Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Programa de Investigação intramuros do NIH, Instituto Nacional do Câncer, o Centro para Pesquisa do Câncer; Acordo Collaborative Research entre NCI e Calidris Therapeutics; American Cancer Society concessão IRG 97-152-17 de OT, e verbas federais a partir do National Cancer Institute, NIH, sob contrato HHSN26120080001E.

1. Preparação de lisado celular Este protocolo destina-se a células aderentes que expressam qualquer proteína GFP fundida. O número de células necessário pode variar de tão baixo quanto 6 a 10 até 20 x 10 6 células, dependendo do nível de expressão da proteína. Por exemplo, lisado de células HEK-sobre-expressam GFP STAT3 foi preparado por tratamento de células crescidas em frascos T75 10 a cerca de 70% de confluência com 1 ml de tampão de lise. No entanto, este lisado teve de ser diluída 150 vezes para fornecer um nível óptimo de fluorescência para o experimento de MST. Protocolo de lise celular depende fortemente das propriedades e localização intracelular da proteína em estudo. Se o uso de detergentes é indesejável devido à instabilidade da proteína, sonicação descrito abaixo, pode ser a melhor escolha. Diferentes aditivos podem ser adicionados ao tampão de lise para evitar as reacções de modificação da proteína: EDTA evita a fosforilação, vanadato de sódio inibe a proteína tirosina fosfatases, de modofluoreto de sódio é um inibidor de Ser / Tre fosfatases. <ol><li> Preparar tampão de lise. For-a-extraem fáceis proteínas citoplasmáticas a composição seguinte funciona bem: 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, mistura de inibidores de protease e diluiu-se 100 vezes (P2714 Sigma-Aldrich, consistindo de AEBSF 2 mM, 0,3 uM de aprotinina, bestatina 130 | iM, EDTA 1 mM, 14 fiM de E-64, 1 mM leupeptina). Alternativamente, as proteínas solúveis menos, pode-se utilizar tampão RIPA comercial, com inibidores de protease e cocktail de detergentes não desnaturantes. Manter o tampão em gelo. </li><li> Lave as células brevemente com PBS gelado utilizando 10 ml de tampão por frasco T75. Manter as células em gelo durante 5 minutos, ou até que as células começam a retirar do frasco. Raspe as células com raspador de células para retirar, se necessário. </li><li> Ressuspender as células em 10 ml PBS gelado e transferir para um tubo de 14 ml prechilled centrífuga de fundo redondo. </li><li> Células por centrifugação a 400-600 xg a 4 ° C durante 5 min. Combine as células de vários frascos, neste ponto if necessário. </li><li> Remover PBS sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 ul de tampão de lise arrefecido com gelo, transferindo a suspensão para um pré arrefecida tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Manter as células em gelo para minimizar o sobreaquecimento local. Lisar as células com 3x 10 segundos pulsos de sonicação a 30% da amplitude, usando um 2-3 mm ponta pré-refrigerados. Mantenha a ponta abaixo da superfície para minimizar a formação de espuma. Omitir este passo quando se utiliza detergente contendo tampão e incubar em gelo durante 30 min em vez disso. </li><li> Corrigir a solução lisado para conter a concentração de sal fisiológica (NaCl 100 mM), se necessário, utilizando-se 5 M de NaCl. </li><li> Recolhe lisados ​​por centrifugação a cerca de 26.000 x g a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Determinar o lisado diluição óptima (tal como descrito na secção 3 a seguir) e da quantidade de lisado necessário para uma titulação (tipicamente cerca de 300 ul de lisado de pré-diluída). </li><li> Alíquotas do ligado e armazenar a temperatura adequada para a proteína em estudo (-80 ° C, na maioria dos casos). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Seleção tampão MST e Preparação <ol><li> Uma vez que as interacções proteína-ligando são dependentes de condições de tampão, a composição do tampão MST é escolhido com base nas propriedades de um sistema particular. É geralmente vantajoso para testar pelo menos dois buffers diferentes. </li><li> Prepare dois buffers MST 5x. Tivemos boas experiências com estas duas composições: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl2, 500 mM de NaCl, 0,25% de NP-40) e Tris-HCl (250 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 750 mM, 50 MgCl 2 mM, 0,05% de Tween-20). A adição de BSA (5% na mistura final vinculativa) pode ajudar a prevenir a adesão de proteínas para tubos de plástico e de vidro capilares. NaN 3 (0,5 mM), também podem ser incluídos para evitar o crescimento de microorganismos. </li></ol> 3. Determinação da diluição óptima Lysate <ol><li> Seleccione a fonte de excitação de LED com comprimento de onda = 470 nm λ no instrumento MST. </li><li> Carregar capilares com o cevai extrair diluído 2 e 10x com tampão MST. </li><li> Execute &quot;Encontre Capilares&quot; Operação em software de controle de instrumento MST. A gama óptima de fluorescência em lisado é diluído entre 400 e 1500 unidades de fluorescência. </li></ol> 4. Determinação da Gama óptima concentração de ligando <ol><li> A concentração mais elevada do ligando deveria ser pelo menos 20x maior que a constante de dissociação esperado. </li><li> A menor concentração de ligando deve ser mais baixa do que a concentração molar da proteína fluorescente. </li></ol> Consulte a ferramenta Localizador Concentration Technologies NanoTemper para o ligante estimativa faixa de concentração. 