Este protocolo requer o uso de um gradiente de densidade única tornando-o significativamente menos intensivo em mão-de-obra e mais econômico em comparação com métodos de isolamento de ilhotas convencionais mais complexos. A principal vantagem deste protocolo é que a enzima é entregue diretamente ao pâncreas, resultando em uma maior digestão tecidual e aumento do rendimento da ilhota. Comece gravando os membros do mouse na posição supina e pulverizando o corpo com 70% de etanol.
Usando fórceps de vidro e tesoura cirúrgica curva, faça uma incisão de pele abdominal horizontal de aproximadamente três centímetros e puxe a pele para expor a parede abdominal. Faça uma incisão vertical de três a quatro centímetros no peritônio abdominal para expor totalmente o pâncreas e coloque o rato sob um microscópio dissecando. Empurre o lobo hepático superiormente para expor o ducto biliar que aparece como um tubo rosa pálido e mover suavemente os intestinos da região lombar e ilíaca direita para a direita da cavidade abdominal para expor o ducto biliar e artéria hepática.
Use micro serrefinas Schwartz para fixar cuidadosamente o ducto biliar comum o mais próximo possível do fígado e identificar a ampola de Vater que está localizada na papila duodenal e formada pela união do ducto pancreático e do ducto biliar comum. Usando fórceps micro Adson para puxar o ducto biliar comum ensinado, insira uma agulha de meia polegada de calibre 30 presa a uma seringa de três mililitros contendo três mililitros de solução P de colagenase recém-preparada na ampola de Vater empurrando a agulha para dentro do duto paralelo ao vaso por cerca de um quarto do comprimento do vaso. Uma vez que a agulha esteja no lugar, estabilize a agulha com micro fórceps Adson e injete lentamente e firmemente três mililitros de solução P de colagem no duto.
A injeção é considerada bem sucedida se as regiões da cabeça, pescoço, corpo e cauda do pâncreas estiverem totalmente infladas. A entrada adequada na ampola e a canulação do ducto biliar comum são fundamentais para uma colheita bem sucedida de digestão. Perfurar as paredes ductais reduz a eficácia do isolamento.
Usando fórceps curvados e micro Adson, puxe cuidadosamente o pâncreas inflado começando no baço e continuando em direção ao estômago e ao longo do duodeno. Em seguida, coloque o pâncreas em um tubo de digestão de 50 mililitros contendo três mililitros de solução P de colagem gelada. Para colher as ilhotas, primeiro use uma tesoura cirúrgica fina para cortar o pâncreas por três a cinco segundos antes de colocar o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius a 100 a 120 rotações por minuto durante 12 a 13 minutos.
No final da incubação, agite suavemente o tubo por cerca de 30 segundos para interromper o tecido até que a solução seja homogênea, como confirmado por partículas finas de tecido pancreático semelhantes à areia. Assim que o tecido for digerido, coloque o tubo no gelo e adicione 40 mililitros de solução de parada gelada para acabar com a reação enzimática. Depois de interromper suavemente a pelota, gire o tecido digerido em uma centrífuga de balde balançando seguida de duas centrífugas com 20 mililitros de solução de parada fresca por lavagem.
Após a última lavagem, resuspenja a pelota em 40 mililitros de HBSS gelado para três lavagens adicionais, reutilizando a pelota em cinco mililitros de solução de gradiente de densidade de temperatura ambiente após a última lavagem. Vórtice o tubo brevemente em baixa velocidade até que a solução seja homogeneizada antes de adicionar outros cinco mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente ao tubo. Agora use uma pipeta de 10 mililitros para adicionar suavemente e lentamente 10 mililitros de HBSS de temperatura ambiente ao tubo de uma maneira em termos de gota para permitir a formação de um gradiente e usar uma centrífuga de balde balançando para isolar as populações celulares por separação gradiente de densidade.
No final da centrifugação, use uma pipeta de 10 mililitros pré-molhada com HBSS frio para coletar de cinco a dez mililitros da camada de ilhotas entre o gradiente de densidade e o HBSS. Transfira as ilhotas para um novo tubo de 50 mililitros contendo 20 mililitros de HBSS frios de gelo fresco e colete as células por centrifugação em uma centrífuga de balde balançando. Aspire cuidadosamente todos, menos os últimos três mililitros do supernatante sem perturbar a pelota e lave as ilhotas pelo menos mais três vezes com 20 mililitros de HBSS frescos por lavagem.
Após a última lavagem, substitua o supernatante por quatro mililitros de 37 graus Celsius RMPI 1640 médio e gire suavemente o tubo para desalojar a pelota. Despeje imediatamente as ilhotas em uma placa de Petri de 100 milímetros e lave o tubo com cinco mililitros de meio RPMI 1640 fresco para coletar quaisquer ilhotas restantes que juntem a lavagem com as outras ilhotas. Em seguida, use um microscópio de dissecção e uma ponta de pipeta de 20 microliteres para colher ilhotas marrons douradas esféricas saudáveis ou oblongas com uma superfície lisa da placa de Petri para transferência em uma nova placa de Petri contendo 10 mililitros de meio RPMI completo 1640.
Quando todas as ilhotas tiverem sido coletadas, coloque as ilhotas em uma incubadora estéril a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no ar umidificado durante a noite. Boas ilhotas saudáveis parecem ter uma forma redonda suave, enquanto ilhotas danificadas apresentam bordas ásperas. Tecido exócrino não digerido é translúcido na aparência e demonstra uma forma irregular.
Uma cannulação adequada e distribuição da enzima P colagenase pode ser confirmada por uma inflação da porção esplênica do pâncreas. A incubação noturna em baixa mídia de glicose pode preparar as ilhotas para um ensaio de secreção de insulina estimulado pela glicose no dia seguinte, permitindo uma visão da capacidade secreta de insulina das ilhotas.
