadade anticorpos (ver Tabela 3). </li><li> Incubar durante 30 min em gelo. </li><li> Adicionar 2 ml de PBS 2 mM de EDTA a cada tubo de fluxo. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 4 min, decantar e blot. </li><li> Ressuspender o sedimento em 300 ul de PBS 2 mM de EDTA. </li><li> Adicionar 10 ul de corante de viabilidade 7AAD a cada tubo e incubar durante pelo menos 15 min em gelo. </li><li> Analisar por citometria de fluxo. </li></ol> 4. Aquisição e Análise de Citometria de Fluxo As especificidades da aquisição e análise de dados de fluxo são o instrumento-dependente. Representante amostras negativas são executados e configurações do instrumento estabelecido para frente (tamanho) e lateral (granularidade) dispersão. Este padrão de dispersão permite que o usuário final para ver todas as células na amostra, incluindo detritos. A região é normalmente desenhada em torno das células de interesse. (Figura 4a) Definições são então estabelecidos para todos os detectores de fluorescência necessários para posicionar as células negativas dentro da primeira década do afenredo intensidade luorescence. Quando mais de um corante ou fluorocromo é usada, simples controles manchadas devem ser executados para estabelecer os valores de compensação de cor (subtração de interferir emissões de fluorescência). Ao executar as células vivas, um corante de viabilidade, como 7-AAD (7-amino-actinomicina D - 488/emission excitação 655) é usado e uma segunda região traçada para excluir as células mortas (Figura 4b). Ambas as regiões são aplicados a uma análise mais aprofundada das amostras. 5. Auto-renovação de Ensaio O ensaio de chave que é muito facilitada pelo crescimento clonal esfera é o ensaio in vitro da capacidade de auto-renovação, o ensaio de diluição limitante. Tumorspheres são dissociados e distribuídos em diluições para baixo para uma única célula por poço, e a taxa de formação de esfera posterior ao longo de 7 dias em cultura, é calculada. No dia 7, a percentagem de poços não contendo esferas para cada densidade de plaqueamento de células (F 0) é calculada e traçadacom o número de células por poço (x). O número de células necessário para formar pelo menos um tumorsphere em cada poço é determinada a partir do ponto em que a linha cruza o nível de 0,37 (F 0 = e-x). Em uma distribuição de Poisson de células, F 0 = 0,37 corresponde à diluição de uma célula por cavidade, de modo que este cálculo (37% intersectam) reflecte a frequência de células estaminais clonogénicas na população celular total (Figura 5). 6. Single Cell RT-PCR Células individuais de diferentes populações são classificadas pela Beckman Coulter MoFlo XDP em sites de reação em um slide AmpliGrid (Beckman Coulter gato # AG480F). Única célula RT-PCR é realizada utilizando AmpliGrid Único One Step RT-PCR system (Beckman Coulter cat # OAX04515) de acordo com as especificações do fabricante. Resumidamente, uma única célula é depositado em cada local de reacção de um slide AmpliGrid, a presença de uma única célula em cadalocal de reacção confirmada por microscopia. A transcrição reversa (RT) é realizado imediatamente após a triagem para evitar que a amostra seja comprometido. A RT mistura principal é preparada, de acordo com as instruções do kit (Tabela 4). Foram utilizados 0,03 ul de 25 uM iniciadores aleatórios (Promega) por reacção, 1 uL de mistura principal é adicionado ao meio de cada local de reacção. Isto é imediatamente revestido com 5 ul de solução de vedação (Beckman Coulter cat # OAX04503). Usando uma lâmina AmpliSpeed ​​cycler (Beckman Coulter, cat # OAX04101), as lâminas são incubadas a 25 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 10 min, e 55 ° C durante 45 min. Após a transcrição reversa, 3 ul de DNase / RNase livre de água são adicionados a cada local de reacção, e toda a mistura transferida para um tubo de PCR (1 tubo / local). Em uma placa de PCR, num volume de reacção de 10 uL é utilizado para a PCR quantitativa: 8 uL qPCR master mix (5 ul Sybr Green (Quanta), 1 ul de água, 1 ul de 10 uM para a frente