Este trabalho foi financiado pela Fundação Ciência CARREIRA Prêmio Nacional (0953583) e do Instituto Nacional de Saúde NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Neste protocolo, um oligonucleotídeo (RBMB1) foi marcado em sua extremidade 5 &#39;com um corante repórter CF640R e tem a sequência: 5&#39;-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3&#39;. Domínios auto-complementares, que levam à formação da estrutura em grampo, estão em negrito. O segundo oligonucleótido (RBMB2) foi marcado na extremidade 3 &#39;com um agente de extinção de Iowa Preto RQ-Sp e tem a sequência: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3&#39;. 1 Preparação de RBMBs <ol><li> Executar uma rotação rápida dos tubos contendo as RBMB1 e RBMB2 oligonucleótidos, para assegurar o oligonucleótido seca está na parte inferior do tubo, e ressuspender em água DNase e RNase para uma concentração final de 100 uM. Por exemplo, uma amostra de 10 nmol de oligonucleótido deverá ser ressuspenso em 100 ul de água. </li><li> Measure a concentração exacta de amostras e RBMB1 banco RBMB2 por espectroscopia de UV-vis. <ol><li> Misturar 3 ul da amostra RBMB com 117 ul (DPBS sem cálcio e magnésio) em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Em branco o espectrofotômetro com DPBS e medir a absorvância 200-800 nm. Nota: Pico se as absorvâncias a 260 nm e 650 nm deve ser visível. </li><li> Calcula-se a concentração de estoque de amostras RBMB base na absorvância a 260 nm (ou 650 nm para RBMB1), usando a equação: Da concentração (M) = 260 * Um coeficiente de factor de diluição / extinção em que A é a absorvância de 260 a 260 nm, e o factor de diluição é de 40. Nota: O coeficiente de extinção para a RBMB pode ser encontrado na folha especificação fornecida pelo fabricante do oligonucleótido. O coeficiente de extinção a 650 nm CF640R é 103.000. </li></ol></li><li> Misturar 20 ul de 100 uM RBMB1, 30 ul de 100 uM RBMB2, 6 ul 10x; Tampão fosfato (10x tampão fosfato: 480 mM de K 2 HPO 4, 45 mM de KH 2 PO 4, 140 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) e 4 mL de água e de DNase isenta de RNase. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min. Nota: Este é normalmente suficiente para cerca de 50 estudos. </li><li> Prepara-se uma coluna de cromatografia líquida utilizando 75 grau prep Superdex para remover quaisquer oligonucleótidos RBMB2 não hibridizadas. Usar um 8 mL (0,7 x 20 cm) de coluna de cromatografia líquida com um volume de leito ~ 4 ml para purificar o pequeno volume de sondas mistas. </li><li> Lavar e equilibrar o Superdex com ~ 50 ml de tampão de fosfato de 1x usando uma bomba de seringa, rodando a um fluxo a uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min. Antes de todo o fluido entra no volume de leito, parar a bomba de seringa, separá-lo e deixar o líquido restante através da coluna vai por gravidade. </li><li> Carregar a mistura RBMB (60 uL) na coluna de cromatografia. <ol><li> Depois a amostra foi completamente RBMBentrou na cama, adicionar lentamente mais 250 ul de 1x tampão de fosfato para o topo do leito para assegurar que toda a amostra entrou completamente a coluna. </li><li> Encher a coluna até a borda com tampão de fosfato de 1x. Feche o topo, e ligar a bomba de seringa - a seringa deve ser preenchido com ~ 50 ml de PBS 1x e correr a uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min. </li><li> Uma vez que o RBMB se aproxima da parte inferior da coluna - a amostra RBMB pode tipicamente ser prontamente visualizado devido à cor do corante incorporado na sonda - recolher o fluxo de passagem em duas gotas por tubo de microcentrifugação (1,5 ml). Pare de coletar a amostra uma vez que a cor dentro dos microtubos se torna claro. </li></ol></li><li> Combine os tubos contendo a amostra RBMB cor - geralmente 5-6 tubos - e carregar em um dispositivo de filtro centrífugo (10.000 MW de corte). Centrifuga-se a amostra a 10000 RCF durante 20 minutos ou até que o volume desejado. Nota: Estas velocidades e tempos normalmenteoriginar um volume final de ~ 30 mL. </li><li> Medir