Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (tanto para a RGM).

A. Materiais necessários: Ver Tabela 1 (reagentes), antes da preparação <ol><li> HBSS (P / S): 100 ml de HBSS 10x + 900 ml de H 2 0 + 1% de Penicilina / Estreptomicina (armazenado no frigorífico ou mantido em gelo). </li><li> 20% BSA estoque é feito em água e distribuído por alíquotas e guardado a -20 ° C. </li><li> HBSS (ASB): HBSS 1X 200 ml (P / E) + ml de três BSA 20% (concentração finais BSA 0,3%) </li><li> Islet meio: RPMI + 10% FBS + glutamina a 1% + 1% de Penicilina / Estreptomicina </li><li> Histopaque 1100: 240 ml 1119 + 200 ml de Histopaque 1077 Histopaque </li><li> Sutura 4-0 (McKesson): corte em 2 ¾ polegadas peças e armazenados numa placa de 10 cm de Petri </li><li> Instrumentos: dobrar as pinças de Ferramentas Ciência Belas a 90 °, e arquivar as dentes serrilhados de todos os três pares de fórceps. O objetivo é maçante os dentes, para não removê-los. </li><li> Cânula para a administração de colagenase / protease mistura: 27G ½ pol agulha, 30 ½ polagulha, tubo PE50 cortado em pedaços de 12 polegadas. Arquivo ambas as agulhas para baixo para uma extremidade arredondada lisa, que não tem arestas vivas. Insira a agulha de 27G em uma extremidade de um pedaço de 12 polegadas PE50 tubulação. Remover a agulha de 30G a partir do invólucro por esmagamento do invólucro com um par de alicates, transformando o invólucro ¼ de volta de cada vez. Remover a agulha com a pinça do invólucro, e inseri-la na outra extremidade da tubagem PE50 sob um microscópio de dissecação. Certifique-se de não torcer o tubo de como inserir a agulha no tubo PE50. A agulha 27G é o fim que você irá anexar a seringa de colagenase. </li><li> Colagenase (CI zyme MA) e Neutro Protease (CI zyme BP). TDE reconstituir o acordo com as instruções do fabricante. Consulte o Certificado de lote específico de análise para calcular a concentração de atividade enzimática. Transferir um total de 350.000 colágeno degradantes de atividade (CDA) unidades da colagenase reconstituído e 100.000 unidades de protease neutros do reconstitProtease BP buído para um tubo cónico e diluir até ao total de 15 ml em HBSS (P / S) </li></ol> B. Protocolo Passo-a-Passo 1. Inflação do pâncreas com colagenase / Protease Mistura <ol><li> Euthanize rato por deslocamento cervical, saturar o torso mouse com EtOH 70%, cavidade abdominal aberta completamente do ânus para diafragma com as tesouras e pinças de dissecção. </li><li> Posicione o mouse sobre a plataforma de um microscópio de dissecação. </li><li> Puxe o ceco e cólon ascendente para fora e colocá-las fora da cavidade do corpo para a esquerda. Ver Figura 1 para um resumo dos passos seguintes. </li><li> Posicionar os lóbulos do fígado contra o diafragma, que devem permanecer ali, se a cavidade do corpo é aberta suficientemente longe. Localizar a artéria hepática, veia portal e feixe do ducto biliar conduzem ao fígado agarrando o duodeno com fórceps curvo. Com um outro par de fórceps curvos, alcançar sob a artéria, veia, e conduta de bundle e puxar um 2 ¾ polegadas pedaço de sutura 4-0 sob o, duto veia artéria bile, e amarrá-lo uma vez e puxe bem como perto do fígado possível. </li><li> Usando duas pinças curvas, cuidadosamente pegar o duodeno e encontrar o ducto biliar ligado ao duodeno na papila. Use uma pinça do fórceps para picar através do pâncreas e direito do tecido conjuntivo sob a estreita ducto biliar a papila. Picar suas pinças rapidamente através do órgão para fazer um buraco e, em seguida, colocar as duas pinças de pinças através de e pegar outro pedaço de 2 ¾ polegadas de sutura 4-0 através de e amarrá-lo uma vez e puxe-a para um pequeno círculo, mas não puxe apertado. </li><li> Mude para o 90 ° fórceps e Vannas a tesoura superfino. Com os 90 ° pinças, cuidadosamente beliscar e puxar o intestino delgado até o ducto biliar é tenso. Faça um corte horizontal em toda a papila com a tesoura por esfaquear a tesoura abertas para o intestino e, em seguida, corte com um movimento. Tente apenas fazer one atravessam a papila sem desalojar o ducto biliar da papila. </li><li> Continuando a manter o intestino com os fórceps 90 °, inserir a cânula no ducto biliar até a metade do comprimento do ducto biliar, e puxe o fio apertada em torno da cânula. </li><li> Encher uma seringa de 3 ml com 2,0 ml de colagenase / protease mistura e injectar a cânula a um ritmo lento e constante. </li><li> Depois de inflação do pâncreas é concluída, remova a cânula de ducto biliar e usar a pinça e tesouras curvas primavera curvas para remover o pâncreas inflado, começando no cólon descendente e cortando o tecido conjuntivo como você puxa para cima os intestinos. Continue a remover o pâncreas a partir do intestino até chegar ao ducto biliar, em seguida, remover o pâncreas a partir do baço, o estômago e, em seguida, a partir das vísceras da cavidade abdominal. Terminar de remover cortando fora as suturas. Adicionar o pâncreas para um tubo de 50 ml contendo 5 ml