Este trabalho foi financiado pelo neurônio-ERANET descobrir (BMBF 01EW1003) para CK e JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) para CKVB é suportado por uma concessão do Forschungskommission da Faculdade de Medicina da Universidade de Düsseldorf.

1. Preparação de células doadoras Aggresome: transfecção de proteína monomérica Vermelho Fluorescente (MRFP) ou proteína verde fluorescente melhorada (EGFP)-marcado Comprimento Humanos completa (FL) DISC1 <ol><li> Semente de 1,5 x 10 6/10 cm prato neuroblastoma humano NLF (NLF; Hospital Infantil da Filadélfia, Philadelphia, PA) células em 10 placas de 10 cm e crescer durante a noite. Células NLF são cultivadas em RPMI-1640 suplementado com FBS 10%, penicilina / Strepomycin, L-Glutamina. No dia seguinte, as células devem estar a 70-80% de confluência. </li><li> Transfectar transitoriamente cada prato de 10 cm com 15 ug de DNA de plasmídeo e o reagente de transfecção Metafectene (Biontex, Martinsried, Alemanha). Em resumo, para um prato de 10 cm, 15 ug de ADN plasmídico e 30 Metafectene ul foram adicionados a 750 ul de Opti-MEM, misturadas e incubadas à temperatura ambiente durante 20 min. 5 pratos foram transfectadas com pcDNA3.1 MRFP / eGFP-tagged humanos (FL) Disc1 e 5 pratos com a sós eGFP-plasmídeo. </li></ol> 2. AggresomeA purificação a partir de células do doador Transfectadas O protocolo aqui descrito é uma combinação de um método para purificar-Lewy Bodies a partir de tecido cerebral 13 e um protocolo para isolar grandes agregados e aggresomes 14. Uma vez que os métodos já existentes baseiam-se no uso de detergentes, o isolamento de detergente livre de proteínas para a aplicação em ensaios de células-invasividade é crítica. <ol><li> 48 h após a transfecção, monitorizar a expressão de eGFP e mRFP/eGFP-DISC1 e confirme a formação de aggresomes sob um microscópio de fluorescência (Figura 1). </li><li> Lavar as células com PBS, pH 7,4, com 400 scrape ul de PBS cada, adicionar cocktail inibidor 1X Protease (Roche, Indianapolis, IN) e romper as células utilizando um homogeneizador Precellys24 (Bertin tecnologias, França). Resumidamente, adicionar 1 ml de suspensão de células para um tubo de lise 2 ml e adicionar 10 contas de cerâmica. Lisar as células com 3 x 60 pulsos seg. A força mecânica do processo podeaumentar a temperatura no interior da amostra acima de 37 ° C de modo deve ser tomado cuidado para refrigerar a amostra em gelo, após o procedimento de lise. </li><li> Arrefecer as células sobre gelo e adicionam-se 10 mM de MgCl 2, 40 U / ml de ADNase A e incubar durante 60 min a 37 ° C </li><li> Preparam-se soluções de 80%, 50%, sacarose a 20% (w / v) em PBS pH 7,4 (10 ml cada). </li><li> Preparar o gradiente de sacarose em 15 ml de tubo falcon, começando com 2 ml de sacarose a 80%, seguido de 50% e 20%. Despeje o gradiente devagar e ter cuidado para não perturbar as camadas já derramadas. Camada do ligado digerido no topo do gradiente e centrifugar durante 15 minutos a 1000 xg, a 4 ° C. </li><li> Recolher cuidadosamente a interfase entre a camada de sacarose a 50-80% com uma pipeta e misture com 5 volumes de PBS, pH 7,4. Centrifugar durante 15 minutos a 1000 xg, a 4 ° C. Repetir a lavagem duas vezes. Neste interfase, aggresomes são fluorescentes e podem ser visualizadas ao microscópio sob luz UV. </li><li> Descartar o sobrenadante eressuspender o sedimento em 250-500 ul de PBS pH 7,4. Este pellet contém o aggresomes purificado (Figura 2). </li></ol> 3. Tratamento de destinatário SH-Sy5y Células com mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Semente de 5 x 10 4 receptoras SH-Sy5y células de neuroblastoma humano constitutivamente expressando GFP-DISC1 (598-854), em