a concentração exacta da amostra RBMB purificado por espectroscopia de UV-Vis. <ol><li> Tomar 3 mL da amostra concentrada RBMB e misturar com 117 DPBS ul em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Em branco o espectrofotômetro com DPBS e medir a absorvância 200-800 nm. Nota: Pico se as absorvâncias a 260 nm e 650 nm deve ser visível. </li><li> Calcular a concentração do estoque RBMB hibridado com base na absorvância a 650 nm, utilizando a equação: Da concentração (M) = 650 * Um factor de diluição / coeficiente extinta 650 onde A é a absorvância a 650 nm, o factor de diluição é de 40. Nota: O coeficiente de extinção a 650 nm para CF640R é 103.000 e o coeficiente de extinção para Iowa Preto RQ é ~ 20.000. Os coeficientes de extinção são aditivas e não são sensíveis à hibridização. Portanto, a amostra de estoque RBMB tem um coeficiente de extinção combinada de approximately 123 mil a 650 nm. </li></ol></li><li> Rotular o tubo de forma adequada com o nome e concentração e armazenar a -20 ° C para uso futuro. </li></ol> 2: Preparação de poli-d-lisina de 8 poços revestidos ALOJADO lamela <ol><li> Prepara-se uma solução de 0,2 mg / ml de poli-D-lisina por dissolução de 5 mg de poli-D-lisina (pó liofilizado, g-irradiado) em 25 ml de água esterilizada em ambiente estéril. </li><li> Adicionar 200 ul da / ml de solução de poli-D-lisina a 0,2 mg a cada poço de uma lamela 8 poços compartimentado, em um ambiente estéril. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 16-18 horas na capa de cultura de células. </li><li> Aspirar a Poli-D-lisina e lavar bem a 3 vezes com água destilada estéril. Nota: As lâminas com câmara revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C. </li></ol> 3. Probe Entrega Nota: O sistema celular utilizado deve conter uma construção de um gene que expressa ARN integrado com, pelo menos, 4-sequencial ligaming sítios para a RBMB na região 3 &#39;não-traduzida (UTR). O alvo deve ser complementar à linha do RBMB. Aconselha-se que, como um controlo negativo, a mesma linha de células ser manipulada para expressar a mesma construção do gene, mas sem as repetições em tandem. Neste protocolo, uma linha de células de fibrossarcoma humano, HT1080, foi manipulada para expressar a GFP de ARN com 96 repetições em tandem da sequência alvo RBMB na 3&#39;-UTR. A linha de células de controlo foi concebido para expressar a GFP de ARN de tipo selvagem. <ol><li> Células da placa em um frasco de T25 a 40-50% de confluência um dia antes da entrega da sonda. Cultura das células com meio DMEM suplementado com 1% de pen / strep e 10% de soro fetal bovino (FBS), e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> No dia seguinte, ligue o microporos e configurar os parâmetros de formação de microporos para 950 V, 2 pulsos, 25 ms. Nota: Estes parâmetros foram otimizados para as células HT1080, mas eles são do tipo celular dependente e pode ser adjusted para outros tipos de células, tal como descrito nas instruções do fabricante. </li><li> Encha o tubo de microporos com 4 ml de tampão eletrolítico e colocá-lo na estação de formação de microporos. </li><li> Retire a amostra estoque de RBMB purificado e descongelar. Diluir vários microlitros para uma concentração final de 12 uM com tampão de fosfato de 1x. 1 ml é necessária para cada formação de microporos. </li><li> Pipete 1 mL de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos para um tubo de microcentrífuga. Nota: Este será usado para suspender as células imediatamente depois de microporos e pode ser posta de lado, perto do dispositivo de formação de microporos, por enquanto. A inclusão de antibióticos no meio de cultura diminui a viabilidade celular após a formação de microporos. </li><li> Remover o meio de cultura celular das células HT1080 modificadas (60-80% confluentes), lavar as células com 1 ml de Ca 2 + e Mg 2 + DPBS -free uma vez, e incuba-se com 1 ml de tripsina durante 1-2 min. </li><li> Pare o trypsinization adicionando 1 ml de meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino sem antibióticos, e vermelho de