5. Preparação de lisado celular e as diluições do ligando <ol><li> Colocar uma armação de tubo com um número necessário (geralmente 10-16) de 0,5 ml em tubos de centrifugação LoBind gelo. Pipetar 25 ul de tampão de MST para a parte inferior de cada tubo. Adicionar 25 ul da solução de estoque de ligando para a primeira cubae (# 1, a concentração de ligando mais elevada) e efectuar a diluição em série de duas vezes do ligando utilizando o resto dos tubos. Mantenha o rack com amostras de ligante no gelo. </li><li> Célula Thaw lisado lentamente no gelo. </li><li> Diluir o lisado celular com tampão de MST para fornecer o nível óptimo da proteína alvo fluorescente nas reacções de ligação. Concentração final de proteína deve ser perto de esperada K D ou inferior. Deve ser ajustado para se obter o número necessário de contagens de fluorescência na solução final. Para a determinação da concentração de GFP-STAT3 no ligado, o instrumento foi calibrado com uma ajuda de fluoresceína. A concentração molar de GFP no ligado foi determinada utilizando a relação de fluoresceína e rendimentos quânticos de EGFP, 0,85 e 0,61, respectivamente, 15. </li></ol> 6. Microescala termoforese Estudos Encadernação <ol><li> Selecione a fonte de excitação LED com λ = 470 nm sobre o instrumento MST. </li><li> Colocar 0,5 ml tubos LoBind na tube prateleira em frente tubos com amostras de ligante de diluição em série. Adicionar cuidadosamente 15 mL do lisado de células para a parte inferior de cada tubo. Tente não tocar as paredes do tubo para evitar a perda de amostra. </li><li> Adicionam-se 15 ul da amostra do ligando com a maior concentração (# 1) para o tubo correspondente # 1 com o ligado de células. Misture bem e mudar a ponta da pipeta. Repetir este passo com o resto dos tubos, excepto para a última, que deve conter nenhum ligando. </li><li> Adicionar 15 ul de tampão de MST para o último tubo e misturar bem. </li><li> Encha cerca de 2/3 do primeiro capilar com a mistura de ligação de tubo # 1, incliná-la para mover a solução para o centro, e colocar o tubo capilar sobre a bandeja capilar para a posição # 1 (na posição mais próxima da abertura da bandeja) . Repita este passo com o resto capilares. Extremidades capilares pode ser conectado com cera para experimentos mais longos. </li><li> Coloque a bandeja dentro do instrumento MST e fechar a porta do instrumento. </li><li> Execute &quot;Encontre Capilares&quot;de comando para permitir que o instrumento encontrar posições exactas dos capilares e medir a fluorescência das amostras. </li><li> Com base na intensidade do sinal de fluorescência, ajustar o LED (10-100%) a fim de o intervalo de unidades 400-1,500. </li><li> Clique no botão &quot;Iniciar&quot; para executar o experimento termoforese. Mais do que uma fonte de laser de infravermelho podem ser escolhidos para a experiência, a fim de encontrar o gradiente de temperatura óptima para o sistema particular. Recolha de dados 2-3 funcionamentos para o mesmo conjunto de capilares para assegurar a reprodutibilidade das medições. Leva 10-12 min para executar um conjunto de 16 capilares. </li></ol> 7. Microescala termoforese Análise de Dados <ol><li> Abra o software de análise. </li><li> Coloque a pasta do projeto. Nas Informações apareceu Run Visualizador selecionar coletadas em curvas específicas IR laser do poder thermophoretic. Existe uma opção de abrir todos os vestígios recolhidos thermophoretic sob várias condições, tais como a potência do laser IR, LED power, temperatura, concentração, etc. de uma vez e, em seguida, escolher todas as curvas para análise trocando-os dentro e fora (clique no nome do experimento). </li><li> Na janela do gráfico de Pontos de Avaliação, selecione o termoforese ou termoforese com T-jump. Certifique-se de que as linhas azul e vermelha estão posicionados corretamente. Para obter os pontos médios com desvios-padrão, selecione &quot;Usar Média&quot; ou &quot;Distinguir corre&quot; para ensaios separados. </li><li> Para traçar um ajuste constante de dissociação, selecione &quot;Usar média&quot;, introduza e fixe o valor de concentração molécula marcada (marque a opção &quot;concentração&quot; quadrado em um menu de janela de ajuste) e ajustar a curva. O valor de K D com seu desvio padrão aparece em uma janela de informações pop-up separada. Para traçar um ajuste utilizando o método de Hill, escolha &quot;Média&quot;, o método de Hill, e depois ajustar a curva. O valor de CE 50 de afinidade com o seu desvio padrão está representado neste caso. O recurso de K D ou Hill &quot;fronteira&quot; também pode ser utilizado quando a saturaçãonum estado de associação não será atingido. </li><li> Salvar os dados médios caber em um arquivo de texto e transferir para o Excel. </li><li> Lote F norma (fluorescência normalizado), Af norma (diferença na fluorescência normalizada se experiências diferentes são comparados), ou fracção ligada (ver a fórmula seguinte), como uma função do não marcado (titulada) a concentração molécula. </li></ol> Fracção ligada (fracção de moléculas num complexo) = (Therm (C)-desacoplado) / (limite-desacoplado), onde Therm (C) é termoforese medida para a concentração C, é desacoplado termoforese para o estado livre (quando as moléculas são não em um complexo), e é obrigado termoforese para o estado completamente amarrado.