lamelas de vidro estéreis em cada poço de uma placa de 24 poços. SH-Sy5y células são cultivadas em meio suplementado com DMEM/F-12 de penicilina / estreptomicina e não-aminoácidos essenciais (NEAA) e FBS a 10%. </li><li> 24 horas mais tarde, adicionam-se 10 ul a cada poço e incubar durante 48-72 horas. </li><li> Lavar as células 3 x com PBS pH 7,4 e extinguir a fluorescência extracelular com 0,04% de azul de tripano durante 5 min. </li><li> Fixar as células com PFA a 4% em PBS, pH 7,4, durante 10 min em gelo, lava-se uma vez com H2O estéril e montar as lamelas sobre lâminas de vidro com prolongar ouro com DAPI meio de montagem (Invitrogen, EUA). </li><li> Confirme a captação /invasão de exogenamente aggresomes aplicadas pela co-localização com proteínas recrutados expressas por células receptoras no Z-stack imagens. </li></ol> No entanto, a absorção / invasão de proteína exógena pode não ser detectada essencialmente em paralelo com o recrutamento de proteínas da célula hospedeira. No nosso exemplo MRFP-tagged DISC1 aggresomes recruta solúvel GFP-tagged DISC1 (598-854) da proteína expressa pela célula hospedeira (ver Figura 3). Fotos foram tiradas em um LSM Zeiss 510 a Zeiss confocal ou Axiovision Microscópio Apotome2. 4. Geração de DISC1 recombinante (598-785) Numa publicação anterior, foi analisada a capacidade de vários fragmentos de proteína Disc1 a auto-interagir com base na presença de auto-associação de domínios. Entre todos os fragmentos de proteína testada humano DISC1 (598-785) mostrada a propensão mais forte multimerização 4 (Figura 4). Portanto, DISC1 humana (598-785) foi clonado em pET15b (nVagen, Madison, Wisconsin), contendo um grupo N-terminal 6 histidina-tag, expressa em E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, EUA), e purificada em condições desnaturantes em ureia 8 mol / l, como descrito 4. Em resumo, o protocolo é descrito a seguir. <ol><li> BL21-(ide3) Rosetta E. coli foram cultivadas em 2 x 500 ml, contendo 5 mM de 2YT-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 mg / ml carbencillin, 35 ug / ml de cloranfenicol até uma OD 600: 0,6-0,8 e DISC1 (598-785) a expressão foi induzida com IPTG 1 mM. </li><li> DISC1 (598-785) foi expresso durante 4 hr a 37 ° C, a expressão foi terminada pela colheita das bactérias por centrifugação. </li><li> O sedimento bacteriano foi ressuspenso em 50 ml de tampão TE (50 mM de TRIS-HCl pH 8,0, EDTA 5 mM) mais 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM de MgCl2 e 400 ml U/50 DNase I. A fim de garantir uma lise completa, a mistura reaccional foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Adicionar 10 mM β-mercaptoethanol (ME) e 500 mM de NaCl, e incubar durante mais 30 minutos. </li><li> Girar corpos de inclusão bacterianos em 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o granulado em 50 ml de tampão de extracção contendo 50 mM de Tris pH 8,0, 5 mM de imidazole, 500 mM NaCl, ureia 8 M e 10 mM β-ME e remover detritos por centrifugação a 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lava-se a Ni-NTA agarose matriz com tampão de extracção. Incubar o sedimento, o extracto de proteína precleared com matriz de Ni-NTA durante 2 h à RT. </li><li> Lava-se a matriz de Ni-NTA, com tampão de extracção contendo 12 mM de imidazole. </li><li> Eluir a proteína lentamente com 15 ml de tampão de eluição contendo 50 mM de Tris, 500 mM NaCl, 300 mM de imidazole, 8 M de ureia, 1 mM PMSF, 5 mM de EDTA e 10 mM β-ME. </li><li> Dialisar a proteína de passo a passo para PBS pH 7,4 contendo 10 mM de β-ME. </li></ol> A partir de 1 L de cultura bacteriana de partida, é possível isolar-se a 50 mg de DISC1 recombinante (598-785) protein. α-sinucleína redobragem Para experiências com α-sinucleína, 500 ug da proteína recombinante (Sigma-Aldrich, EUA) foi dissolvido em PBS a uma concentração de 1 mg / ml. Para obter oligómeros, a redobragem foi realizada durante a noite a 37 ° C, tal como descrito numa publicação anterior 10. 