fenol, e transferência das células para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Girar as células no tubo de microcentrífuga a 200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender combinar as pelotas de células, num volume final de 1 ml de DPBS. </li><li> Tomar 10 ul a partir da suspensão de células, bem misturada, e contar as células. </li><li> Pipeta as células para cima e para baixo várias vezes para se certificar de que eles estão bem dispersas e transferir 300 mil células com DPBS em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e girar a 200 xg por 5 min. </li><li> Retirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não perturbar o sedimento celular. Ressuspender o sedimento em tampão de ressuspensão e 11 ul pipeta cima e para baixo várias vezes, para assegurar que as células são bem dispersa. Cuidado para não gerar eventuais bolhas de ar. Nota: As bolhas de ar fará com que uma faísca durante a formação de microporos e resultar em má entrega RBMB e morte celular. </li><li> Adicionar 1 mL do RBMB diluído (12 mM) e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. Novamente tome cuidado para não gerar as bolhas de ar. </li><li> Aspirar 10 ul da mistura de células RBMB, utilizando a pipeta de formação de microporos, e inserir a pipeta dentro do tubo de formação de microporos. Pressione o botão Iniciar para iniciar a formação de microporos. Nota: Não deve haver bolhas de ar visíveis na ponta. </li><li> Quando o ecrã do microporos mostra conclusão, remover a pipeta da estação, expelir a mistura de 10 uL para dentro do tubo de microcentrífuga que foi preparado anteriormente, com 1 ml de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos. Misture delicadamente balançando os tubos de lado-a-lado várias vezes. </li><li> Rodar as células a 200 xg durante 5 min e lava-se as células mais duas vezes, em 1 ml de meio de cultura sem fenol vermelho com FBS, mas sem antibióticos, para remover quaisquer RBMBs que não foram transferidos para as células. Ressuspender com 400 mL de meio de cultura de fenol vermelho livre com FBS, mas semantibióticos. </li><li> Placa as células microporated para a poli-D-lisina revestido lamela 8 poços compartimentado em 200 ul por poço ou na confluência desejado. </li><li> Opcional: Se for desejável a imagem do núcleo, adicionar Hoescht 33342 para as células a uma concentração final de 0,01 mg / ml. </li><li> Coloque as câmaras lamela numa incubadora de cultura de células. Incubar as células durante 1-2 horas antes da imagem, de modo que as células tenham tempo suficiente para assentar sobre a superfície da lamela. Nota: Imagem pode ser realizada assim que 30 min pós-formação de microporos. </li></ol> 4. Image Acquisition <ol><li> Ligar o sistema de fase celular de incubação superior ao vivo e equilibrar até que atinja 37 ° C, 5% de CO 2, e 75% de humidade. </li><li> Ligue a fonte de luz do microscópio e fluorescente e abrir o software Metamorph. Nota: Outros pacotes de software similares para controle de microscópio e de aquisição de imagem também pode ser usado. </li><li> Aplique óleo Immersol aoobjectivo. </li><li> Transfira a lamela câmaras com células microporated ao estágio de células do sistema superior de incubação ao vivo. Incubar a fase superior do sistema até que a temperatura e os níveis de CO2 estão estabilizados. </li><li> Abra a guia Adquirir, em software Metamorph. Clique no botão Show Live para encontrar o campo, ajustar o foco de luz branca e clique no botão Parar ao vivo. </li><li> Sob a guia Adquirir, clique e abrir o botão pop-up aquisição fluxo, e configurar os parâmetros de aquisição filme desejado. Adquirir 150 quadros usando o filtro Cy5 / CF640R e salvar as imagens para o disco rígido. </li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

Dr. Mark Behlke e Dr. Ling Huang são empregados pelo IDT, que oferece oligonucleotídeos para venda semelhante a alguns dos compostos descritos no manuscrito. IDT é, no entanto, não é uma empresa de capital aberto e que, pessoalmente, não possui quaisquer acções / equidade na IDT.