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. O conteúdo desta publicação não reflecte necessariamente a posição nem as políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem menção de nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações não implica o endosso pelo governo dos EUA.

A expressão de proteínas e de purificação é um passo trabalhoso e caro, o que é, no entanto, necessárias para a determinação do K D &#39;interacções pelo método mais usado actualmente. Aplicação de MST permite evitar a purificação de proteínas, assim, simplificar e acelerar significativamente caracterização quantitativa de interacções. Ele apresenta vantagens particularmente importantes no caso de-a-expressam difíceis e purificar proteínas, tais como proteínas de membrana e os factores...

Caracterização quantitativa da afinidade de interacções intermoleculares é importante em muitas áreas da investigação biomédica. Binding constante de dissociação (K D) é essencial não só na descoberta de drogas, mas também é um parâmetro importante na caracterização de qualquer interacção binário em qualquer sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para a detecção de interações proteína-proteína, tais como imunoprecipitação e fermento telas de dois híbridos, não nos informar sobre como apertada são essas interações, enquanto a afinidade define se este complexo particular, existe sob determinadas condições in vivo. No processo de descoberta de drogas, o desenvolvimento de ensaio de ligação é uma das mais necessárias e frequentes das etapas mais demoradas. Métodos mais comumente usados ​​de determinação K D incluem polarização de fluorescência, uma ressonância plasmon de superfície tecnologia (SPR), 2 ligação radioligante, 3 de calorimetria de titulação isotérmica, 4 equilibrihum diálise (ED), 5 de ultrafiltração (UF), 5 e ultracentrifugação (UC). 6 Todos eles requerem quantidades significativas de proteína alvo purificada. Termoforese microescala (MST) é um método rápido desenvolvimento que detecta o movimento dirigido de moléculas com um gradiente de temperatura microscópica. Quaisquer alterações da concha de hidratação de biomoléculas em resultado de uma mudança relativa do movimento ao longo do gradiente de temperatura. MST 7 é utilizado para determinar as afinidades de ligação e tem sido aplicado para estudar a ligação de proteínas marcadas com fluorescência ou ligandos fluorescentes ligando a uma proteína-alvo, 8. 9 MST permite a medição de interacções directamente em solução, sem a necessidade de imobilização de uma superfície (imobilização de tecnologia livre). Praticamente, qualquer ligação é acompanhada por uma mudança no sinal de MST, embora a dimensão da alteração varia de sistema para sistema significativamente. Para a detecção da molécula de movimento pelo MST, eles têm que ser fluorescênciant. Esta importante limitação do método pode ser transformado em uma vantagem. Se a proteína é expressa como uma fusão de GFP em qualquer sistema, que será a única molécula fluorescente e, assim, pode ser estudada, sem isolamento a partir do ligado de células ou sistema de expressão isento de células. Geração de lisados ​​de células que permitem a ligação com artefactos condições mínimas é o principal desafio. Aqui, nós descrevemos um protocolo de preparação da célula e ligado de experiência MST que pode ser usado para muitas proteínas solúveis e de membrana. Proteínas STAT são latentes factores de transcrição activados por citoplasmáticos fosforilação da tirosina em resposta a sinais extracelulares e estão envolvidos em muitos processos biológicos, incluindo imunidade, hematopoiese, inflamação e desenvolvimento. 