de HBSS(P / S). Este tubo deve ser em gelo. </li><li> Repita o procedimento acima para cada animal até quatro animais. Para melhores resultados, dissociar apenas pâncreas quatro de uma vez. Tipicamente, quando os primeiros quatro são no banho de água a 37 ° C, é um outro inflar pâncreas quatro. </li></ol> 2. Pâncreas dissociação <ol><li> Colocar os tubos de 50 ml contendo o pâncreas em um banho de água a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Agite suavemente o tubo e verificar se há dissociação tecido, certifique-se de tecido se desprende facilmente, então redemoinho os tubos de 12 vezes, enquanto você está segurando o tubo pela tampa. </li><li> Adicionar um máximo de 30 ml de HBSS (BSA) (esta pode ser uma quantidade menor, dependendo de quanto é necessário para equilibrar os tubos durante o passo de centrifugação), e centrifugar a 290 xg durante um min. </li><li> Aspirar o sobrenadante cuidadosamente e deixar uma pequena quantidade de sobrenadante (2-3 ml), na parte inferior, de modo a não perturbar o sedimento celular. </li><li> Utilizando uma seringa de 30 ml attached a agulha 14G, adicionar um máximo de 10 ml de HBSS (BSA) e aspirar a suspensão para cima e para baixo duas vezes. </li><li> Filtra-se a mistura de células através de um coador de chá dentro de um tubo de plástico de 50 ml e enxaguar com outros 10 ml de HBSS (BSA). </li><li> Centrifugar a 330 xg durante 2 min. </li><li> Decantar o sobrenadante e inverter os tubos de drenagem sobre uma toalha de papel absorvente por 1 min. </li><li> Ressuspender em cada tubo de 10 ml 1,100 histopaque frio. </li><li> Sobrepor o histopaque com 10 ml de HBSS (BSA) e centrifugar a 900 xg durante 18 min. </li><li> Remover os 20 ml de todo o sobrenadante utilizando uma pipeta de 25 ml grande furo e passar o sobrenadante através de um filtro de 70 um invertidas. </li><li> Lavar as ilhotas em uma placa de 10 cm de Petri, pipetando 10 ml de mídia ilhotas através do filtro, mantendo-o do lado direito por cima do prato. </li><li> Cultura das ilhotas em um de 37 ° C, 5% de CO 2 da cultura de tecidos incubadora até estar pronto para a experimentação. Tipicamente, os ilhéus são colhidas e contadas antes experimentation. </li></ol> 3. Resultados representativos Rendimentos ilhotas, morfologia e qualidade são os parâmetros gerais utilizados para julgar o sucesso de isolamento de ilhotas. Nas nossas mãos, o rendimento das ilhotas do C57BL média / 6 de rato estão na gama de 150-250 ilhotas utilizando este protocolo (ver Tabela 2), e são comparáveis ​​com os dados obtidos utilizando optimizada Sigma tipo XI colagenase. No entanto, os rendimentos podem variar, dependendo da estirpe de ratinho utilizada e da idade do rato. A maioria dos animais que empregamos estão no intervalo de 8-16 semanas de idade Este protocolo foi testado em várias estirpes de ratinhos, incluindo C57BL / 6 (180-250 ilhotas / ratinho), CD1 (200-300 ilhotas / ratinho), 129 / B6 (200-300 ilhotas / ratinho), BLKS-db/db (120-200 ilhotas / ratinho), NOD (10 semanas de idade, 100-150 ilhotas / ratinho), e NOD-SCID (100-150 ilhotas / murganho ). Morfologia das ilhotas típico é mostrado na Figura 2, em que as ilhotas ter uma rodada de forma oblonga, com tamanho relativamente uniforme (apesar de tamanho UNIFormity pode variar de estirpe para estirpe). A Figura 3 mostra a análise típica de glucose estimulada a secreção de insulina a partir de ratinhos C57BL / 6 ilhéus isolados de rato usando TDES purificadas vs Sigma tipo colagenase XI. Tipicamente, os resultados de uma alta qualidade de ilhotas de preparação de uma estimulação com insulina, 25 mM de glucose, que é 6-20 vezes maior do que a observada em 2,5 mM de glucose. Outras aplicações podem também ser usadas para testar a qualidade dos ilhéus isolados, e estes incluem a utilização de técnicas de perifusion, Ca 2 + de imagem (com Fura2), e transcrição reversa-PCR, entre outros 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Um resumo da canulação do ducto biliar. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Aparência típica de ilhotas C57BL / 6 a 24 horas isolamento seguinte. Imagens foram adquiridas em um emconvertida microscópio com uma ampliação de 40X. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Glucose-secreção de insulina estimulada de C57BL / 6 ilhotas. Aos 24 hr isolamento seguinte, 100 ilhotas foram incubadas em um prato de 12 poços durante 1 hora a 37 ° C em solução de Krebs-Ringer tamponada com HEPES-contendo 2,5 mM de glucose. Ilhéus foram então transferidos para solução de Krebs-Ringer HEPES, 2,5 mM de glicose por uma hora adicional, após o que o sobrenadante foi recolhido para a medição de insulina usando um local de dois imuno ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) (Crystal Chem). As ilhotas mesmos foram subsequentemente transferidos para solução de Krebs-Ringer tamponada com HEPES-contendo 25 mM de glucose, e a libertação de insulina para o meio foi medida por ELISA após 1 h de incubação.