A capacidade de imagens simples transcritos de ARN modificadas em células vivas utilizando um microscópio de campo amplo convencional requer um sinal fluorescente brilhante e fotoestáveis ​​para ser associado com cada transcrição de ARN e um fundo de fluorescência que emana de baixo sondas fluorescentes não ligados. Neste método, um sinal fluorescente brilhante é conseguida por hibridação múltipla (até 96) à base de sondas fluorescentes de oligonucleótidos, ou seja RBMBs, para cada transcriç...

A expressão e regulação dos transcritos de RNA é um processo complexo e dinâmico, que é em grande parte responsável por controlar o comportamento das células e destino. Embora a importância da RNA em função das células ditando tem sido conhecida há algum tempo, muitas vezes é difícil estabelecer ligações claras entre os dois desde que a maioria das ferramentas de análise de RNA não têm a resolução espacial e temporal exigido para capturar eventos regulatórios importantes, tais como a transcrição de ruptura, RNA tráfico e processamento de RNA localizada. Isto levou ao aparecimento de diversas técnicas que permitem que os transcritos de ARN individuais a serem visualizados em células vivas em tempo real 1. Talvez o mais importante destas técnicas utiliza uma proteína de fusão GFP-MS2 de RNA alvo, que tenha sido modificado para conter repetições em série de local de ligação MS2 na 3&#39;-UTR de 2,3. Ao trazer várias moléculas de GFP em estreita proximidade, transcrições de RNA individuais aparecem manchas fluorescentes como brilhantesatravés de microscopia de fluorescência. O sistema de GFP-MS2 forneceu uma visão sem precedentes sobre o comportamento do RNA, incluindo a visualização direta e medidas de transcrição estourando 4,5, detecção de localização sub-celular exclusivo e processamento de 6-9, e imagens em tempo real do transporte de RNA 10. No entanto, apesar do enorme potencial de o sistema de GFP-MS2, proteínas de fusão GFP-MS2 não ligados podem criar um sinal de fluorescência de fundo elevado, que limita a versatilidade e gama dinâmica desta técnica. Várias abordagens foram desenvolvidas para limitar o sinal de fundo, incluindo compartimentalização subcelular de desacoplado GFP-MS2 10, fragmento de proteína complementação 11, e proteínas de ligação de RNA alternativas e tem como alvo 12. No entanto, todas estas abordagens permanecem sensíveis para a expressão relativa e total do alvo de ARN e proteína de fusão GFP-MS2. Como umlternative para os sistemas de GFP-MS2, faróis moleculares também têm sido utilizados para detectar transcritos de ARN modificadas com repetições em tandem de o sítio de ligação complementar na 3&#39;-UTR 13,14. Os faróis moleculares são sondas oligonucleotídicas de formação de gancho que estão marcadas, numa extremidade com um extintor e na outra extremidade com um repórter fluorescente. Quando não está ligado ao RNA alvo do repórter fluorescente e extintor permanecem em estreita proximidade, resultando num estado de baixa fluorescência. Após a hibridação, o repórter fluorescente e extintor ser separadas e a fluorescência é restaurado. Semelhante ao sistema de GFP-MS2, a ligação de vários faróis moleculares para um único transcrito de ARN resulta em uma mancha fluorescente brilhante, que pode ser identificado por meio de microscopia de fluorescência; no entanto, a fluorescência de fundo deverá ser de muito menor, devido à configuração da extinta faróis moleculares não ligados. Infelizmente, apesar de o mecanismo de activação inteligente que é incorporada no mprojeto farol olecular, agora há evidências crescentes de que não hibridizada beacons moleculares não permanecem na conformação hairpin quando introduzido em células vivas. Por conseguinte, eles geram um sinal falso-positivo que reduz significativamente a relação sinal-fundo. Para superar essa deficiência, que recentemente desenvolveu uma nova sonda sintética para RNA de imagem em células vivas, balizas bimoleculares proporcional (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs são compostas de duas cadeias oligonucleotídicas 2&#39;-O-metilo que forma uma estrutura híbrida com as características de ambos os ARN curto hairpin (shRNA) e faróis moleculares. O mecanismo de activação circular e de fluorescência é semelhante ao de farol molecular, enquanto que o domínio de cadeia dupla longo com uma saliência 3&#39;-UU é mais característico dos shRNA. Os recursos shRNA são projetados para conduzir exportação nuclear, o que temos encontrado aumenta vida intracelular de&gt; 24 horas, com a degradação observável mínimo, eimpede a abertura não específico do ciclo. Como um resultado RBMBs apresentam um fundo de