e de mistura iniciadora reversa) mais 2 &amp;mu; l da mistura de RT. Para a quantificação em tempo real, as amostras são executados em um termociclador BioRad usando o seguinte programa: 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 60 segundos, 72 ° C durante 60 segundos, seguido por 10 min a 72 ° C e análise da curva de fusão. Valores Ct foram determinados utilizando Opticon Monitor 3 (BioRad). Três genes pode ser avaliada por célula, incluindo o GAPDH como gene housekeeping. A expressão genética é normalizado para a expressão de GAPDH, de acordo com a 2-ΔCt. Pelo menos uma dezena de células individuais de uma mesma população do mesmo tipo podem ser utilizados como biológico replica para compensar a falta de técnicas repetições. 7. Resultados representativos A Figura 1 mostra uma ressonância magnética (RM) de um paciente com um representante GBM. Amostras de tumores cerebrais são obtidos de pacientes que consentiram imediatamente após a cirurgia, conforme aprovado pelo Ministério da Saúde Hamilton Ciências / Saúde McMaster Sciences Pesquisa Conselho de Ética. Uma parte de cada amostra é dado ao neuropatologista para o diagnóstico clínico de rotina. A amostra restante é processada como se mostra na Figura 2. As células de tumor, uma vez que, semeadas em meios completos de células estaminais neurais, com factores de crescimento, tumorspheres forma como mostrado na Figura 3. As células tumorais são marcadas com marcadores neurais de superfície de células estaminais CD133 e CD15 e analisados ​​por citometria de fluxo como mostrado na Figura 4. Células isoladas a partir de diferentes populações de por exemplo, CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- são então ordenados em placas de 96 poços (Figura 5a) ou em slides AmpliGrid (Figura 6a). Na placa de 96 poços, as células individuais que possuem a capacidade de auto-renovação (por exemplo, células CD133 +), (Figura 5b), pode formar tumorspheres (Figura 5c), seguindo INCUexacerbação. Um gráfico de auto-renovação pode ser representada (Figura 5d) por contagem do número de esferas formadas por poço. Células individuais ordenadas no sítio da reacção da corrediça Ampligrid (Figura 6a). O RNA extraído a partir de células isoladas pode ser transcrito de forma inversa utilizando o AmpliSpeed ​​Advalytix (Figura 6b). O ADNc obtido é usado para realizar em tempo real de RT-PCR (Figura 6c). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig1.jpg" /> Figura 1. A ressonância magnética (RM) de um GBM paciente. Exame de ressonância magnética do cérebro de uma menina de 16 anos com uma história de um mês de duração de dor de cabeça e uma história de uma semana de letargia, vômitos e visão turva. Seqüência FLAIR axial mostra um grande bi-hemisférica GBM (&quot;borboleta&quot;). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig2.jpg" /> Figura 2. Processamento de tumor cerebral. Amostras de tumores cerebrais são obtaINED de consentir pacientes imediatamente após a cirurgia. Eles são dissociados mecanicamente como se mostra (a) e, em seguida, são enzimaticamente dissociada em aCSF com Liberase por incubação numa incubadora de balanço 30 rpm a 37 ° C durante 15 min (b). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig3.jpg" /> Figura 3. Populações BTIC formar tumorspheres em cultura. Células cerebrais Dissociated tumorais, semeadas em meios completos células-tronco neurais com fatores de crescimento formam tumorspheres. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig4.jpg" /> Figura 4. A análise citométrica de fluxo de populações BTIC. (A) Encaminhar versus propriedades de dispersão laterais proporcionam uma imagem de todas as células, incluindo detritos (b) As células que coram com o corante de viabilidade 7-AAD são excluídos da análise. (C) A posição dos quadrantes estatística é determinada utilizando controlos isotípicos apropriados (d) As células de tumor coradas com superfície markers CD15-PE e CD133-APC. (D) MoFlo seleccionador de células XDP. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4111/4111fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig5.jpg" /> Figura 5. Limitando a análise de diluição BTICs revela a sua capacidade de auto-renovação. (A) Células de diluições variadas são classificados em 96 poços contendo 200 ul de NSC para (b) uma única célula por poço. (C) Após um período de incubação de 7 dias, um tumorsphere é formado. A morfologia das tumorspheres secundárias é idêntico ao do tumorspheres primárias. (D) A média x-intercept valores podem ser calculados a partir de análise de diluição limitante para cada subtipo de tumor para revelar o número de células necessário para formar pelo menos um tumorsphere por poço. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig6.jpg" /> Figura 6. A análise da expressão do gene de uma única célula BTICÉ possível, utilizando tecnologia de célula única de RT-PCR. (a) as células individuais de uma população BTIC podem ser classificados em lâminas AmpliGrid. (B) a síntese de ADNc é realizada em células individuais em slides AmpliGrid usando o AmpliSpeed ​​Advalytix. (C) em tempo real quantitativa de PCR é realizada no ADNc sintetizado a partir de células individuais BTIC. <table border="1"><tbody><tr><td> 2M NaCl </td><td> 62 ml </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M de MgCl2 </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> 155 mM de NaHCO3 </td><td> 169 ml </td></tr><tr><td> A glicose 1M </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,9256 ml </td></tr><tr><td> Purelab Ultra H 2 0 </td><td> 749,84 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1 fluido cerebrospinal artificial (aCSF) -. 1,000 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Mídias em estoque basais </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> 480 ml </td></tr><tr><td> Suplemento N2 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 3,0 g </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína (60 ug / ml) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Factor-1 a sobrevivência neural (NSF-1) </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Meio das células estaminais neurais. Mídia NSC completas (feito logo antes do uso): Meios basais NSC + 20 ng / ml de EGF (factor de crescimento epidérmico) + 20 ng / ml de bFGF (factor de crescimento de fibroblastos básico) + 10 ng / ml LIF (factor inibidor de leucemia) * + 10 ul / ml de antibiótico-antimicótico * Factor inibidor da leucemia (LIF): Este reagente de Millipore contém uma citocina interleucina classe 6, um protein que suprime diferenciação espontânea de células estaminais que promovem a manutenção a longo prazo de culturas de células estaminais. <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpos </td><td> Fornecedor / CAT # </td><td> il / teste (em 100 uL) </td></tr><tr><td> CD133 / 2 APC (293C3) </td><td> Miltenyi Biotec/130-090-854 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2b APC (controlo de isotipo) </td><td> Miltenyi Biotec/130-092-217 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CD15PE </td><td> Beckman Coulter/IM1954U </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2a PE (controlo de isotipo) </td><td> Beckman Coulter/A09141 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> Beckman Coulter/A07704 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Anticorpos de fluxo. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume (uma reacção) </td><td> Volume (48 reacção) </td></tr><tr><td> 2x Único Célula de Armazenamento reacção RT </td><td> 0,50 ul </td><td> 30,0 ul </td></tr><tr><td> Inibidor de RNase (10 U ^ l /) </td><td> 0,02 ul </td><td> 1,2 ul </td></tr><tr><td> 5X única célula RT enhancer </td><td> 0,15 ul </td><td> 9,00 ul </td></tr><tr><td> Única célula RT Enzyme Mix </td><td> 0,04 ul </td><td> 2,4 ul </td></tr><tr><td> Advablue (OAX04227) </td><td> 0,1 ul </td><td> 6,00 ul </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> tornar-se a 1 ul </td><td> fazer até 60 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Composição da RT master mix para RTPCR única célula (cat # OAX04515).