5. Rotulagem de DISC1 recombinante (598-785) com DyLight594 <ol><li> Antes do processo de marcação posterior, DISC1 (598-785) proteína tem a ser libertado de β-ME. Portanto, a proteína é dialisada três vezes com PBS pH 7,4 a uma diluição de 1:2000. </li><li> Etiqueta de 1 mg DISC1 (598-785) com maleimida DyLight 594 (Thermo Scientific, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Em suma, dissolver 1 mg / ml de proteína em PBS pH 7,4 e adicionam-se 5 mM TCEP para recuperar grupos tiol livres. Adicionar 20 ul de corante dissolvido DMF à mistura reaccional e incuba-se durante 2 h à RT. </li><li> Dialisar a proteína de 3 x de PBS pH7,4 a uma razão de 1:2000, durante 2 horas cada. </li></ol> Para aumentar ainda mais a pureza da proteína marcada a sua 6-tag de afinidade baseada purificação sobre uma coluna de Ni-NTA é executada. <ol start="4"><li> Lavar 1 ml de Ni-NTA de matriz (Qiagen, Alemanha) com 10 ml de PBS pH 7,4. </li><li> Aplicar a proteína marcada, dialisado para a coluna e deixá-lo funcionar lentamente ao longo da coluna. </li><li> Lava-se a proteína com 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 </li><li> Eluir a proteína com PBS pH 7,4, 500 mM de imidazole, gota a gota enquanto se monitorizava a banda colorida na coluna de Ni-NTA para reduzir o volume de eluato. </li><li> Dialisar o eluato a 3 x 10 mM NaPi pH 7,4 a uma diluição de 1:2000, durante 2 horas cada. </li><li> Use uma seringa estéril 0,45 uM de filtro para filtrar o eluato, alíquota de 5 x 100 uL de amostras de encaixe e congelar em azoto líquido. A quantidade total de proteína deve ser 0,5-1 mg / ml, em cada alíquota de 100 ul. </li></ol> Concentr opcionalção passo <ol start="10"><li> Para injecções de rato stereotactical, a proteína foi concentrada 10 vezes num speed-vac (Concentrador de Eppendorf 5301). A condição de tampão final foi de 100 mM de NaPi. </li></ol> α-sinucleína Labeling A rotulagem e purificação (coluna de Ni-NTA), do recombinante α-sinucleína foi realizada em paralelo com DISC1 (598-785). O total de material de partida foi 500 ug em vez de 1 mg por DISC1 (598-785). 6. Tratamento de destinatário SH-Sy5y Células com rotulada DISC1 recombinante (598-785) Proteína <ol><li> Semente 5x10 4 receptor SH-Sy5y células de neuroblastoma humano constitutivamente expressando GFP-DISC1 (598-854), em lamelas de vidro estéreis em cada poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Adicionar proteína marcada para o meio de cultura celular numa concentração de 5-10 ug / ml e incubar durante 48-72 horas. </li><li> Lavar as células 3 x com PBS pH 7,4 e extinguir extracçãofluorescência ellular com 0,04% de azul de tripano durante 5 min. </li><li> Fixar as células com PFA a 4% em PBS, pH 7,4, durante 10 min em gelo, lava-se uma vez com H2O estéril e montar as lamelas sobre lâminas de vidro com prolongar ouro com DAPI meio de montagem (Invitrogen, EUA). </li><li> Confirme a captação / invasão de exógena aplicada proteína recombinante por co-localização com proteínas recrutados expressas por células receptoras no Z-stack imagens geradas por laser microscopia confocal. No entanto, o recrutamento de proteína endógena pode não ser detectada, essencialmente em paralelo com a invasão de proteína da célula hospedeira, Z-stack imagens pode ainda confirmar a natureza invasiva da proteína. </li></ol> No nosso exemplo, rec. DISC1 (598-785) * pelo menos em parte solúvel recrutas GFP-tagged DISC1 (598-854) da