sinal-para-significativamente mais elevada do que faróis moleculares. Deve notar-se que RBMBs não pode ser preparado utilizando os oligonucleótidos de ADN, uma vez que sondas baseadas em ADN não possuem as mesmas capacidades de exportação nuclear como sondas baseados no RNA. Estruturalmente, o loop RBMB é tipicamente concebida para estar entre 15 e 21 bases de comprimento, para criar um equilíbrio entre a especificidade e selectividade mediante hibridação de ARN. O curta-tronco que se forma a partir dos dois domínios auto-complementares normalmente é projetado para ser de 4 bases. Se uma haste mais longa for selecionado, a taxa de hibridação entre o loop RBMB e RNA alvo fica lento significativamente 17,18. Por outro lado, quando uma sequência de caule mais curto é seleccionada a temperatura de fusão é frequentemente demasiado baixa para manter a estrutura em ansa pedunculada, a 37 ° C, conduzindo a um sinal de fundo elevado. A especificidade do RBMB também é vermelhouced como o comprimento da haste é encurtado. Como a seqüência do RBMB tronco de loop também pode influenciar o desempenho RBMB, deve ser cuidadosamente selecionados 19. Em particular, as sequências de loop ideal deve ter o mínimo de estrutura secundária, hibridizam com seqüências de RNA com estrutura secundária mínima, evitar locais de ligação de proteínas e evite off-meta vinculativa. Previsões de ambos RBMB e estrutura secundária do RNA pode ser obtida usando softwares como o mfold 20. Complementares locais fora do alvo podem ser identificados através de um trabalho de busca local ferramenta básica de nucleotídeos (BLAST). No entanto, por causa de inconsistências nas previsões do modelo e da dificuldade em identificar sites de licitação de proteínas, a especificidade de todos os RBMBs deve finalmente ser validadas experimentalmente. Se desejável, um corante de referência unquenched que é insensível ao estado de hibridação pode ser adicionado à RBMB 15. A adição de um corante de referência pode prOvide um marcador para entrega sonda e ser usado para geração de imagens ratiometric, se forem necessárias medições mais precisas de fluorescência celular total. Os corantes de referência permite a medição de ser ajustados para as diferenças no fundo, devido às variações de célula-a-célula no parto. No entanto, na obtenção de imagens de ARN transcritos indivíduo o corante de referência não é necessário. Notavelmente, alguns corantes de referência pode interferir com a exportação de RBMBs a partir do núcleo, conduzindo a um sinal de fundo ligeiramente mais elevada no núcleo. Quando concebida adequadamente, RBMBs pode ser utilizado para imagem transcritos de ARN individuais em células vivas individuais, se o RNA alvo é modificado para conter, pelo menos, quatro locais de ligação RBMB (Figura 1B) 16. RBMBs pode ser eficientemente entregues em uma ampla gama de tipos de células, através de formação de microporos, com pouco ou nenhum efeito sobre a viabilidade das células 21, e as medições quantitativas da expressão do gene pode seradquirido dentro de 30 min. Além disso, a metodologia é relativamente insensível a níveis de concentração RBMB e RNA alvo, uma vez que a fluorescência a partir de RBMBs não ligadas é extinta eficientemente. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada da metodologia utilizada para preparar e purificar RBMBs, bem como um procedimento geral para a entrega de RBMBs em células vivas através de microporos ea imagem de transcrições de RNA em tempo real.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="977">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">AM9932</td>
			<td style="width:244px;">no DEPC-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DPBS</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No Ca2+ and Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:207px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P284-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">S381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;">22364111</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Chromatography Column</td>
			<td style="width:207px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:220px;">420400-0720</td>
			<td>0.7x20cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Superdex 75 Prep Grade</td>
			<td style="width:207px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:220px;">17-1044-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:207px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:220px;">BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe</td>
			<td style="width:207px;">BD</td>
			<td style="width:220px;">301035</td>