<ol>
	<li>Ohgaki, H., Kleihues, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+gliomas.">Epidemiology and etiology of gliomas.</a> Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).</li><li>Huse, J. T., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+brain+cancer:+advances+in+the+molecular+pathology+of+malignant+glioma.">Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma.</a> 10, 319 (2010).</li><li>Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+biology+of+brain+tumors.">The developmental biology of brain tumors.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).</li><li>Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821 (2003).</li><li>Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396 (2004).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1 (1996).</li><li>Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon.</a> Dev. Biol. 208, 166 (1999).</li><li>Yin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC133,+a+novel+marker+for+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 90, 5002 (1997).</li><li>Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC133-2,+a+novel+isoform+of+human+AC133+stem+cell+antigen.">AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen.</a> J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).</li><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414, 105 (2001).</li><li>Al-Hajj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat. Med. 3, 730 (1997).</li><li>Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clonogenic+multiple+myeloma+cells.">Characterization of clonogenic multiple myeloma cells.</a> Blood. 103, 2332 (2004).</li><li>Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+through+L1CAM+suppresses+glioma+growth.">Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth.</a> Cancer Res. 68, 6043 (2008).</li><li>Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756 (2006).</li><li>Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor.">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Res. 66, 7843 (2006).</li><li>Beier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+preferentially+depletes+cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma.</a> Cancer Res. 68, 5706 (2008).</li><li>Piccirillo, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+pools+of+cancer+stem-like+cells+coexist+within+human+glioblastomas+and+display+different+tumorigenicity+and+independent+genomic+evolution.">Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution.</a> Oncogene. 28, 1807 (2009).</li><li>Piccirillo, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells.">morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444, 761 (2006).</li><li>Rich, J. N., Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+and+cancer+stem+cells.">Chemotherapy and cancer stem cells.</a> Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).</li><li>Lapidot, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367, 645 (1994).</li><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414, 105 (2001).</li><li>Fuchs, E., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+a+new+lease+on+life.">Stem cells: a new lease on life.</a> Cell. 100, 143 (2000).</li><li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes.">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12, 4565 (1992).</li><li>Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sorting:+automated+separation+of+mammalian+cells+as+a+function+of+intracellular+fluorescence.">Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.</a> Science. 166, 747 (1969).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495 (1975).</li><li>Barrett, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+does+not+predict+tumor+growth+potential+in+mouse+models+of+high-grade+glioma.">Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma.</a> Cancer Cell. 21, 11 (2012).</li><li>Venugopal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+marks+intermediate+precursors+during+differentiation+of+human+brain+tumor+initiating+cells.">Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells.</a> Stem Cell Res. 8, 141 (2012).</li><li>Gerlinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).</li><li>Gilbertson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+signalling+a+change+in+treatment.">Medulloblastoma: signalling a change in treatment.</a> Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).</li><li>Zhu, Y., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+genetic+basis+of+neurological+tumours.">The molecular and genetic basis of neurological tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).</li><li>Maher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+genetics+and+biology+of+a+grave+matter.">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15, 1311 (2001).</li><li>Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+eukaryotic+gene+expression.">Noise in eukaryotic gene expression.</a> Nature. 422, 633 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297, 1183 (2002).</li><li>Maheshri, N., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+noisy+genes:+how+cells+function+reliably+with+inherent+variability+in+gene+expression.">Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).</li><li>Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4, e309 (2006).</li><li>Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+individual+genes+in+eukaryotic+cells+occurs+randomly+and+infrequently.">Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently.</a> Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).</li><li>Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).</li><li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR.">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O cancro da hipótese de células estaminais 10, com base no trabalho em leucemia 21, cancro da mama e cancro do cérebro 11 4,5, sugere que apenas uma fracção relativamente pequena de células do tumor, as células estaminais chamadas cancerosas, possuem a capacidade de proliferar e de auto extensivamente -renovar. A maioria das células tumorais perdem a capacidade de proliferar e de se auto-renovar como se diferenciam em células que se tornam a assinatura fenotípica do tumor. Loca...