proteína expressa pela célula hospedeira (ver Figura 5A). Para recombinante invasão α-sinucleína, mas não o recrutamento é mostrado (Figura 5B). Fotos foram tiradasnum Zeiss LSM 510 confocal ou um microscópio Zeiss Axiovision Apotome2. A injecção do concentrado (ca. 4 ul de 2,5 ug / uL), rotulada DISC1 (598-785) * para os resultados CPFm na difusão da proteína em volta do local de injecção, que pode ser detectada mesmo após a perfusão dos animais com 4% PFA em PBS, pH 7,4, com uma filterset rodamina. No nosso exemplo DISC1 (598-785) é ocupada por um número diferente de neurónios e pode ser monitorizado com Z-stack de imagem (Figura 6). Em geral, a injecção de outras proteínas, em seguida, os usados ​​aqui não conduzem necessariamente a invasão celular. O evento de invasão é essencialmente dependente da natureza da proteína, não obstante uma purificação limpa é um pré-requisito para análise posterior. 7. Resultados representativos Aggresomes recombinante consistindo de DISC1-eGFP FL purificada a partir de células invadidas NLF destinatário SH-Sy5y cells em baixa eficiência (cerca de 0,3 a 5%), como visto por co-localização com microscopia confocal (Figura 3). Como relatado anteriormente, DISC1 (598-785) expressa e purificada a partir de E. coli formadas multímeros 4 foram igualmente célula-invasiva com uma eficiência de aproximadamente 20% 5 (Figura 5A), semelhante ao de α-sinucleína, que foi utilizado em paralelo, como controlo positivo (Figura 5B). Rotulado DISC1 recombinante (598-785) expressa e purificada a partir de E. coli foi também célula-invasivo para neurónios in vivo, quando a proteína multimérica foi estereotaxicamente injectados no córtex pré-frontal de um rato (Figura 6; Pum, Bader, Huston, Korth, não publicado). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Células de neuroblastoma que expressam transitoriamente NLF FP-DISC1 (vermelho). Red aggresomes fluorescentes pode ser deteCTED dentro das células. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Purificada MRFP-tagged Disc1 aggresomes após a purificação em gradiente de sacarose. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagem fluorescente de aggresomes invadidas. MRFP-tagged flDISC1 aggresomes foram purificados e incubados com as células de neuroblastoma SH-Sy5y overexpressing solúvel GFP-tagged DISC1 (598-854). Uma absorção de aggresomes rotulados é monitorado por Z-pilha de imagens em um microscópio Laser-Scan (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. SEC-perfil de rec. DISC1 (598-785), contendo o S704 e os C704 polimorfismos de nucleotídeo único (SNP). Ambas as variantes apresentam uma ruptura de oligomerização e ordenou a formação de alto peso molecular multIMers (seta vermelha). Esta imagem é modificada a partir da publicação do Leliveld et al., Bioquímica 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Imagem Z-stack Fluorescente de invasivo DISC1 DyLight marcado recombinante (598-785). As células de neuroblastoma SH-Sy5y expressando GFP-DISC1 solúvel (598-854) foram incubadas com etiquetado, a proteína recombinante a uma concentração de 5 ug / ml. (A) agregados vermelha mostra a invasão de rec. DISC1 proteína (598-785) e pontos amarelos indicam um recrutamento de GFP-DISC1 solúvel (598-854) em agregados. (B) recombinante α-sinucleína (vermelho) invade as células sem recrutamento, com uma frequência de cerca de 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura figura 6. Imunofluorescência dea injectado rotulado DISC1, recombinante (598-785) da proteína. Z-stack de imagem confirma a presença de rec. DISC1 proteína (598-785), em neurónios corticais de rato coradas com um anticorpo contra núcleos neuronal (NeuN, verde).