10 Nos mamíferos, a família STAT STAT consiste de 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B e 6. Todas as estatísticas são activados sabe ligar-se a mesma sequência de DNA, assim chamado padrão GÁS, IFN-gama ativada sequência. No entanto, a transcriptional efeitos de diferentes estatísticas são muito diferentes. 11 Apesar de envolvimento em muitos processos patológicos e estudos extensivos rendendo mais de 17.000 publicações, a K D de STAT interacções com diferentes sequências de ADN que não foram determinadas. Apenas a afinidade relativa dos diferentes estatísticas às variantes do motivo de gás foi caracterizada. 11 Dificuldades na expressão e purificação de proteínas são os principais impedimentos para a caracterização da selectividade de ligação do ADN estatísticas. Embora a maioria dos estudos têm-se centrado sobre o papel dos Stats &quot;ativados&quot;, que se tornou sinônimo de fator de transcrição Tyr-fosforilada, o papel da não-fosforilada STATs (U-Stats) na regulação da transcrição está emergindo rapidamente. 12 No entanto, estes mecanismos são mal compreendidos, e não ficou claro se U-STATs realmente se ligar ao DNA ou agir através de interações com outros fatores de transcrição. Demonstrámos recentemente que a L-STAT3 pode ligar ao DNA sequencialmenteces diferentes motivos de gás com ainda maior afinidade 13. A descoberta tem implicações significativas para a nossa compreensão das funções biológicas desta importante proteína. Temos aplicado termoforese microescala para determinar as afinidades relativas de STAT3 ao gás e oligonucleótido rica em AT S 100 (Figura 4). Quase protocolo idêntico foi usado para a determinação de K D para a ligação de um ligando a STAT3 diferente, um inibidor de lipopéptido. 14 N a ligação de um factor de transcrição relacionadas, GFP-STAT1, que foi utilizado como um controlo negativo pode ser detectada confirmando assim a selectividade da interacção. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Caracterização quantitativa das interações proteína é essencial em praticamente qualquer campo das ciências da vida, particularmente a descoberta da droga. A maioria dos métodos actualmente disponíveis de determinação de K D requerem acesso a proteína de interesse, a geração do qual pode ser demorado e caro purificada. Nós desenvolvemos um protocolo que permite a determinação da afinidade de ligação por termoforese microescala (MST) sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O método envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida e a lise das células em condições não desnaturantes. Aplicação do método para a STAT3-GFP expresso transitoriamente em células HEK293 permitem determinar, pela primeira vez que a afinidade do factor de transcrição bem estudado para oligonucleótidos com sequências diferentes. O protocolo é simples e pode ter uma variedade de aplicações para o estudo das interacções de proteínas com moléculas pequenas, péptidos, ADN, ARN, e proteins.

Medição da afinidade de ligação a oligonucleótidos STAT3 não fosforilada da proteína. As células HEK293 que expressam STAT3-GFP foram usados ​​como uma fonte de STAT3 marcado por fluorescência para ensaio de ligação de DNA. Os lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão RIPA (20x10 6 células / ml). Para estudos de ligação, os lisados ​​foram diluídos 150 vezes com MST tampão de ligação de ADN para fornecer o nível óptimo da...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

30.4K visualizações.  National Cancer Institute. Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Vídeo: Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Biologia

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Em tempo real, análises de Transporte Retinol pelo receptor de membrana da proteína de Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...