Os tumores cerebrais estão entre os cânceres mais agressivos e heterogênea conhecidos em humanos. Embora a sua detecção precoce e diagnóstico ter sido facilitada pela tecnologia neuro-imagem moderna, ainda não temos terapias curativas para muitos tumores cerebrais, particularmente para difusas, as invasoras ou os localizados no fundo do cérebro. Os tumores cerebrais representam a principal causa de mortalidade por câncer em crianças devido à sua natureza altamente agressiva e muitas vezes incurável. Glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais comum em adultos, é um dos cancros mais agressivos humanos, temidos por seu prognóstico uniformemente fatal 1. Este tumor altamente maligno astrocitária (OMS grau 4) geralmente ocorre nos hemisférios cerebrais de adultos, e também pode ocorrer em crianças pequenas e bebês. Seu crescimento é rápido e infiltrativo, e de diagnóstico características patológicas incluem pleomorfismo nuclear, a proliferação microvascular e necrose 2,3. Para adulst com GBM recém-diagnosticado, a sobrevida média raramente se estende para além de 12 meses 1, com respostas geralmente pobres para todas as modalidades terapêuticas. Notamos que existem muitas similaridades funcionais e genéticos partilhados pelas células estaminais somáticas e células cancerosas, e que as vias moleculares que regulam o desenvolvimento normal do cérebro são frequentemente desregulado no cancro. Ao aplicar paradigmas estaminais biologia de células para o estudo de tumores no cérebro, que foram os primeiros investigadores a identificarem prospectivamente e purificar uma sub-população de células a partir de GBMs humanos, que exibiram as propriedades de células-tronco da proliferação, a auto-renovação e diferenciação in vitro e em quatro vivo 5. Nós aplicamos as condições de cultura e ensaios originalmente utilizados para caracterizar normais células-tronco neurais (NCCC) in vitro 6,7 para vários tumores cerebrais em crianças e adultos, e enriquecida para estas células-tronco, como por célula neural de classificação para o marcador de superfície de células progenitoras CD133 8 ,9. O CD133 + fração de tumor no cérebro continha células que tiveram uma freqüência muito maior de iniciação do tumor do que a fração CD133 em cérebros NOD-SCID 5,10 mouse. Este formalmente estabelecido que apenas um subconjunto raro de células de tumor cerebral com propriedades de células-tronco são o tumor de iniciação, eles ganham o nome de &quot;tumor cerebral iniciar células&quot; ou &quot;BTICs&quot;. A identificação romance de BTICs fornece novas pistas sobre a tumorigênese cérebro humano, dando um forte apoio para a hipótese de células-tronco do câncer 10-13 como base para muitos tumores sólidos, e estabelece um novo alvo celular para terapias mais eficazes de câncer 14-20. Terapias que se concentram em matar a maior parte do tumor podem perder a fracção haste-como rara, permitindo que o tumor continue a crescer. Terapias com foco em matar as células-tronco do câncer podem fornecer um melhor tratamento e prognóstico de pacientes com tumores cerebrais. A fim de estudar as populações BTIC, temos refinado nossa culture protocolos para selecionar especificamente para populações de células em tumores cerebrais humanos que possuem propriedades de células-tronco. Isento de soro, de células estaminais neurais (NSC) meio permite a manutenção de um estado indiferenciado de células estaminais, e a adição de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), e factor inibidor de leucemia (LIF), permite a proliferação de multi-potentes, de auto-renovação, e expansíveis tumorspheres humanos. Aqui, descrevemos os métodos envolvidos no processamento de tumores cerebrais primários e cultura los em NSC meio de enriquecer para populações BTIC. Chamamos nosso sistema modelo experimental &quot;isolados de pacientes BTIC&quot; para enfatizar o fato de que estas células são apenas minimamente cultivadas em tronco Condições de células à selecção de populações de células progenitoras. imunomarcação subsequente de populações BTIC para os marcadores de células-tronco-chave, tais como CD15 e CD133 e análise de citometria de fluxo é também descrito. Em seguida, discute a análise de diluição limitante,que ajuda no estudo do potencial de auto-renovação de BTICs. Finalmente, exploramos a análise da expressão do gene dessas células raras por triagem de células individuais em lâminas AmpliGrid e realizando única célula de RT-PCR. Estas técnicas são também aplicáveis ​​a outros tumores cerebrais, tais como meduloblastoma ependimoma e gliomas pediátricos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> Suplemento N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Wisent </td><td> 330-050 EL- </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A9165-25g </td></tr><tr><td> Neural sobrevivência fator -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> Fator de crescimento epidérmico (EGF) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> Factor inibidor de leucemia (LIF) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> Antibiótico / micótico </td><td> Wisent </td><td> 450-115 EL- </td></tr><tr><td> Liberase TM </td><td> Roche </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> Solução de cloreto de amónio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting

Os tumores cerebrais são tipicamente constituídos por células morfologicamente diferentes que expressam uma variedade de marcadores de linhagem neural. Apenas uma fracção relativamente pequena de células no tumor com propriedades de células estaminais, células cerebrais chamados de tumores de iniciação (BTICs), possuir uma capacidade de se diferenciar ao longo de várias linhagens, de auto-renovação e iniciar tumores in vivo. Aplicou-se as condições de cultura normais, inicialmente utilizadas para as células estaminais neurais (NSC) para uma variedade de tumores cerebrais humanos e verificou que este método de cultura, especificamente selecciona para a haste-como populações. Meio isento de soro (NSC) permite a manutenção de um estado indiferenciado de células estaminais, e a adição de bFGF e EGF permite a proliferação de multi-potentes, de auto-renovação e tumorspheres expansíveis. Para caracterizar adicionalmente população BTIC cada tumor, avaliamos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo. Podemos também classificar as populações de interesse para characteriz mais específicosção. A auto-renovação ensaios são realizados em BTICs individuais ordenadas em placas de 96 poços, a formação de tumorspheres após a incubação a 37 ° C, indica a presença de uma haste ou de células progenitoras. O número de células múltiplas de uma dada população podem ser classificados em diferentes poços para análise de diluição limitante, para analisar a capacidade de auto-renovação. Podemos também estudar a expressão diferencial de genes dentro de uma determinada população celular, utilizando células único de RT-PCR. Os protocolos que se seguem descrevem os processos para a dissociação e cultura de amostras humanas primárias para enriquecer as populações BTIC, bem como a dissociao de tumorspheres. Também incluídos estão os protocolos para coloração por análise de citometria de fluxo ou triagem, a auto-renovação ensaios e única célula de RT-PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting at JoVE.com

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

A identificação de células de tumor cerebral de iniciação (BTICs), as células raras dentro de uma heterogeneidade de tumores que possuem propriedades de células-tronco, fornece novas pistas sobre patogénese humana de tumor cerebral. Temos refinado condições específicas de cultura para enriquecer para BTICs, e usam rotineiramente citometria de fluxo para enriquecer ainda mais essas populações. A auto-renovação e ensaios de análise por transcrição única célula de RT-PCR pode ser realizada posteriormente nestas células isoladas.

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

processing-primary-brain-tumor-tissue-for-stem-cell-assays-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

17.9K visualizações.  McMaster University. A identificação de células de tumor cerebral de iniciação (BTICs), as células raras dentro de uma heterogeneidade de tumores que possuem propriedades de células-tronco, fornece novas pistas sobre patogénese humana de tumor cerebral. Temos refinado condições específicas de cultura para enriquecer para BTICs, e usam rotineiramente citometria de fluxo para enriquecer ainda mais essas populações. A auto-renovação e ensaios de análise por transcrição única c...

Vídeo: Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Medicina

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Estratégias de amostragem e processamento de amostras de tecido do Biobanco de suínos modelos biomédicos

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...