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Não há conflitos de interesse declarados.

Neste estudo, descrevemos a purificação de mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes a partir de uma linha celular transfectada neuroblastoma, a preparação e marcação de uma espécie de proteínas recombinantes Disc1 e sua aplicação na célula-invasão de células receptoras experiências in vitro e in vivo. A purificação dos nativos mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes foi desenvolvido a partir de protocolos para isolar o corpo de Lewy estruturas semelhantes e agregados maiores 13, 14, mas modificada para evitar a utilização de detergentes e de minimizar o risco de falso positivo invasão celular, que pode ocorrer devido ao detergente facilitada a penetração da membrana. Uma melhoria possível futuro poderia ser o de aumentar ainda mais o grau de pureza dos aggresomes por sonicação para separar completamente as membranas remanescentes e do citoesqueleto dos aggresomes. Ao aumentar a pureza total, o número de eventos de invasão totais do registado para grande aggresomes may ser aumentado 5. Se a definição limitada do nosso sugerido sacarose de 3 fases seja suficiente para aggresomes de espécies outra proteína deve ser testado, neste sentido, o protocolo descrito aqui deve ser considerada como um ponto de partida para a optimização individual. Os aggresomes purificados provaram ser bastante robusta nas nossas mãos, os passos de lavagem adicionais (sem detergente) para eliminar vestígios de sacarose não reduzem significativamente o rendimento global. Numa publicação anterior, descrevemos que a montagem de oligómero de DISC1 é dependente de multimerização domínios distintos na extremidade C-4 (Figura 4). Nós escolhemos este fragmento de expressão recombinante solúvel em E. coli e subsequentes e Ni-NTA purificação. Para controlar a sua multimerização e para comparar a sua capacidade de invasão das células com uma proteína de célula descrita invasivo como α-sinucleína, que rotulado DISC1 (598-785) com o corante fluorescente DyLight594, e sua comparaçãoinvasividade de células-com a do igualmente marcado α-sinucleína. A célula de capacidade de invasão do fragmento DISC1 recombinante foi dramaticamente aumentada em comparação com a de comprimento, nativa total Disc1 aggresomes, provavelmente devido ao seu menor tamanho e pureza muito mais elevada. Mais uma vez, a pureza parece desempenhar um papel decisivo na célula invasão. Em nosso exemplo, os aggresomes invasivos recrutados proteína solúvel homólogo da linha de células alvo de forma recombinante, que foi expressa num solúvel, forma celular disperso ie. A expressão de uma proteína fluorescente (por exemplo, GFP ou RFP) na linha de célula receptora é uma vantagem uma vez que permite a co-localização de aggresomes invasivos e proteínas recombinantes dentro do limite da célula receptora através de Z-stack de imagem. Aggresomes células invasivas Disc1 e fragmentos multiméricas expressas e purificadas a partir de E. coli pode ser uma característica definidora de uma proteína de conformação doenças relacionadas com DISC1, DISC1opathies 15. Resolução de problemas: Rendimento aggresome baixo após purificação em gradiente de sacarose: O gradiente de sacarose apresentou neste protocolo funciona bem com eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes consistindo de outras proteínas podem ser de dimensões variáveis, por conseguinte, as concentrações de sacarose deve ser optimizada por outros utilizadores. Purificação insuficiente de proteínas recombinantes: Quaisquer contaminantes bacterianos no processo de purificação da proteína recombinante também será rotulada em passos posteriores do protocolo. Para evitar a contaminação, executar a proteína em um SDS-PAGE e confirmar que a proteína recombinante é de pelo menos 95% de pureza por coloração com Coomassie-Blue. Para assegurar a mais alta qualidade e rendimento, o protocolo tem de ser otimizado para cada proteína individual. Baixa rotulagem efência de proteínas recombinantes: Quaisquer contaminações que contêm grupos SH livres irá diminuir rotulagem eficiente da proteína. Por conseguinte, a diálise extensa e Ni-NTA de purificação baseado é obrigatório.