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NDS, SAT, e RGM tem nada a revelar. AGB autor é empregado por VitaCyte. Autor RCM tem uma participação acionária na VitaCyte.

Neste protocolo, descrevemos o nosso procedimento para a canulação, a perfusão com colagenase, e a dissociação do pâncreas de murino, com a finalidade de isolar as ilhotas de Langerhans. Tecnicamente, o nosso método, uma vez que domina, devem permitir o isolamento no interior do pâncreas 4 min de eutanásia do animal, e por 1 hr deve resultar no isolamento de ilhotas de um único animal. A rapidez da técnica nos permite isolar ilhotas de até 12 ratinhos a um estiramento normal, resultando no isolamento de até 3.000 ilhotas. Ao contrário de outros protocolos que utilizam preparações cruas de colagenase, o nosso protocolo apresenta a utilização de proteases purificadas, zyme CI MA colagenase e protease zyme CI BP. As variações na consistência da preparação TDE que estão disponíveis comercialmente requer que cada lote individualmente ser testada e optimizada antes de uso geral. Esta variabilidade de lote para lote nos levou a considerar o uso de puriTDES ficados de VitaCyte. Estes TDES altamente purificados são caracterizados por vários métodos, incluindo a utilização de ensaios de fluorescência sensíveis ao substrato marcado. O ensaio de fluorescência CDA é mais sensível a diferentes formas moleculares de colagenase que têm diferentes cinéticas de colagénio nativo degradante. Históricos ensaios substrato peptídico fornecer uma avaliação incompleta de colagenase. Caracterizando colagenase por vários métodos garante uma maior atividade da enzima entre os lotes. Com base no nosso teste em casa utilizando uma variedade de preparações de colagenase comercialmente disponíveis, verificou-se que as combinações de enzimas purificadas resultou reprodutíveis de lote para lote-resultados. As vantagens principais de usar TDES altamente purificados e caracterizados com rigor no presente pedido são uma vez que a composição de enzima óptimo é definido, a consistência do desempenho lote para lote é garantida. Esta consistência elimina o processo de trabalho intensivo de qualificação muito normalmente necessáriopara produtos de colagenase em bruto ou enriquecido. TDES purificadas também permitir modificações adicionais da composição para melhorar o rendimento e a qualidade das ilhotas recuperadas a partir de estirpes de ratinho diferentes. Relatórios composições enzimáticas óptimas para o isolamento de ilhotas de diferentes estirpes de ratos pode ser mais eficazmente comunicadas. Este, por sua vez, leva a um uso mais produtivo dos recursos e maior flexibilidade no projeto experimental. Há muitos passos críticos que podem afetar o resultado do isolamento de ilhotas usando nosso protocolo. A primeira é a necessidade de atingir a inflação eficaz do pâncreas durante a perfusão da preparação enzimática. É importante para iniciar a inflação com força suave na seringa, e aumentar a força como se inflar pâncreas. É útil para mover os intestinos e levante o pâncreas durante a inflação, de modo que a colagenase perfunde o órgão inteiro. Outro passo importante é a força com que um sacode o afte tubosr incubação a 37 ° C (passo 2.2). Descobrimos que a agitação do pâncreas com força contra a tampa do tubo faz com que a fragmentação de ilhotas, mas sem qualquer forma de dissociação mecânica, neste passo, a produção de ilhotas pode cair drasticamente. Também é imperativo que durante o passo de dissociação com a seringa (passo 2.5), uma força de nível médio é aplicado durante o movimento para cima e para baixo com o êmbolo, o que garante a dissociação do tecido adequado, antes da etapa de filtragem (2.6), em que muito pouco tecido deve ser retida no filtro coador de chá. Finalmente, o último passo para seguir com atenção é a aspiração de todo os 20 ml das ilhotas Histopaque fracionados. Embora as ilhotas estão tipicamente na interface do histopaque e HBSS, nós descobrimos que podemos perder ilhotas quando se tenta remover apenas a interface, em vez disso, nós agora remover os 20 ml inteiro usando uma pipeta ml grande furo 25. Adicionamos a filtração através de filtro invertido a 70 uM (passo 2.11) para eliminar a necessidade de centrifuge as ilhotas várias vezes para lavar o histopaque.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td></td><td> Catálogo # </td></tr><tr><td> HBSS 10X </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> qualquer </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 sutura rolo 100 m </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g de agulhas extremidade romba </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Superfine Sciss Vannas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Curvas Tesoura Primavera </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps curvas (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps curvos (para 90 °) </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 polegada de agulha </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de 30G 1/2 polegada </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação de PE </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP Protease </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 3 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml seringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 prato de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Coador de chá de plástico </td><td> Qualquer fonte de cozinha </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes e Equipamentos </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma tipo XI (L010M8618) </td><td> MA (100.615) BP (110.329) </td><td> MA (081.104) BP (100.823) </td><td> MA (091.211) BP (101.109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 2. Rendimento médio de ilhotas (± DP), utilizando diferentes lotes TDE * * Os dados representam a produção de ilhotas média de pelo menos 10 ratos. Os números de lote em parênteses </td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