			<td>60mL, Luer-lok tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">UFC501096</td>
			<td>Mw 10,000 cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge 5418</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">P7280-5MG</td>
			<td>lyophilized powder, g-irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">8-well chambered coverglass</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">155409</td>
			<td>Working volume 0.2-0.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HT1080</td>
			<td style="width:207px;">ATCC</td>
			<td style="width:220px;">CCL-121</td>
			<td>Human Fibrosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">430639</td>
			<td>25cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">11965084</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM without Phenol Red</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">21063029</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F2442-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penecillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Trypsin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Neon transfection system</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon transfection system kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">02-671-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IX-81 Inverted fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Olympus</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">SOLA light engine</td>
			<td style="width:207px;">Lumencor</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metamorph</td>
			<td style="width:207px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td>Software controlling microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol oil 518F</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">12-624-66B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

A crescente compreensão de que tanto a regulação temporal e espacial da expressão de genes pode ter consequências importantes para a função da célula levou ao desenvolvimento de diversas técnicas para visualizar os transcritos de ARN individuais em células vivas individuais. Uma técnica promissor que tem sido recentemente descrito utiliza uma sonda baseada no oligonucleótido óptico, raciométrica baliza bimolecular (RBMB), para detectar transcritos de ARN que foram modificados para conter, pelo menos, quatro repetições em tandem da sequência alvo RBMB na região 3 &#39;não traduzida. RBMBs são especificamente concebidos para emitir um sinal fluorescente brilhante após hibridação com o ARN complementar, mas caso contrário, permanecer extinta. O uso de uma sonda sintética nesta abordagem permite fotoestável, vermelho-deslocado, e corantes orgânicos altamente emissiva para ser usado para imagiologia. A ligação de vários RBMBs para os transcritos de ARN modificadas resulta em manchas discretas de fluorescência quando visto sob um microscópio de fluorescência de campo amplo. Por conseguinte, o movimento de transcritos de ARN individuais podem ser facilmente visualizados em tempo real pelo tempo de tomar uma série de imagens fluorescentes. Aqui descreve-se a preparação e purificação de RBMBs, entrega em células de formação de microporos e vive-célula imagiologia de transcritos de ARN.

Pouco tempo após a formação de microporos de células HT1080 na presença de RBMBs, os transcritos de ARN individuais que foram modificados para conter vários locais de ligação RBMB no seu 3&#39;-UTR aparecem como manchas fluorescentes brilhantes quando visualizados por microscopia de fluorescência de todo o campo (Figura 2). Enquanto transcrições de RNA individuais com sítios de ligação de apenas quatro RBMB podem ser visualizados em células vivas, mais sites na 3&#39;-UTR obrigatório RBM...

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K visualizações.  University of Pennsylvania.  Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real. 

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Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Biologia

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para a rotulagem transcritos em células individuais Escherichia coli para único-molécula fluorescência In Situ as experiências de hibridação

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondando cinética mRNA no espaço e no tempo em Escherichia coli usando fluorescência de molécula única de duas cores na hibridização situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Monitoramento em tempo real da aurora quinase Uma ativação usando biosensores de FRET conformacional em células vivas

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...