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Médio é dependente da linha celular hospedeira. A linha celular óptima destinatário deve ser determinada pelo utilizador. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Médio é dependente da linha celular do destinatário. A linha celular óptima destinatário deve ser determinada pelo utilizador. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Outros reagentes de transfecção pode funcionar tão bem, mas não foram testadas com nosso protocolo. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Os experimentos foram realizados com Ni_NTA agarose da Qiagen, outros fornecedores devem funcionar tão bem. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Não há necessidade de uma RNase livre de DNase no processo de purificação aggresomes. </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Meio isento de soro funciona tão bem </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Suplemento SH-Sy5y e médio NLF </td></tr><tr><td> Não essencial-amino-ácidos (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Suplemento SH-Sy5y médio </td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Reagente tóxico </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 46608 </td><td> Reduzido corante reactivo de cisteína para formar ligações tioéter estáveis. Também disponível em outras cores. </td></tr><tr><td> Prolongar ouro com DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Esta montagem líquido Antifade deu resultados superiores em nossas mãos. </td></tr><tr><td> Cocktail inibidor da protease; </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Dissolve-se 1 em 500 ul de tabela H 2 O para solução 100X. </td></tr><tr><td> Sintética a-sinucleína </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Redobragem tal como descrito no texto. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela de reagentes específicos. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Nós não testamos homo mecânico outronizers outros do que isso. Outros detergente método de homogeneização livre pode funcionar tão bem, mas não foram testados para esse protocolo. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrador (SpeedVac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Apenas necessária se a proteína tem de ser concentrado. </td></tr><tr><td> LSM 510 e Axiovision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Veja o catálogo fabricantes </td><td> Os dois microscópios abrigar a capacidade de executar Z-stack imagens. Este é um pré-requisito para a avaliação sólido e grave de eventos de invasão. </td></tr><tr><td> Célula de material plástico de cultura </td><td> Nunc </td><td> Placas de 10 cm # 172958, placas de 24 poços # 142475 </td><td> O uso de material plástico diferente pode influenciar a interacção de proteínas recombinantes ou aggresomes e as superfícies de plástico. Nós não testamos outros materiais que não os descritos aqui. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela de material específico e equipamentos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Número </td><td> Nome tampão </td><td> conteúdo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Meio de crescimento bacteriano </td><td> 16 g / l de Bacto triptona 10 g / l de extracto de levedura Bacto, 5 g / l de NaCl, 5 mM-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 mg / ml carbencillin, 35 ug / ml de cloranfenicol </td><td> Crescer as bactérias a OD 600: 0,6-0,8 induzir a expressão com IPTG 1 mM. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Tampão de ressuspensão bacteriana </td><td> 50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM de MgCl2 e 400 ml de ADNase I U/50 </td><td> Resuspender sedimento bacteriano a partir de 1 L overnight cultura em 50 ml de tampão de ressuspensão. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Tampão de extracção de proteínas </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM de imidazole, 500 mM NaCl, ureia 8 M e 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA de coluna de tampão de lavagem </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM de imidazole, 500 mM NaCl, ureia 8 M e 10 mM b-ME, 12 mM de imidazole </td><td> Tampão de extracção modificado com imidazole 12 mM adicionado. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA de tampão de eluição em coluna </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM de imidazole, 8 M de ureia, 1 mM PMSF, 5 mM de EDTA e 10 mM b-ME </td><td> O tampão de eluição contém 10 mM b-ME, o qual é depois dialisada. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l de NaCl, 0,2 g / l de KCl, 1,44 g / l de Na 2 HPO 4, 0,24 g / l KH 2 PO 4, ajustar a pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Rotulagem tampão </td><td> PBS contendo 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabela de receitas. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

Agregação de proteínas é visto como uma característica geral de crónicas, doenças cerebrais degenerativas, como, por exemplo, nas doenças neurodegenerativas doença de Alzheimer (Ap, tau), a doença de Parkinson (α-sinucleína), doença de Huntington (poliglutamina, huntingtina), e outros. Agregação de proteínas é pensado para ocorrer devido a proteostasis perturbado, ou seja, o desequilíbrio entre o surgimento e degradação de proteínas deformadas. É de notar que as mesmas proteínas são encontradas em formas agregadas esporádicos destas doenças, que são mutantes em variantes raros de formas familiares. A esquizofrenia é uma doença cerebral progressiva crónica que, em muitos casos vai junto com um défice cognitivo permanente e irreversível. Numa abordagem de gene candidato, foi investigado se Disrupted-in-1 esquizofrenia (DISC1), um gene clonado de uma família escocesa com ligação à doença mental crónica 1, 2, podem ser encontrados na forma de agregados insolúveis no brain de casos esporádicos de esquizofrenia 3. Usando o CC SMRI, identificou em aproximadamente 20% dos casos com CMD mas não controlos normais ou pacientes com doenças neurodegenerativas imunorreactividade DISC1 sarcosil insolúvel após fraccionamento bioquímico. Estudos posteriores, in vitro revelaram que a propensão a agregação de DISC1 foi influenciado pela doença associada à polimorfismo S704C 4, e que Disc1 aggresomes gerados in vitro de células-invasiva foram 5, semelhante ao que tinha sido mostrado para Ap 6, tau 7-9, α -sinucleína 10, polyglutamine 11, ou SOD1 agregados 12. Estas constatações levaram-nos a propor que pelo menos um subconjunto de casos de CMD, aqueles com DISC1 agregado podem ser doenças conformacionais da proteína. Aqui descrevemos como gerar Disc1 aggresomes em células de mamíferos, purificá-los em um gradiente de sacarose e usá-los para invasão de células-studies. Da mesma forma, nós descrevemos como gerar um exclusivamente multimérica C-terminal DISC1 fragmento de etiqueta, e purificá-la para estudos invasividade celular. Usando os multímeros recombinantes de DISC1 conseguimos invasividade celular semelhante como para um fragmento marcado de forma semelhante α-sinucleína sintético. Além disso, mostramos que este fragmento é absorvido in vivo, quando injectados estereotaxicamente no cérebro de animais receptores.

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Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

A geração de purificação, e invasão de células citoplasmáticos intracelulares, a todo o comprimento aggresomes Disc1 proteínas a partir de culturas de células e de um fragmento de proteína marcada, multimérica recombinante em DISC1<em&gt; E. coli</em&gt; São descritos. Invasividade celular é mostrado para células receptoras em cultura de células e para os neurónios<em&gt; In vivo</em&gt; Após a inoculação cérebro stereotactical.

Geração, purificação, caracterização e de Cell-invasivos espécies de proteína Disc1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K visualizações.  Medical School Düsseldorf, Germany. A geração de purificação, e invasão de células citoplasmáticos intracelulares, a todo o comprimento aggresomes Disc1 proteínas a partir de culturas de células e de um fragmento de proteína marcada, multimérica recombinante em DISC1 E. coli São descritos. Invasividade celular é mostrado para células receptoras em cultura de células e para os neurónios In vivo Após a inoculação cérebro stereotactical.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...