A interrogação da expressão génica em células beta e função in vitro tem esquadria deslocada ao longo dos anos a partir do estudo de linhas celulares de roedores tumorigénicas para o estudo das ilhotas de roedores isoladas. Ilhotas primários oferecem a vantagem de que eles mais reflectem fielmente a biologia das vias de sinalização intracelular e respostas secretoras. Considerando que o método de isolamento de ilhotas de tecido utilizando dissociação enzimática (TDE) preparações foi bem estabelecida em muitos laboratórios de 1-4, as variações na consistência da qualidade e rendimento da ilhota a partir de qualquer estirpe de roedor dado limitar a extensão dos estudos e viabilidade das ilhotas primárias. Estas variações ocorrem frequentemente como uma consequência das TDES bruto parcialmente purificadas utilizadas no procedimento de isolamento de ilhotas; TDES frequentemente exibem de lote para lote, variações na actividade e muitas vezes necessita de ajustes para a dose de enzima utilizada. Um pequeno número de relatórios utilizaram purificado TDES para isolamentos de células de roedores 5, 6 </sup&gt;, mas a prática não é generalizada, apesar da utilização de rotina e as vantagens de purificada TDES para isolamentos de ilhotas humanas. Em colaboração com VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), foi desenvolvido um protocolo de rato modificado isolamento de ilhotas com base no descrito por Gotoh 7, 8, em que os TDES são perfundidas directamente para o canal pancreático de ratos, seguido de fraccionamento do tecido cru por meio um gradiente de Histopaque 9, e isolamento de ilhotas purificadas. A diferença significativa no nosso protocolo é a utilização de colagenase purificados (CI zyme MA) e protease neutra combinação (CI zyme BP). A colagenase foi caracterizado através da utilização de um colagénio fluorescência 6 degradante actividade ensaio (CDA), que utilizou etiquetas fluorescentes fibrilas vitela solúvel como substrato pele 6. Este substrato é mais preditiva da cinética de degradação do colagénio na matriz de tecido porque ele depende de colagénio nativo como o substrato. A protease foi characterized com um ensaio fluorescente sensível cinético 10. Utilizando estes ensaios melhoradas juntamente com mais tradicional análise bioquímica habilitar o TDE a ser fabricado de forma mais consistente, levando a consistência melhor desempenho entre os lotes. O protocolo aqui descrito foi optimizada para a produção máxima de ilhotas e morfologia das ilhotas óptima utilizando ratinhos C57BL / 6. Durante o desenvolvimento deste protocolo, várias combinações de colagenase e proteases neutras, foram avaliados em concentrações diferentes, e a razão final de colagenase: a protease neutra de 35:10 representa um desempenho comparável ao da enzima Sigma Tipo XI. Devido variabilidade significativa em rendimentos médios a partir de ilhotas diferentes estirpes de ratos e murganhos foram relatados, modificações adicionais da composição TDE deve ser feito para melhorar o rendimento e qualidade das ilhotas recuperadas a partir de diferentes espécies e estirpes.

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Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.

Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

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43.2K visualizações.  Indiana University School of Medicine. Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.

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Murine Pancreatic Islet Isolation

Isolamento Islet murino de pâncreas

Biologia

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...